Elektrisch leitfähige Gerüst zu modulieren und Stammzellen liefern

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, eine Plattform für die in vitro elektrische Stimulation von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymergerüst mit anschließender in vivo Implantation zu schaffen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in der Schlaganfallforschung und Stammzellbiologie zu beantworten, indem sie die Möglichkeit bietet, Stammzellen zu modulieren. Der Hauptvorteil besteht darin, dass die Stammzellen in vitro optimiert und anschließend implantiert werden können.

Obwohl diese Methode einen Einblick in die Schlaganfall-Genesung geben kann, kann sie auch auf andere Systeme als neue Zellverabreichungsmethode angewendet werden. Im Allgemeinen werden Benutzer, die neu in dieser Technik sind, aufgrund der Präzision, die für den Zusammenbau der Zellkammer erforderlich ist, und der Technik, die mit der Kraniektomie verbunden ist, Schwierigkeiten haben. Zur Vorbereitung autoklavieren Sie die 2,5 x 12,5 Zentimeter großen Metallplatten und die Durchflussbeschleuniger.

Schneiden Sie anschließend mit einem Kammerschlitten als Schablone zwei Stücke PDMS aus. Ein Stück dient als Umriss des Umfangs der Kammer. Schneide am zweiten Stück zwei nebeneinander liegende Stücke aus der Innenseite des Kammerschiebers aus.

Beide Teile sollten rechteckig sein und zum Kammerschlitten passen. Schichten Sie nun die Materialien. Beginnen Sie mit der Metallplatte, dann mit dem ungeschnittenen PDMS, dann mit der Polypyrrolplatte, die senkrecht ausgerichtet ist, dann mit dem PDMS mit Aussparungen und schließlich mit der Zellkammer.

Richten Sie die Schichten sorgfältig aus und klemmen Sie das Gerät zusammen. Schneiden Sie als Nächstes zwei Längen eines Metalldrahts ab, der sich vom Gerät bis zur Außenseite des Inkubators erstreckt, in dem er sich befindet. 60 Zentimeter Länge sind in der Regel lang genug.

Befestigen Sie als Nächstes mit Silberpaste einen Draht an jedem Ende der Polypyrrolplatte, der aus der Außenseite der Kammer herausragt. Sobald die Silberpaste ausgehärtet ist, verstärken und versiegeln Sie die Verbindungen mit einem Epoxidharz. Erfassen Sie nun den Widerstand in der gesamten Baugruppe mit einem Multimeter.

Das angewendete Feld muss in jeder Kammer gleich sein. Als nächstes plattieren Sie die Zellen auf die Baugruppe und stimulieren sie elektrisch, wie im Textprotokoll beschrieben. Entfernen Sie vor dem Implantieren der Zellen die Drähte aus der Baugruppe.

Lösen Sie dann die Zellkammern und trennen Sie das PDMS vom leitfähigen Gerüst. Das Gerüst ist nun bereit für die Implantation. Geben Sie dem betroffenen Tier einen Tag vor der Operation Ampicillin in sein Trinkwasser.

Am Tag der Operation betäuben Sie die Ratte mit Isofluran und bestätigen Sie die Anästhesie mit einem Zehenkneifen. Tragen Sie nun künstliche Tränen auf die Augen der Ratte auf, um sie feucht zu halten. Nachdem Sie den Schädel rasiert haben, drapieren Sie das Tier und bereiten Sie es für eine sterile Operation vor.

Tragen Sie Schutzkleidung, packen Sie die sterilisierten Werkzeuge aus und sterilisieren Sie die Kopfhaut. Für die Kraniektomie bohren Sie ein Loch oberhalb der linken Rinde bis zur Dura mater. Machen Sie die Öffnung etwas größer als 1 x 3 Millimeter, die Größe des Implantats.

Öffnen Sie dann die Dura und entfernen Sie die Dura mater mit einer mikrodünnen chirurgischen Nadel aus dem Gehirn. Nehmen Sie das Rig aus dem TC-Kultur-Inkubator und deaktivieren Sie die Rigs. Implantieren Sie anschließend vorsichtig das leitfähige Gerüst aus dem In-vitro-System auf die Rattenrinde.

Decken Sie dann das Implantat mit Surgicel ab, um es zu sichern, da es sich sonst während des Hautverschlusses bewegen kann. Nähen Sie nun die Wunde mit einer 4-0-Seidennaht zu. Nach Abschluss der Nähte injizieren Sie den Ratten subkutan Buprenorphin SR. Setze die Ratte dann in einen Aufwachkäfig, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt.

Der postoperative Eingriff ist im Textprotokoll detailliert beschrieben. Menschliche neurale Vorläuferzellen wurden einer elektrischen Stimulation ausgesetzt und dann mit Zellviabilitätsassays gefärbt. Die grüne Farbe deutet auf eine lebende Zelle hin.

Die Zellen waren offensichtlich in der Lage, die elektrische Stimulation zu überleben. Faktoren, die von den Neuro-Vorläuferzellen freigesetzt werden und für die Genesung nach einem Schlaganfall wichtig sind, wurden anhand eines Mikrogramms Gesamt-RNA mittels quantitativer RTPCR bewertet. Nach der Normalisierung der Ergebnisse mit der Delta-Delta-Zyklus-Schwellenmethode zeigen sie, dass die Exposition gegenüber elektrischer Stimulation die BDNF- und THBS1-Expression hochreguliert hat.

Nachdem Sie sich dieses Verfahren angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ein Zellkultursystem für elektrisch leitende Stammzellen erstellt und diese Stammzellen anschließend in ein Rattenmodell implantiert. Sobald es gemeistert ist, kann das Verfahren in 45 Minuten durchgeführt werden, wenn es richtig durchgeführt wird. Während Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, die Tiere immer auf das richtige Atemmuster und die richtige Membranfarbe zu überwachen, um eine ordnungsgemäße Anästhesie zu gewährleisten.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Ratten und Stammzellen gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Tragen geeigneter PSA, immer getroffen werden sollten.