Synthese von Multi-walled Carbonnanotubes mit Silber-Nanopartikeln und Bewertung ihrer antibakteriellen Aktivitäten und zytotoxische Eigenschaften modifiziert

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, antibakterielle Nanokomplexe herzustellen, die aus Kohlenstoffnanoröhren bestehen, wobei Silbernanopartikel auf den Oberflächen der Nanoröhren synthetisiert werden. Diese Methode kann bei der Entwicklung neuartiger bakterieller Nanomaterialien eingesetzt werden, die eine geringe Toxizität für den Menschen aufweisen und gleichzeitig starke septische Eigenschaften für verschiedene Arten von Bakterien und Biofilmen aufweisen. Das Protokoll beschreibt die Bewertung von Nanokomplexen bei der Ausrottung von Bakterien unter Beibehaltung ihrer Biovergleichbarkeit mit dem Menschen.

Zu Beginn des Verfahrens geben Sie 30 bis 50 Milligramm MWCNTs in ein 50-Milliliter-Fläschchen. Mit einer Mikropipette, die mit Ein-Milliliter-Pipettenspitzen ausgestattet ist, geben Sie langsam acht Milliliter einer Drei-zu-Eins-Volumenlösung aus Schwefelsäure und Salpetersäure zu den MWCNTs. Warten Sie 30 Minuten, bis die exotherme Reaktion abgeschlossen ist, und beschallen Sie dann die Lösung bei 60 bis 80 Grad Celsius und 160 Watt, bis sich die MWCNTs am Boden des Fläschchens absetzen. was in der Regel etwa eine Stunde dauert.

Gib die Mischung in ein Zentrifugenröhrchen. Verwenden Sie eine Mikropipette, um vorsichtig 30 Milliliter destilliertes Wasser tropfenweise zu den mit Carbonsäure funktionalisierten MWCNTs hinzuzufügen, und pausieren Sie, um die Mischung bei Bedarf abkühlen zu lassen. Dann zentrifugieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 12.000 g.

Entfernen Sie den Überstand mit einer Pipette, die mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ausgestattet ist. Geben Sie fünf Milliliter Ethanol zum Feststoff und spülen Sie die Wände des Fläschchens mit zusätzlichem Ethanol aus. Zentrifugieren Sie das Gemisch erneut mit den gleichen Einstellungen und überprüfen Sie den pH-Wert des Überstands mit pH-Papier.

Fahren Sie mit dem Waschen der Feststoffe durch Zentrifugieren in Ethanol fort, bis der pH-Wert des Überstands neutral ist, entfernen Sie dann den Überstand und fügen Sie dem Niederschlag einen Milliliter destilliertes Wasser hinzu. Dispergieren Sie die mit Carbonsäure funktionalisierten MWCNTs im Wasser und gefriertrocknen Sie die Dispersion bei minus 60 Grad Celsius unter Vakuum. 10 Milligramm gefriergetrocknete, mit Carbonsäure funktionalisierte MWCNTs werden in ein konisches 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen gegeben.

Geben Sie 30 Milliliter destilliertes Wasser in das Röhrchen. Kombinieren Sie sechs Milliliter 0,1 normales Silbernitrat und 18 Milliliter destilliertes Wasser in einem weiteren konischen 50-Milliliter-Röhrchen. Beschallen Sie beide Mischungen bei 60 Grad Celsius und 160 Watt für eine Stunde.

Während die MWCNT-Dispersion noch bei 60 Grad Celsius und 160 Watt beschallt wird, wird die Silbernitratlösung mit einer Pipette, die mit einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze ausgestattet ist, tropfenweise zur MWCNT-Dispersion gegeben. Sobald die Zugabe abgeschlossen ist, wird die Mischung eine Stunde lang mit Ultraschall beschallt, dann wird die Mischung 15 Minuten lang bei 12.000 g bei Raumtemperatur zentrifugiert und der Überstand entfernt. Dispergieren Sie die Silber-MWCNTs in 30 Millilitern destilliertem Wasser durch Beschallung bei 24 Grad Celsius für 30 Minuten.

Die Zentrifugation in 30 Millilitern destilliertem Wasser wiederholen und den Überstand zweimal entfernen. Als nächstes dispergieren Sie die gewaschenen Silber-MWCNTs in einem Milliliter destilliertem Wasser durch Ultraschall für fünf Minuten. Geben Sie fünf Milliliter Ethanol in die Dispersion und rühren Sie die Mischung eine Stunde lang bei Raumtemperatur.

Dann zentrifugieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 12.000 g bei Raumtemperatur und überprüfen Sie den pH-Wert des Überstands. Entfernen Sie den Überstand und dispergieren Sie das Gemisch durch Vortexen wieder in fünf Millilitern Ethanol. Den Niederschlag durch Zentrifugation weiter in Ethanol waschen, bis der pH-Wert des Überstands neutral ist.

Zum Schluss dispergieren Sie die gewaschenen Silber-MWCNTs in einem Milliliter destilliertem Wasser. Die Dispersion bei minus 70 Grad Celsius unter Vakuum 24 Stunden lang gefriertrocknen und in einem verschlossenen Behälter aufbewahren. Um mit der Vorbereitung des Tests zu beginnen, mischen und autoklavieren Sie 18,12 Gramm R2A-Agar und einen Liter destilliertes Wasser.

Lassen Sie das Gel bei Raumtemperatur abkühlen. Wenn das Gel zum Ausgießen bereit ist, geben Sie 10 Milliliter Gel in 90-Millimeter-Petrischalen und lassen Sie den Agar aushärten. Verwenden Sie in einem Abzug eine Schlaufe und eine Nadel, die in einer Alkoholflamme sterilisiert wurden, um 100 Mikroliter eines Methylobacterium-Speziesgemisches auf die Oberfläche des Nährmediums zu streuen.

Inkubieren Sie die Gerichte 48 Stunden lang bei 30 Grad Celsius, mischen Sie dann 3,12 Gramm R2A-Brühe mit einem Liter destilliertem Wasser und autoklavieren Sie das Medium bei 121 Grad Celsius für 15 Minuten. Verwenden Sie eine sterilisierte Schlaufe und eine Nadel, um die Kolonien auf das R2A-Wachstumsmedium zu übertragen. Inkubieren Sie die Probe in einem Schüttelinkubator bei 30 Grad Celsius und 180 U/min.

Messen Sie die optische Dichte bei 600 Nanometern pro Stunde, bis die optische Dichte größer als 0,7 ist. Bereiten Sie als Nächstes eine weitere Petrischale mit 10 Millilitern R2A-Agar vor. Mischen Sie dann 3,12 Gramm R2A-Brühe und acht Gramm Agar mit einem Liter destilliertem Wasser.

Autoklavieren Sie die Mischung 15 Minuten lang bei 121 Grad Celsius. Mischen Sie 100 Mikroliter der Methylobacterium-Kultur in die Agarmischung. Gießen Sie 10 Milliliter des methylobacteriumhaltigen Gels über die untere Schicht des R2A-Agars in der Petrischale, und bereiten Sie dann eine Dispersion der gewünschten Konzentration von gefriergetrockneten Silber-MWCNTs in destilliertem Wasser vor.

Verwenden Sie eine Mikropipette, um 50 Mikroliter dieser Dispersion auf eine sechs x einen Millimeter große sterile Papierscheibe zu laden. Tragen Sie destilliertes Wasser zur Kontrolle auf eine andere sterile Papierscheibe auf. Trocknen und sterilisieren Sie beide Scheiben in einer Vakuumkammer unter UV-Licht für 30 Minuten.

Legen Sie dann die Silber-MWCNT-Probe und die Kontrolle auf den Agar und inkubieren Sie die Agarplatte bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden. Messen Sie die Hemmzone um die Silber-MWCNT-Probe, wenn Sie fertig sind. Vor dem Test wird dreifach destilliertes Wasser bei 121 Grad Celsius 15 Minuten lang autoklaviert.

Bereiten Sie in diesem sterilen Wasser eine Dispersion von 1000 Mikrogramm pro Milliliter von Carbonsäure-funktionalisierten MWCNTs und 50 Mikrogramm pro Milliliter, 40 Mikrogramm pro Milliliter und 30 Mikrogramm pro Milliliter von Silber-MWCNTs vor. Um mit dem antibakteriellen Testverfahren zu beginnen, bereiten Sie eine Methylobakteriumkultur wie zuvor beschrieben vor und überwachen Sie ihre optische Dichte bei 600 Nanometern. Wenn die optische Dichte maximal ist, inokulieren Sie 100 Mikroliter der Methylobakteriumkultur in drei Milliliter frisches R2A-Kulturmedium.

Geben Sie 500 Mikroliter dieser Lösung in jedes der fünf konischen 15-Milliliter-Röhrchen. Geben Sie 100 Mikroliter Methanol in eines der Röhrchen, um die Methanol-Referenzprobe vorzubereiten. Für jede der vier Dispersionen wird auf die gleiche Weise eine Probe vorbereitet.

Die Proben und die verbleibende Methylobakterium-Kontrollkultur werden bei 180 U/min und 30 Grad Celsius inkubiert, bis die optische Dichte der Kontrolle eine maximale Aktivität anzeigt. Verwenden Sie einen sterilisierten Spreader, um jede Probe auf festem R2A-Agar-Gel in Petrischalen zu verteilen. Inkubieren Sie die Gerichte bei 30 Grad Celsius für 48 Stunden.

Zählen Sie die resultierenden Bakterienkolonien und bestimmen Sie die minimale bakteriozide Konzentration. Silber-MWCNTs wurden mit dem beschriebenen Verfahren erfolgreich synthetisiert. Die durchschnittliche Größe der abgeschiedenen Silberpartikel betrug etwa 3,83 Nanometer.

Ein Methylobacterium-Wachstum wurde nicht beobachtet, wenn mit 50 Mikrogramm pro Milliliter oder 40 Mikrogramm pro Milliliter Dispersionen von Silber-MWCNTs kultiviert wurde. Die Bakterienpopulation wurde im Vergleich zur Kontrollprobe um das 100.000-fache reduziert, wenn sie mit einer Dispersion von Silber-MWCNTs von 30 Mikrogramm pro Milliliter kultiviert wurde. Eine Hemmzone wurde um eine Probe herum beobachtet, die aus einer Dispersion von 10 Mikrogramm pro Milliliter Silber-MWCNTs hergestellt wurde.

Bei einer Probe, die aus einer Dispersion von einem Mikrogramm pro Milliliter hergestellt wurde, wurde keine Hemmzone beobachtet. Eine gewisse Zytotoxizität wurde beobachtet, wenn eine Dispersion von 40 Mikrogramm pro Milliliter von Silber-MWCNTs hinzugefügt wurde. Es wurde keine signifikante Zytotoxizität beobachtet, wenn eine Dispersion von 30 Mikrogramm pro Milliliter hinzugefügt wurde.

Ein Trypanblau-Assay bestätigte, dass eine minimale Zytotoxizität auftrat, wenn eine Dispersion von 30 Mikrogramm pro Milliliter Silber-MWCNTs hinzugefügt wurde. Dieses Protokoll würde Forschern bei der Herstellung von Nanokomplexen helfen, die Metall-Nanopartikel enthalten, die direkt auf Kohlenstoff-Nanomaterialien wirken. Nach diesem Protokoll könnten die Forscher auch die antibakteriellen Eigenschaften der präparierten Nanokomplexe bewerten.