Mikrofluidische Plattform für längs-Imaging in Caenorhabditis elegans

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, dynamische Prozesse in adulten Nematoden unter kontrollierten Umweltbedingungen longitudinal abzubilden, um die Verhaltensreaktionen von Würmern und die Kinetik der Wurmgenexpression zu verfolgen. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen darüber zu beantworten, wie sich Tiere an Veränderungen in ihrer Umwelt anpassen, einschließlich Unterschieden in den Kernverhaltensweisen, der Genexpression, dem Gedächtnis und dem Lernen. Diese Technik ermöglicht die Multiplex-Längsschnittbeobachtung einzelner Tiere unter dynamisch kontrollierten Umgebungen sowie die gleichzeitige Probenahme mehrerer Aspekte der Anpassung mit hoher Auflösung.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auf ein quantitatives Verständnis der Anpassung von Tieren, da die Erfassung hochpräziser kinetischer Daten die mathematische Modellierung und die Formulierung und Überprüfung komplexer Hypothesen erleichtern kann. Um das Gerät für den Eingriff einzurichten, verbinden Sie zunächst die Auslassspritzenspitze mit einem 50 Zentimeter großen Stück Spritzenschlauch. Um eine Adapternadel herzustellen, ziehen Sie mit einer Zange den Nadelschaft aus der Nadelnabe einer 20 Gauge x einen halben Zoll großen Nadel und verwenden Sie einen Bunsenbrenner, um die restlichen Kunststoffreste zu entfernen.

Halten Sie beide Enden der Nadel mit einer Zange fest, biegen Sie die Adapternadel entsprechend der Geometrie des Versuchsaufbaus und stecken Sie die Nadel zur Hälfte in das andere Ende des Auslassspritzenrohrs. Verbinden Sie als Nächstes eine Spritzenspitze mit Puffereinlass direkt mit einem Dreiwegeventil und verbinden Sie eine Spritze mit Puffereinlass mit einem ein Meter langen Stück Spritzenschlauch. Führen Sie die Adapternadel halb in das offene Ende des Schlauchs ein und verbinden Sie die Pufferwechselspritze über die Spritzenspitze mit einem 50 Zentimeter großen Stück Spritzenschlauch.

Verbinden Sie den Spritzenschlauch mit dem verbleibenden Anschluss des Dreiwegeventils und schließen Sie das Ventil. Verbinden Sie die Schneckeneinlaufspritze mit einer Adapternadel mit einem ein Meter langen Stück Spritzenschlauch, wie gerade gezeigt. Spülen Sie dann alle Materialien zweimal mit S-Medium und füllen Sie die gespülten Spritzen und Schläuche mit frischem S-Medium, wobei Sie darauf achten, dass alle Luftblasen entfernt werden.

Verbinden Sie nun den Auslassspritzenschlauch mit dem Geräteauslass und stecken Sie die Adapternadel am Ende des Auslassspritzenschlauchs in den Auslassanschluss. Injizieren Sie eine kleine Menge S-Medium durch den Auslass, um das Gerät zu füllen, bis S-Medium sowohl aus dem Puffer als auch aus den Schneckeneinlässen austritt. Verbinden Sie das Injektionsrohr des Puffereinlasses mit dem Puffereinlassanschluss des Geräts und verschließen Sie den Schneckeneinlass mit einem Passstift aus Edelstahl mit einem Durchmesser von eins und zweiunddreißig Zoll.

Montieren Sie das mikrofluidische Gerät auf ein inverses Fluoreszenzmikroskop mit einem motorisierten Tisch und kleben Sie eine Spritzenpumpe an einen Schüttler in der Nähe des Mikroskops, damit die Pumpe beim Schütteln nicht wackelt. Laden Sie dann die Puffereinlassspritze auf die Spritzenpumpe und stellen Sie die Pumpe so ein, dass sie einen kontinuierlichen Durchfluss von S-Medium mit einer Durchflussrate von drei Mikrolitern pro Minute in das Gerät abgibt. Um die Bakterien in das mikrofluidische Gerät zu laden, laden Sie zuerst eine neue Spritze mit einer Suspension von E.coli OP50 hoher Dichte.

Drehen Sie die Spritze vertikal und klopfen Sie mehrmals auf den Zylinder, um alle Luftblasen an der Oberseite der Spritze zu sammeln. Schalten Sie den Orbitalschüttler aus und schließen Sie das Dreiwegeventil der Puffereinlassspritzen. Ersetzen Sie die Puffereinlassspritze durch die mit Bakterien beladene Spritze und drücken Sie die gesamte an der Oberseite der Spritze gesammelte Luft heraus, bis ein kleiner Teil der Bakteriensuspension in das Pufferwechselsystem gelangt und keine Blasen mehr in der mit OP50 beladenen Spritze oder dem Ventil verbleiben.

Schließen Sie bei geschlossenem Ventil die bakterienbeladene Spritze an die Spritzenpumpe an und schalten Sie den Orbitalschüttler ein. Stellen Sie die Schüttelgeschwindigkeit auf ca. 200 U/min und die Durchflussmenge auf 100 Mikroliter pro Minute ein. Sobald sich der OP50-Puffer im gesamten Gerät verteilt hat, stellen Sie die Durchflussmenge wieder auf drei Mikroliter pro Minute ein.

Um das Gerät mit Nematoden zu beladen, füllen Sie zunächst ein 650-Mikroliter-Mikrozentrifugenröhrchen mit geringer Bindung mit 100 Mikrolitern frischer OP50-Suspension und übertragen Sie mit einem Wurmpickel einzeln 20 bis 30 alterssynchronisierte junge adulte Würmer von einer Nematodenwachstumsmedium-Agarplatte in das Röhrchen. Füllen Sie die Wurmeinlaufspritze und das Spritzenröhrchen mit frischer OP50-Suspension und injizieren Sie ca. 500 Mikroliter Suspension in das Mikrozentrifugenröhrchen. Ziehen Sie dann die Wurmsuspension in das Schneckeneinlassspritzenrohr und verbinden Sie die Wurmeinlassspritze mit dem Wurmeinlass

Injizieren Sie alle Würmer durch das Spritzenrohr des Wurmeinlaufs in das mikrofluidische Gerät und trennen Sie die Wurmeinlaufspritze und den Spritzenschlauch. Stecken Sie den Schneckeneinlass mit einem Stift ein und lösen Sie die Puffereinlassspritze von der mechanischen Pumpe. Verwenden Sie die Puffereinlassspritze, um die Würmer manuell in die Kanäle zu bewegen, und die Auslassspritze, um die Wurmbewegung bei Bedarf umzukehren.

Das Verladen der Tiere erfordert etwas Koordination. Drücken Sie leicht auf die Spritzenkolben, um sie mit dem Kanal auszurichten, und drücken Sie etwas stärker, um den Wurm ganz hinein zu treiben. Lassen Sie die Würmer dann zwei bis drei Stunden lang an ihre neue Umgebung gewöhnen, bevor Sie mit einem Experiment beginnen.

Die Würmer sind auf ihre Kanäle beschränkt, aber sie sind nicht bewegungsunfähig. Die meisten Würmer bleiben für die Dauer des Experiments in ihren Kanälen, aber einige können entkommen oder sich in den Mikrorissen verfangen. Hier können Hellfeldbilder eines einzelnen, repräsentativen Wurms über einen Zeitraum von zehn Stunden im Gerät beobachtet werden.

Unter Verwendung von transgenen Würmern, die GFP unter dem Promotor des Immunantwortgens One exprimieren, wird bei einer P.Aeruginosa, PA14-Infektion die GFP-Expression im Mittelkörper und im Schwanz des Wurms in den ersten fünf Stunden der Exposition gegenüber dem Erreger beobachtet und steigt in den nächsten fünf Stunden zu einer robusten Ganzkörperexpression an. Die Darstellung der Gesamtfluoreszenz jedes Wurms als Funktion der Zeit nach der Infektion veranschaulicht die Dynamik der Immunantwort, die Induktion des ersten Gens sowie die Variabilität von Wurm zu Wurm in Bezug auf den Zeitpunkt und das Ausmaß der Induktion. Die Zeitrafferbildgebung der von den Würmern in jedem Kanal gelegten Eier ermöglicht die Darstellung der kumulativen Anzahl der von jedem Wurm gelegten Eier in Abhängigkeit von der Zeit nach der Infektion und erfasst die Variabilität von Tier zu Tier sowie den durch Krankheitserreger induzierten Rückgang der Eiablage im Verlauf der Infektion.

Einmal beherrscht, kann das mikrofluidische Gerät in einer Stunde vorbereitet und geladen werden. Sobald das Gerät geladen und die Würmer akklimatisiert sind, können den Würmern andere Reagenzien wie spezifische Medikamente oder chemische Signale von Interesse zugeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Kontrolle neuronaler und genetischer Systeme von Nematoden zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung nutzten wir und unsere Mitarbeiter diese Technik, um das Fressverhalten von Nematoden sowie die genetischen Reaktionen von Würmern auf Hitzeschockinfektionen und Hunger in einer Vielzahl von Umgebungen zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein mikrofluidisches Gerät verwenden, um Längsschnittaufsätze durchzuführen.