Mit Terminal-Transferase-vermittelten dUTP Assays Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) und Caspase 3/7 Maßnahme epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose
16. Mai 2018
Wir quantifizieren epidermalen Zelltod in Frösche mit Chytridiomykose mit zwei Methoden. Erstens verwenden wir terminal Transferase-vermittelten dUTP Nick Ende-Kennzeichnung (TUNEL) in Situ Histologie Unterschiede zwischen klinisch infizierten und nicht infizierten Tieren feststellen. Zweitens führen wir eine Zeitreihenanalyse der Apoptose über Infektion mit einem Caspase 3/7-Protein-Analyse.
Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Einfluss des Amphibienpilzerregers Batrachochytrium dendrobatidis auf die Apoptose und den Zelltod im epidermalen Gewebe von Fröschen zu beobachten. Diese Methode kann uns helfen, Wildtierkrankheiten zu verstehen, z. B. ob eine Infektion zum Zelltod führt oder ob es umgekehrt Immunmechanismen gegen Infektionen gibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie an kleinen Gewebebiopsieproben durchgeführt werden kann, so dass kleine Individuen im Verlauf der Infektion wiederholt beprobt werden können.
Um mit diesem Verfahren zu beginnen, bereiten Sie hydrophile Glasobjektträger mit Probengewebe vor, wie im Textprotokoll beschrieben. Um die Gewebeschnitte zu entparaffinisieren, waschen Sie die Objektträger dreimal mit Xylol für jeweils fünf Minuten in einem Coplin-Glas. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal für jeweils fünf Minuten mit 100 % Ethanol.
Waschen Sie danach die Objektträger jeweils drei Minuten lang mit 95 % Ethanol und 70 % Ethanol. Waschen Sie die Objektträger dann einmal fünf Minuten lang mit PBS. Zur Herstellung von experimentellen und negativen Kontrollobjektträgern wird das Gewebe vorbehandelt, indem Sie frisch verdünnte Proteinase K direkt zu den Objektträgern hinzufügen.
Inkubieren Sie die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur. Waschen Sie dann die Objektträger zweimal für jeweils zwei Minuten in PBS. Um Positivkontrollobjektträger herzustellen, behandeln Sie das Gewebe mit DN-Puffer vor und inkubieren Sie die Objektträger dann fünf Minuten lang bei Raumtemperatur.
Danach lösen Sie DNase eins in DN-Puffer auf eine Endkonzentration von 0,1 Mikrogramm pro Milliliter. Geben Sie die vorbereitete DNase-Lösung zu den Objektträgern. Inkubieren Sie die Objektträger 15 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Waschen Sie dann die Objektträger fünfmal für jeweils drei Minuten mit destilliertem Wasser in einem Coplin-Glas. Die Reaktion in 3%Wasserstoffperoxid in PBS fünf Minuten lang bei Raumtemperatur abschrecken. Waschen Sie anschließend die Objektträger zweimal für jeweils zwei Minuten in PBS.
Fügen Sie dann dem Gewebe auf den Objektträgern Gleichgewichtspuffer hinzu. 10 Sekunden bei Raumtemperatur inkubieren. Klopfen Sie dann die überschüssige Flüssigkeit um den Gewebeabschnitt herum ab.
Verdünnen Sie das terminale Desoxynukleotidyltransferase-Enzym in Reaktionspuffer. Geben Sie es dann zum Gewebe auf den Versuchs- und Positivkontrollobjektträgern. In einer befeuchteten Kammer eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius inkubieren.
Legen Sie danach die Objektträger in ein Coplin-Gefäß, in dem sich die Arbeitskonzentration des Stopppuffers befindet. 15 Sekunden lang umrühren und dann die Objektträger 10 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubieren. Waschen Sie dann die Objektträger dreimal jeweils eine Minute lang mit PBS und klopfen Sie die überschüssige Flüssigkeit ab.
Geben Sie anschließend das auf Raumtemperatur vorgewärmte Anti-Digoxigenin-Konjugat direkt auf das Gewebe. Inkubieren Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur in einer befeuchteten dunklen Kammer. Waschen Sie die Objektträger nach Abschluss der Inkubation viermal jeweils zwei Minuten lang mit PBS.
Klopfen Sie überschüssige Flüssigkeit ab. Fügen Sie dann den Folien ein Montagemedium hinzu. Geben Sie 15 Mikroliter DAPI-Lösung in das Eindeckmedium auf den Objektträgern.
Decken Sie jede Folie mit einem Deckglas ab und versiegeln Sie sie mit Nagellack. Lassen Sie die Dias im Dunkeln trocknen. Beobachten Sie die Objektträger unmittelbar nach Beendigung des Standvorgangs mit einem Fluoreszenzmikroskop.
Nehmen Sie 400 Mal in zufälligen Abständen Fotos entlang jedes Hautabschnitts auf. Zählen Sie DAPI-gefärbte blaue Blutkörperchen, um sicherzustellen, dass mindestens 100 Zellen pro Hautabschnitt und Tier sichtbar sind. Zählen Sie als nächstes die Anzahl der TUNEL-positiven Zellen, die als rote Einzelzellen mit klaren Zellrändern erscheinen.
Verwenden Sie zunächst ein inverses Lichtmikroskop in 40-facher Entfernung, um ein Foto von jedem der Zehen des Frosches zu machen. Zeichnen Sie Linien um die Kante des Zehenclips und verwenden Sie eine Imaging-Software, um den Bereich innerhalb der Form zu schätzen. Um die Oberfläche der dreidimensionalen Hautprobe zu bewerten, multiplizieren Sie die geschätzte Fläche mit Pi.
Um Proteine aus einer gefrorenen Froschzehenprobe zu extrahieren, geben Sie die Probe in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit Schraubverschluss, das 100 Mikroliter Probenpuffer und zwei Edelstahlkügelchen enthält. Verwenden Sie einen Rührer mit maximaler Geschwindigkeit, um die Zellen zu lysieren. Legen Sie danach das Rohr drei Minuten lang auf Eis.
Zentrifugieren Sie dann das Röhrchen, um den Überstand aufzufangen. Um den Caspase 3/7-Assay in einer 384-Well-Platte durchzuführen, fügen Sie 10 Mikroliter Probenpuffer als Blindprobe und 10 Mikroliter Proteinextrakt in dreifacher Ausfertigung hinzu. Pipettieren Sie dann 10 Mikroliter des im Handel erhältlichen Caspase 3/7-Reagenzes in den Proteinextrakt und öffnen Sie die leeren Vertiefungen.
Schütteln Sie dann die Platte 15 Sekunden lang vorsichtig, um die beiden Reagenzien zu mischen. Bei Raumtemperatur im Dunkeln 30 Minuten inkubieren. Verwenden Sie abschließend ein Lumineszenzplatten-Lesegerät, um die Lumineszenz der Probe zu messen.
In dieser Studie zeigten die infizierten Tiere im Vergleich zu Kontrolltieren signifikant mehr TUNEL-positive Zellen, was durch rot oder rosa gefärbte Zellen dargestellt wird. Bei Kontrolltieren gibt es nur wenige TUNEL-positive Zellen, die nicht in der Epidermis konzentriert sind. Bei infizierten Tieren sind die TUNEL-positiven Zellen häufiger in der Epidermis zu finden.
TUNEL-positive Zellen sind stärker an und direkt neben den Sichtweiten infizierter Zellen konzentriert. Außerdem gibt es weiter verbreitete TUNEL-positive Zellen über der Epidermis und in Epidermisschichten, die tiefer sind als dort, wo sich der Pilzerreger befand. Bei infizierten Tieren gibt es in allen drei Hauttypen mehr TUNEL-positive Zellen, mit einem besonders hohen Gehalt in der Oberschenkel- und Bauchhaut.
Im Caspase-Assay ist die Infektionsintensität positiv mit der Caspase-3/7-Aktivität korreliert. Darüber hinaus unterschied sich die Caspase-3/7-Aktivität bei infizierten und nicht infizierten Tieren im Laufe der Zeit. Die Caspase-3/7-Aktivität nahm innerhalb der ersten Wochen nach der Inokulation ab und stieg dann gegen Ende der siebten Woche bei infizierten Tieren an.
Die Caspase-3/7-Aktivität blieb bei nicht infizierten Personen konstant. Beim Versuch des Verfahrens für den TUNEL-Assay ist es wichtig, die Objektträger am selben Tag wie der Assay zu lesen, um einen Verlust der Empfindlichkeit zu vermeiden und die Objektträger an einem kühlen, dunklen Ort aufzubewahren, um die Farbstoffe zu schützen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Apoptose und Zelltod mit zwei verschiedenen Nachweismethoden in kleinen Gewebeproben wie Amphibienhaut nachgewiesen werden können.
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Übersicht
Diese Studie untersucht die Auswirkungen des amphibischen Pilzpathogens Batrachochytrium dendrobatidis auf Apoptose und Zelltod im epidermalen Gewebe von Fröschen. Mithilfe der TUNEL-in-situ-Histologie und der Analyse der Caspase-3/7-Proteine zielt die Forschung darauf ab, den Zusammenhang zwischen Infektion und Zelltod aufzuklären.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Neurowissenschaften
- Wildtierkrankheiten
- Zellbiologie
Hintergrund
- Chytridiomykose stellt eine erhebliche Bedrohung für Amphibienpopulationen dar.
- Das Verständnis der Mechanismen des Zelltods kann den Artenschutz unterstützen.
- Die Apoptose könnte eine Rolle bei der Reaktion auf Pilzinfektionen spielen.
- Kleine Gewebeproben ermöglichen eine wiederholte Analyse während des gesamten Infektionsverlaufs.
Zweck der Studie
- Quantifizierung des epidermalen Zelltods bei mit Chytridiomykose infizierten Fröschen.
- Bestimmung von Unterschieden in der Apoptose zwischen infizierten und nicht infizierten Fröschen.
- Analyse des zeitlichen Verlaufs der Apoptose während der Infektion.
Verwendete Methoden
- Terminaltransferase-vermittelte dUTP-Nick-End-Labeling (TUNEL) zur histologischen Analyse.
- Proteinanalyse von Caspase 3/7 zur zeitlichen Bewertung.
- Herstellung hydrophiler Objektträger mit Gewebeproben.
- Deparaffinisierung von Gewebeschnitten mittels Xylol- und Ethanolwäschen.
Hauptergebnisse
- Unterschiede in den Apoptoseraten wurden zwischen infizierten und nicht infizierten Fröschen beobachtet.
- Die Zeitreihenanalyse zeigte Trends beim Zelltod im Verlauf der Infektion auf.
- Die Methoden erwiesen sich als wirksam bei der Analyse kleiner Gewebeproben.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten zum Verständnis der Immunantworten auf eine Infektion beitragen.
Schlussfolgerungen
- Die Studie liefert wertvolle Daten über die Auswirkungen der Chytridiomykose auf epidermale Froschzellen.
- Das Verständnis der Apoptose in diesem Zusammenhang könnte zur Entwicklung von Strategien zum Schutz wildlebender Tiere beitragen.
- Zukünftige Forschungsarbeiten könnten die Immunmechanismen gegen Pilzinfektionen untersuchen.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Studie zeigt, wie Apoptose-Assays zur Bewertung von durch Krankheitserreger verursachten Gewebeschäden in Wildtier-Krankheitsmodellen eingesetzt werden können und einen Rahmen für die mechanistische Risikominderung bei der frühen Zielstruktur-Validierung bieten. Durch die Quantifizierung des epidermalen Zelltods bei mit Batrachochytrium dendrobatidis infizierten Fröschen unterstützt dieser Ansatz die Vorhersagegenauigkeit bei der Beurteilung von Wirt-Pathogen-Interaktionen und liefert Hinweise für die entdeckungsorientierte Identifizierung translationsrelevanter Biomarker. Die Verwendung kleiner Gewebeproben ermöglicht eine longitudinale Probennahme, die für die Verlaufsbeobachtung von Krankheiten und therapeutischen Interventionen in präklinischen Systemen entscheidend ist.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen, indem pathogeninduzierte Apoptose von Abwehrmechanismen des Wirts in epidermalem Gewebe unterschieden wird.
- Operativer Wert: Liefert räumlich aufgelöste Daten zum Zelltod mittels TUNEL-Färbung, um die Mechanismen der Gewebezerstörung in Infektionsmodellen zu klären.
- Prädiktiver Wert: Stärkt das Vertrauen in Zielstrukturen, indem die Aktivität von Caspase 3/7 mit dem Infektionsbefall über die Zeit korreliert wird, was Dosis-Wirkungs- und zeitliche Profilierungen ermöglicht.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Etabliert standardisierte Protokolle für den Nachweis von Apoptose in kleinen Gewebeproben und ermöglicht reproduzierbare Wirkstoff-Screenings unter Bedingungen mit begrenztem Material.
- Operativer Wert: Der Caspase-3/7-Assay bietet Kompatibilität mit Hochdurchsatzanalysen für Zeitreihenexperimente, während die TUNEL-Methode die räumlichen Apoptose-Muster validiert.
- Assay-Einsatzbereitschaft: Fluoreszenzmikroskopie und lumineszente Detektion erzeugen quantitative Ergebnisse, die für die Optimierung von Assays und die Reproduzierbarkeit zwischen Laboren geeignet sind.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Verbindet die epidermale Apoptose mit der Schwere der Erkrankung und unterstützt die Abstimmung von Biomarkern zwischen molekularen Messgrößen und dem klinischen Verlauf der Infektion.
- Operativer Wert: Ermöglicht risikoadjustierte Entscheidungen über die Weiterentwicklung durch die Verfolgung der Caspase-3/7-Dynamik über verschiedene Infektionsstadien hinweg in Längsschnittstudien.
- Translationale Kohärenz: Zeigt, wie histologische und biochemische Apoptose-Assays kombiniert werden können, um die präklinische Validität in Modellen infektiöser Krankheiten zu stärken.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode integriert sich in frühe Entdeckungsworkflows, indem sie Apoptose-Auslesesignale bereitstellt, die zur Zielvalidierung und Leitstrukturfidentifizierung beitragen, insbesondere in Studien, bei denen die Gewebezugänglichkeit die konventionelle Histologie einschränkt.
- Entdeckungsbiologie: Ermöglicht die Hypothesenprüfung, ob eine Pathogenexposition die Apoptose im Wirtsgewebe induziert oder unterdrückt, und klärt die Mechanismen der Gewebeschädigung auf.
- Screening: Der Caspase-3/7-Assay ermöglicht ein skalierbares, quantitatives Screening von Modulatoren, die die Apoptose in kleinen Biopsieproben beeinflussen.
- Analytik: Lumineszente und fluoreszierende Signale liefern quantifizierbare, normalisierte Messwerte zum Vergleich der Apoptose unter verschiedenen Bedingungen und zu verschiedenen Zeitpunkten.
- Translationale Forschung: Korreliert die molekulare Apoptoseaktivität mit histopathologischen Veränderungen und unterstützt die Qualifizierung von Biomarkern in präklinischen Modellen.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Der kombinierte TUNEL- und Caspase-3/7-Ansatz etabliert eine wiederverwendbare Plattform zur Profilierung der Apoptose für Infektionskrankheiten- und Toxikologiestudien.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem Apoptose-Lokalisation und -kinetik in infiziertem versus Kontrollgewebe unterschieden werden.
- Operativer Wert: Standardisierte Protokolle zur Objektträgerpräparation und Bildgebung gewährleisten Reproduzierbarkeit über verschiedene Labore und Probenchargen hinweg.
- Strategischer Wert: Ermöglicht frühere Go/No-Go-Entscheidungen, indem frühe Biomarker für Gewebestress und pathogene Wirkung bereitgestellt werden.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikobasierte Priorisierung von Zielstrukturen, indem Apoptose als funktioneller Endpunkt des Krankheitsmechanismus quantifiziert wird.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in Histologie, Fluoreszenzmikroskopie und Proteinextraktion aus begrenzten Gewebeproben.
- Setzt den Zugang zu einem Kryostaten, einem Fluoreszenzmikroskop und einem lumineszenten Plattenreader für TUNEL- und Caspase-3/7-Assays voraus.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen verschiedenen Anwendern hinsichtlich Gewebeschnittführung, Färbungsdauer und Bildaufnahmeeinstellungen, um die Empfindlichkeit des Assays aufrechtzuerhalten.
- Die Übertragung auf andere Modellsysteme erfordert die Validierung des Antikörperpenetrationsvermögens und des Enzymzugangs in unterschiedlichen Gewebetypen.
- Praktische Einschränkung: Kleine Biopsien der Zehenspitzen beschränken die Proteinausbeute und erfordern alternative Normalisierungsmethoden, wie beispielsweise die Schätzung der Hautoberfläche mittels Bildgebung, um den Verbrauch des Extrakts zu vermeiden.
