Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, eine natürliche orale Verabreichungsmethode zu demonstrieren. Für genspezifische dsRNAs, um RNA-Interferenz in vivo zu induzieren und Insektenschädlinge. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu beantworten, wie Biomoleküle in Insekten eingebracht werden können, die Wirkung von RNAi-basierten molekularen Biopestiziden aufzuklären und Insekten in der Umwelt zu kontrollieren.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Verabreichung durch Nukleinsäure-vermitteltes Gen-Silencing sowohl auf die Fütterung von Pflanzensaft als auch auf kauende Insekten angewendet werden kann. Die hier aufgeführten Methoden zeigen jedoch die Abgabe von doppelsträngiger RNA an hemipterische Schädlinge wie die Marmorierte Baumwanze, die Harlekinwanze und die Asiatische Zitrus-Psyllid. Sie können auf andere Insekten angewendet werden.

Um das Protokoll zu beginnen, wählen Sie die frühe 4. Instar Braun marmorierte Baumwanze oder BMSB-Nymphen aus, die aus der Eimasse geschlüpft sind, und hungern Sie sie 24 Stunden lang vor der dsRNA-Fütterung. Wählen Sie anschließend schlanke, zertifizierte grüne Bohnen aus kontrolliert biologischem Anbau aus und waschen Sie sie fünf Minuten lang mit 0,2%iger Natriumhypochloritlösung. Anschließend drei doppelt destillierte H2O-Waschgänge durchführen und die Bohnen an der Luft trocknen lassen.

Sobald sie trocken sind, schneidest du die grünen Bohnen vom Kelchende mit einer sauberen Rasierklinge auf eine Gesamtlänge von 7,5 Zentimetern ab. Tauchen Sie die gewaschenen und getrimmten grünen Bohnen in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen ohne Deckel, das 300 Mikroliter Kontrolllösung enthält. Verdünnen Sie die in vitro synthetisierten lac Z-, JHAMT- oder VGDSRNAs durch Verdünnung von 5 Mikrogramm oder 20 Mikrogramm und 300 Mikrolitern RNAs, DNAs-freiem Wasser, um Endkonzentrationen von 0,017 Mikrogramm pro Mikroliter bzw. 0,067 Mikrogramm pro Mikroliter zu erhalten.

Tauchen Sie die gewaschenen und getrimmten grünen Bohnen in ein zwei Milliliter Mikrozentrifugenröhrchen ohne Kappe, das 300 Mikroliter dsRNA-Lösung enthält. Die Ränder der Mikrozentrifugenröhrchen einwickeln und versiegeln und die eingetauchten Bohnen einschließen, um ein Verdampfen der dsRNA-Lösung zu verhindern und zu verhindern, dass die Tiere in das Mikrozentrifugenröhrchen gelangen. Positionieren Sie die Röhrchen drei Stunden lang aufrecht bei Raumtemperatur, damit die dsRNA-Lösung durch Kapillarwirkung in die grüne Bohne geladen werden kann.

Legen Sie die Röhrchen in saubere Kulturgefäße aus Polypropylen und legen Sie 3 ausgehungerte 4. Instar BMSB-Nymphen in die Kulturgefäße. Behandeln Sie drei Insekten pro Kulturgefäß. Jeweils drei grüne Bohnen mit grüner Lebensmittelfarbe oder dsRNA-Lösung.

Halten Sie die Insekten bei 25 Grad Celsius und 72 % relativer Luftfeuchtigkeit unter einem 16 l, 8 D Photoperiode in einem Inkubator. Lassen Sie die Insekten fünf Tage lang in dsRNA eingetauchte und absorbierte grüne Bohnen fressen und füllen Sie sie nach drei Tagen mit frischem Futter aus dsRNA-behandelten grünen Bohnen auf. Wählen Sie Pflanzen oder Setzlinge aus und gießen Sie sie zwei bis drei Tage vor der Verwendung nicht, damit die Erde austrocknet und feucht wird, aber nicht vollständig austrocknet.

Tragen Sie mit einer handgepumpten Sprühflasche 200 Milliliter dsRNA-Lösung auf das untere Blätterdach auf. Nehmen Sie nach 25 bis 40 Tagen Proben von zuvor gekappten Bäumen, indem Sie etwa 10 Blätter von den Spitzen von vier Zweigen sammeln. Extrahieren Sie die Gesamt-RNA und analysieren Sie sie mittels RT-PCR und qPCR auf das Vorhandensein des angewendeten dsRNA-Auslösers.

Sprühen Sie auf ähnliche Weise 10 Milliliter dsRNA topisch in den unteren Bereich eines Sämlings oder eines kleinen Topflaubs. Wählen Sie Pflanzen oder Setzlinge aus und gießen Sie sie zwei bis drei Tage vor der Verwendung nicht, um die Erde austrocknen zu lassen, um sie zu befeuchten, aber nicht vollständig zu trocknen. Geben Sie als Nächstes einen Liter dsRNA-Lösung in die Erde von großen Topfpflanzen.

Nach einer Stunde einen Liter Wasser hinzufügen. Tragen Sie 100 Milliliter dsRNA-Lösung auf den Boden von ein Meter hohen Topfbäumen in teilweise trockenen Böden auf. Lassen Sie die Pflanzen, die die dsRNA-Lösung als Drench in der Erde erhalten, 30 Minuten lang einweichen.

Tragen Sie dann eine reine Wasserbehandlung auf, um die Aufnahme durch die Wurzeln zu unterstützen. Wählen Sie Zitrussämlinge, neue oder etwa 3,5 Jahre alte Pflanzen aus, um dsRNA mit dem Stängelzapfen zu injizieren, der auch als Stamminjektionsmethode bekannt ist. Wickeln Sie die Kupferspitze jedes Injektors vier- bis sechsmal mit einem 0,6 Zentimeter breiten Streifen Deckenfolie ein, um ein Auslaufen in der Nähe der Spitze zu verhindern.

Füllen Sie als Nächstes die Injektoren des Baumstamms mit sechs Millilitern dsRNA-Lösung, verdünnt mit DNAs, RNAs-freiem Wasser. Bohren Sie mit einem 10-Milliliter-Bohrer Löcher in die Zitruspflanzen und achten Sie darauf, dass sie nicht länger als zwei Zentimeter oder etwa die Hälfte des Stieldurchmessers sind. Injizieren Sie dann die Lösung in den Baumstamm und lassen Sie den Injektor sechs bis 10 Stunden lang im Stamm, damit die dsRNA-Lösung absorbiert werden kann.

Lassen Sie die Insekten 3, 10 und 30 Tage nach der Behandlung von den Stecklingen der behandelten Bäume fressen. Gießen Sie 30 Gramm des Absorptionsmittels aus der Tonerde in ein konisches 50-Milliliter-Röhrchen bis zur 35-Milliliter-Markierung. Gießen Sie 20 Milliliter dsRNA-Lösung, verdünnt in DNAs, RNAs-freiem Wasser in das Röhrchen, um das gesamte Absorptionsmittel zu benetzen.

Verschließen Sie das konische Rohr, kippen Sie das Rohr, um Luft zu entfernen, und stellen Sie das Rohr aufrecht auf und lassen Sie es ein bis zwei Minuten stehen, während die Tonpartikel die Lösung absorbieren. Fügen Sie der Erdmischung genügend dsRNA-getränkten Ton hinzu, um einen Ein-Gallonen-Topf zu füllen. Mischen und wenden Sie die Erde von Hand, um den dsRNA-getränkten Ton gründlich in die Erde zu mischen.

Verwenden Sie die Erde, um die für die dsRNA-Behandlung ausgewählten Sämlinge umzutopfen. Gießen Sie den Boden nach 30 Minuten bis einer Stunde mit 200 Millilitern klarem Wasser, ohne dsRNA. Anschließend 100 Milliliter klares Wasser verwenden.

Stellen Sie die Pflanze nach 24 Stunden auf einen normalen Bewässerungsplan. Testen Sie jeden Monat vier bis sechs Blätter der behandelten Topfpflanzen mit Absorptionsmitteln aus Ton und dsRNA, nach der Behandlung auf dsRNA, indem Sie die apikalsten Blätter des neuen Pflanzenwachstums sammeln. Die QPCR von grünen Bohnensegmenten, die in in in vitro synthetisierte dsRNA getaucht wurden, die spezifisch für die braune marmorierte Baumwanze oder BMSB-mRNA ist, deutete auf eine erfolgreiche Induktion von RNAi hin, da die Expression der Ziele JHAMT und Vg in vivo signifikant reduziert war.

Diese Art der Verabreichung ist auch bei einem anderen hemipterischen Schädling, der Harlekinwanze, wirksam. Wie an ihren grün gefärbten Ausscheidungen zu erkennen ist. Nachdem Sie sich diese visuellen Demonstrationen angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie doppelsträngige RNA durch orale Einnahme an Insekten abgeben können, um RNAi-Insekten in vivo zu induzieren.

Die Fortschritte in der RNAi-Nuzölotidtechnologie erweitern weiterhin die Möglichkeiten der Forscher, die RNA-, Genexpression und Proteinspiegel in einer Vielzahl von lebenden Organismen zu modulieren. Das geht von Pflanzen über Insekten bis hin zu den schwierigsten Mikroorganismen. Während also die Produktionskosten von Doppelstrang-RNA weiter sinken und sich die Verabreichungsmethoden und die Stabilität weiter verbessern, wird die Zukunft der RNAi-Technologien weiterhin zur Lösung aufkommender, komplexer Probleme genutzt werden.