Name: Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 14 s
Description: Erfahren Sie eine orale dsRNA-Liefermethode zur RNA-Interferenz bei phloemsaugenden Hemipteren-Schädlingen. Diese Technik ermöglicht gezielte Gen-Silencing für nachhaltigen Pflanzenschutz.

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Die Autoren erkennen dankbar Donald Weber und Megan Herlihy (USDA, ARS Beltsville, MD) für die Bereitstellung von BMSB und HB für Experimente und Pflege der Kolonien; und Maria T. Gonzalez, Salvador P. Lopez, (USDA, ARS, Fort Pierce, FL) und Jackie L. Metz (Universität von Florida, Fort Pierce, FL) für Kolonie Wartung, Probenvorbereitung und Analysen.

(1) BMSB Aufzucht
<ol><li>Hintere BMSB Insekten gemäß standard-Lab-Praxis und zuvor beschriebenen63.</li>
	<li>ACP (D. Citri) Insekten auf Citrus Macrophylla in einem Gewächshaus (22 ° C) und natürliches Licht zu erhöhen. Verwenden Sie Erwachsene ACP, bei ca. 5-7 Tage post bewegungsapparate.</li>
</ol>2. Auswahl der Genregionen und In vitro- Synthese von dsRNA
<ol><li>Wählen Sie bestimmte Gene BMSB aus bereits veröffentlichten Transkriptom profile32.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass die Regionen von Interesse ausgewählt variieren zwischen 200 bis 500 Basenpaaren.</li>
	<li>Führen Sie die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) mit den Bedingungen beschrieben, um verbunden mit dem ausgewählten gen des Interesses aus genomischer DNA Fragmente zu generieren. Siehe Tabelle 1 für die Gen-spezifischen Oligonucleotides.<ol>
<li>PCR-Reaktion: In einem 0,25 mL PCR-Röhrchen, kombinieren Sie 5 µL 10 X PCR-Puffer, 4 µL dNTP Mischung (2,5 mM), 2 µL DNA-Vorlage (50 ng/µL), 2,5 µL der Primer 1 und 2 (10 µM), 0,25 µL DNA-Polymerase (5 U/µL) , und DNase/RNase frei Wasser bis zu 50 µL.</li>
		<li>PCR-Bedingung: Zyklus die PCR-Reaktion verstärken die Region von Interesse bei 95 ° C für 3 min, gefolgt von 30 Zyklen von 98 ° C für 10 s, 55 ° C für 30 s, 72° C für 1 min inkubieren die Reaktion bei 72 ° C für eine zusätzliche 10 min. Reinigen der PCR-Reaktion mit einer Reinigung-Kit.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die erhaltenen PCR-Fragmente weiter zu verstärken, mit Gen spezifische Primer flankiert von der T7 RNA-Polymerase-promotorsequenz (5'-GAA TTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG AGA-3') erwähnt als frühere62.</li>
	<li>Verwenden Sie für RNAi LacZ gen als Negativkontrolle (Mock). Hinweis: LacZ ist ein Gen, das β-Galaktosidase verstärkt aus Escherichiacoli genomischer DNA (die Primer verwendet, sind in Tabelle 1aufgeführt) kodiert.</li>
	<li>Führen Sie in Vitro Transkription DsRNA beschrieben früheren62nachzugeben.</li>
	<li>Lösen Sie auf und Aufschwemmen Sie der daraus resultierenden DsRNA in 150 µL DNase/RNase freies Wasser, Messen Sie die Konzentration und bei-80 ° C für eine spätere Verwendung zu speichern.</li>
</ol>3. Lieferung der DsRNA mit grünen Bohnen
<ol><li>Wählen Sie früh 4th Instar BMSB Larven geschlüpft aus demselben Ei-Masse und verhungern sie 24 Stunden vor der Fütterung DsRNA.</li>
	<li>Wählen Sie schlanke zertifizierten Bio grüne Bohnen (Phaseolus Vulgaris L.) und mit 0,2 % Natriumhypochlorit-Lösung für 5 min waschen. Hinweis: Schlanke grüne Bohnen wurden so gewählt, dass die Bohnen leicht in die 2 mL Mikrozentrifugenröhrchen untergebracht werden können.</li>
	<li>Mit DdH2O 3 Mal waschen und an der Luft trocknen.</li>
	<li>Schneiden Sie die grünen Bohnen aus dem Kelch Ende auf einer Länge von 7,5 cm mit einer sauberen Rasierklinge.</li>
	<li>Tauchen Sie die gewaschenen und geschnittenen grünen Bohnen in einen Cap-Less 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL Kontrolllösung (eine 01:10 Verdünnung der grüne Lebensmittelfarbe (Zutaten: Wasser, Propylenglykol, Fd & C gelb 5, Fd & C blau 1 und Propylparaben als Konservierungsmittel)).</li>
	<li>Machen Verdünnungen des in-Vitro synthetisiert LacZ, JHAMT oder Vg DsRNAs durch Verdünnung 5 µg oder 20 µg in 300 µL RNase/DNase freies Wasser Endkonzentrationen 0.017 µg/µL oder 0.067 µg/µL, bzw. zu liefern.</li>
	<li>Tauchen Sie die gewaschenen und geschnittenen grünen Bohnen in einen Cap-Less 2 mL Microcentrifuge Schlauch mit 300 µL DsRNA-Lösung (aus Schritt 3,6).</li>
	<li>Wickeln und die Schnittflächen an den Mikrozentrifugenröhrchen umschließt die eingetauchten Bohnen um Verdunstung der DsRNA Lösung zu vermeiden und zu verhindern, dass die Tiere in den Microcentrifuge Schlauch versiegeln.</li>
	<li>Positionieren Sie diese Rohre in einer aufrechten Weise bei Raumtemperatur für 3 h auf der DsRNA-Lösung in die grüne Bohnen durch Kapillarwirkung geladen werden können.</li>
	<li>Legen Sie diese Rohre in saubere Kulturgefäße (Polypropylen). Platz drei verhungert 4th Instar BMSB Nymphen in der Kulturgefäße.</li>
	<li>Behandeln Sie drei Tiere pro Kulturgefäß jeweils drei grüne Bohnen mit grüne Lebensmittel Färbung oder DsRNA Lösung. Halten Sie die Insekten bei 25 ° C und 72 % relativer Luftfeuchtigkeit, unter einem 16 L: 8 Photoperiode im Inkubator.</li>
	<li>Ermöglichen Sie die Insekten ernähren sich von den grünen Bohnen (eingetaucht und absorbiert mit DsRNA) für 5 Tage, aber mit frischen Diäten von DsRNA Behandlung grüne Perlen nach 3 Tagen wieder aufzufüllen.</li>
</ol>4. Echtzeit-Quantitative (qPCR) Analyse von Gen Ausdruck folgenden RNAi vermittelte Stummschaltung in BMSB
<ol><li>Messen Sie die Wirkung von RNAi auf die Höhe der Abschrift Expression von qPCR.</li>
	<li>Die gesamte-RNS von DsRNA behandelt Tiere zu isolieren und Synthese der cDNA-62.</li>
	<li>Richten Sie die qPCR-Reaktionen mit einer Echtzeit-PCR-System und die Primer in Tabelle 1aufgeführt. Verwenden Sie die folgenden qPCR Radsport Bedingung: 95 ° C für 10 min gefolgt von 40 Zyklen von 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, zusammen mit Dissoziation Schritt einschließlich 95 ° C für 15 s, 60 ° C für 1 min, 95 ° C für 15 s , und 60 ° C für 15 s.</li>
	<li>Die qPCR Standards: Verwenden Sie die serielle Verdünnung der cDNA aus total RNA isoliert von einem normalen Tier als Referenzstandard für die Quantifizierung vorbereitet.</li>
	<li>Verwenden Sie BMSB 18 s RNA als interner Standard für Unterschiede bei den RNA-Wiederherstellung von Gewebe32zu korrigieren.</li>
</ol>5. BLATTSPRÜHMITTEL Anwendung in großen Töpfen Zitrusbäumen und Sämlinge
Hinweis: Pflanzen Zitrusfrucht Sorte 'Carrizo' Citrange (Citrus Sinensis XPoncirus Trifoliata, Rutaceae), wurden gepflegt, in einem Gewächshaus unter natürlichem Licht und Temperatur, in 1,2 L Container angebaut. Die Pflanzen wurden ständig beschnitten, zur Förderung des Wachstums der neuen Blatt-Triebe, genannt "bündig". ACP lieber Futter und Eiablage auf die Neubildung von Zitrusfrüchten64.
<ol><li>Wählen Sie Pflanzen oder Sämlinge und nicht Wasser sie für ca. 2-3 Tage vor dem Gebrauch, den Boden zu feucht, aber nicht vollständig trocken trocknen zu lassen.</li>
	<li>Mit einer Hand-Pumpe-Sprühflasche 200 mL DsRNA-Lösung (0,5 mg/mL) zur unteren Kappe (Abb. 4A) anwenden. Hinweis: Bereiten Sie den oben genannten DsRNA Lösungen im DNase/RNase freies Wasser.</li>
	<li>Post-spray Anwendung, lassen Sie die angewandte DsRNA Lösung vollständig durch die Blätter aufgenommen werden. Hinweis: Zitrusbäume absorbiert die angewandte DsRNA, und dann Blätter aus entweder neues Wachstum oder Zweige, die vor der Anwendung abgedeckt wurden extrahiert wurden; die DsRNA war nachweisbar mit qPCR und systemischen Bewegung in der oberen Abdeckung baumblätter in 3-4 h44,45,46zeigte.</li>
	<li>Probieren Sie das neue Wachstum von zuvor gekrönt Bäumen, nach 25-40 Tage durch das Sammeln von etwa 10 von den Spitzen der vier Niederlassungen Blätter. Die gesamte-RNS zu extrahieren und zu analysieren durch reverse Transkription PCR (RT-PCR) und qPCR auf das Vorhandensein des Triggers angewandte DsRNA unter Verwendung der Zündkapseln in Tabelle 1 aufgeführten und beschriebenen Methoden46. Hinweis: Die Musterkollektion, total RNA Isolierung, RT-PCR und qPCR wurden wie zuvor beschrieben46durchgeführt.</li>
	<li>In ähnlicher Weise topisch Spritzen Sie 10 mL DsRNA auf den unteren Bereich des ein Sämling oder kleine Eingemachte Baum laub. Hinweis: Hemipteran Insekten (AKP-Staaten und GWSS) erhielten Fütterung Zugang normalerweise um 24 Uhr, post-Behandlungen auf neues Wachstum (Blätter), hatte nicht direkt besprüht oder die Wochen später wuchs, oder ganzen Pflanzen. Dies führte zu Insekten, welche positiv getestet für die DsRNA bei 3, 6 und 10 Tage post Fütterung.</li>
</ol>6. Boden/Root Drench Anwendung in großen oder kleinen Topfpflanzen, Zitrusbäumen und Setzlinge
<ol><li>Wählen Sie Pflanzen oder Sämlinge und sie nicht für 2-3 Tage vor dem Gebrauch, den Boden um zu feucht aber nicht Austrocknen lassen Wasser vollkommen trocken (es entsteht Luftraum um die flüssige Lösung angewendet werden zu halten).</li>
	<li>1 L DsRNA-Lösung (0,2 mg/mL) auf den Boden der großen Topfpflanzen (ca. 2,5 m) dazugeben Sie und 1 L Wasser (Chaser) nach 1 h.</li>
	<li>100 mL DsRNA Lösung (1,33 mg/mL) in den Boden 1 m hohe Topfpflanzen Bäume in teilweise trockenen Böden anwenden.</li>
	<li>Wenden Sie für kleine Sämlinge 10 mL DsRNA-Lösung (1 mg/mL an) auf den Boden in den Zapfen oder die nackten Wurzeln (Abbildung 4 b, C).</li>
	<li>Lassen Sie die Pflanzen, die als ein Boden durchnässen für 30 min Einweichen DsRNA-Lösung zu erhalten. Dann bewerben Sie schlicht nur Wasseraufbereitung um Absorption durch Wurzeln (20 mL für Pflanzen in gelben Container) oder 100 mL zu unterstützen, wenn größere Pflanzgefäße > 1 Gallone sind. Hinweis: Topisch applizierten DsRNA, Laub führte Erkennung bei den meisten distale Spitzen der Zweige innerhalb 3-6 h Post Behandlungen, systemische Bewegung durch Bäume zeigen. Neue Wachstumsbranchen DsRNA bei 60-90 Tage Post Behandlungen positiv getestet. Stecklinge sind Insekten (AKP-Staaten und GWSS) in einem DsRNA Fütterung Bioassay44zur Verfügung gestellt.</li>
</ol>7. Tippen (Baum-Stamm-Injection) Stammapplikation in großen Töpfen Zitrusbäumen und Sämlinge
<ol><li>Wählen Sie Zitrusfrüchte Pflanzgut, neu, oder etwa 3,5 Jahre alte Anlagen zum Einspritzen von DsRNA mit dem Stamm (Stamm Injektionen) Methode tippen.</li>
	<li>Bohren Sie Löcher in die Zitruspflanzen mit einer Bohrmaschine und einem 10 mm Bohrer, kümmert sich nicht um mehr als 2 cm oder etwa die Hälfte der Durchmesser des Stammes.</li>
	<li>Wickeln Sie die Kupfer Spitze jeder Einspritzdüse 4 - 6 Mal mit einem 0,6 cm (¼ Zoll) breiten Streifen des Versiegelns Film um nahe der Spitze auslaufen.</li>
	<li>Füllen Sie die Baum-Stamm-Injektoren mit 6 mL (1,7 mg/mL) DsRNA Lösung in DNase/RNase freies Wasser verdünnt (bezeichnet als farbige Lösung hier).</li>
	<li>Spritzen Sie die Lösung in den Stamm des Baumes und lassen Sie den Injektor in den Kofferraum für 6-10 h zur Absorption der DsRNA-Lösung ermöglichen. Die Insekten ernähren sich die Stecklinge von behandelten Bäume von 3, 10 und 30 Tage nach der Behandlung zu ermöglichen. Hinweis: Die DsRNA injiziert mit der Stamm-Injektion-Methode beibehalten in den Bäumen für einen Zeitraum von 30-60 Tage41,42,44. Validierung für RNAi wurde von qPCR unter Verwendung der Zündkapseln in Tabelle 1aufgeführten durchgeführt.</li>
</ol>8. DsRNA behandelt Tongranulat für Lieferung an Insekten durch Boden
<ol><li>Gießen Sie den Ton saugfähig in ein 50 mL konische Röhrchen bis 35 mL-Markierung (ca. 30 g Ton saugfähig) auf dem Schlauch.</li>
	<li>Gießen Sie 20 mL DsRNA Lösung verdünnt in DNase/RNase freies Wasser (100 µg/mL) in das Rohr, das Absorptionsmittel nass. Die konischen Röhrchen, Tipp die Röhre zur Beseitigung von Luft und das Röhrchen.</li>
	<li>Legen Sie das Rohr aufrecht und 1 – 2 min. für die tonteilchen absorbieren die Lösung stehen lassen.</li>
	<li>Fügen Sie genügend DsRNA-getränkten Ton in die Erdmischung, 1 Gallone Topf zu füllen.</li>
	<li>Mischen Sie und drehen Sie den Boden von hand, um der DsRNA-getränkten Ton in die Erde mischen.</li>
	<li>Verwenden Sie dieses Bodens, um Sämlinge ausgewählt für die Behandlung von DsRNA Umtopfen.</li>
	<li>Wasser den Boden mit 200 mL Leitungswasser ohne DsRNA. Nach 30 min bis 1 h mit 100 mL klarem Wasser folgen. Stellen Sie nach 24 h die Pflanze auf einem normalen Bewässerungsplan.</li>
	<li>Testen Sie 4-6 Blätter von den behandelten Topfpflanzen mit Lehm Absorptionsmittel und DsRNA jeden Monat nach der Behandlung für DsRNA sammeln die meisten apikalen Blätter der neuen Pflanzenwachstum. Hinweis: Pflanzen oder Stecklinge von diesen behandelten Pflanzen werden gefüttert, Insekten jederzeit nach 24 h nach der Behandlung und konnten bis zur Auslieferung RNAi für bis zu einem Jahr an Insekten (unveröffentlichte Daten).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

RNAi erweist sich ein wichtiges Instrument für die Erkundung von Gen biologische Funktion und Regulation, mit großem Potenzial für die Verwaltung von Schadinsekten19,68,69,70, genutzt werden 71. das Design und die Auswahl an eine geeignete ursächlich für eine bestimmten Insektenarten und die Art der Zustellung der entsprechenden DsRNA(s) auf das Insekt Stummsc...

Hemipteran Insekten umfassen einige der wirtschaftlich bedeutenden Schädlinge von Agriculturebecause Kräften zu erreichen hohe Bevölkerungswachstum und Krankheiten bei Pflanzen zu verbreiten. BMSB, H. Halys Stål, ist eine invasive Schädling, der versehentlich mit der ersten Sichtung in 19961berichtet in der westlichen Hemisphäre in Allentown, Pennsylvania aus Asien (China, Taiwan, Korea und Japan) eingeführt wurde. Seit seiner Einführung BMSB wurde in 43 Staaten mit den höchsten Bevölkerungen in der Mid-Atlantic (DE, MD, PA, NJ, VA, und WV) sowie in Kanada und Europa, erkannt und stellt eine potenzielle Bedrohung für die Landwirtschaft2. Als polyphag Schädling kann BMSB Schäden an rund 300 identifizierten Pflanze Gastgeber unter anderem hochwertige Kulturen wie Äpfel, Trauben, Zierpflanzen, Feldbestände, Sojabohnen und Mais einzuleiten. Schaden ist in erster Linie durch die Art der Fütterung, bekannt als Worte und bündig, wo das Tier durchdringt die Gastgeber-Ernte mit seinen nadelartigen Mandrin zu den Nährstoffen aus der Vascular Gewebe2,3zugreifen. BMSB ist auch einen indoor-Schädling wie sie Wohnsitz in Wohnbereichen wie Schulen finden können und im Herbst bis Winter2Häuser. Chemikalien und aeroallergene von BMSB veröffentlicht wurden illegale allergische Reaktion bei Frucht Ernte Arbeiter gemeldet. BMSB kann auch zu allergischen Erkrankung führt zu Kontaktdermatitis, Konjunktivitis und Rhinitis bei empfindlichen Personen4,5beitragen. Ein anderes hemipteran Insekt, ACP, D. Citri Teru (Hemiptera: Liviidae) ist eine schwere Pest von Zitrusfrüchten und überträgt die Phloem-limitierte Bakterien (Verbindung Liberibacter Asiaticus) Huanglongbing (HLB), besser bekannt als citrus Greening Krankheit6,7. HLB wurde erstmals berichtet, aus dem südlichen China und auf 40-verschiedener asiatischer, afrikanischer, ozeanischer, Süd- und nordamerikanischen Länder7ausgebreitet hat. Citrus Greening ist ein weltweites Problem mit bedrohlichen wirtschaftlichen und finanziellen Verluste durch den Verlust von Zitrusfrüchten; Management von ACP gilt daher von größter Bedeutung für die Vorbeugung und Bekämpfung von HLB.
Maßnahmen für eine effektive Kontrolle von diesen Schadinsekten erfordert in der Regel, dass die Anwendung von chemischen Pestiziden, die relativ kurz gelebt. Chemischen Insektiziden Kontrollstrategien oft fehlen sichere Umwelt-Management-Strategien oder Anfälligkeit durch Pestizid Widerstand in Pest Populationen8,9abgenommen haben. Daher die biologische Bekämpfung von Schädlingen mit molekularen Biopestizide ist eine mögliche Alternative, aber seine Verwendung weltweit bleibt bescheiden und verschiedene Arten von Parasitoide (z. B. Trisolcus Japonicus) können auch als natürliche biologische wirksam sein Kontrollen. RNAi ist eine neue Technologie für die Verwaltung von invasiver Schadinsekten mit molekularen Biopestizide10Potenzial. RNAi ist gut beschrieben gen Regelmechanismus, das ermöglicht die effektive posttranskritionelle gen-silencing der endogenen sowie Eindringen von DsRNAs in einer Sequenz-spezifische Art und Weise, die schließlich zu die Regulation der Genexpression in der mRNA führt Level11,12. Kurz, wenn exogene DsRNA in eine Zelle verinnerlicht ist, was sie von einem Mitglied der zweizähnigen Nuklease RNase III-Superfamilie zu SiRNAs verarbeitet wird, genannt Dicer, das evolutionär in Worms, fliegen, Pflanzen, Pilze und Säugetiere13, konserviert ist 14 , 15. diese 21-25 Nukleotide SiRNA Maisonetten sind dann abgewickelt und integriert im RNA-induced silencing Komplex (RISC) wie RNAs führen. Diese RISC-RNA-Komplex ermöglicht Watson-Crick-Basenpaarung zu den ergänzenden Zielen mRNA; Dies führt schließlich zur Spaltung durch das Argonaut-Protein, ein Multi Domain Protein enthält eine RNase H-ähnliche Domäne, die verschlechtert sich die entsprechende mRNA und Protein Übersetzung, was wiederum zu posttranskritionelle gen-silencing16 reduziert , 17 , 18.
RNAi für Pflanzenschutz erfordert die Einführung DsRNA in Vivo das Gen des Interesses, zum Schweigen zu bringen, damit Aktivierung des SiRNA-Weges. Verschiedene Methoden, die für die DsRNA Lieferung an Insekten und Insektenzellen verwendet wurden, um systemische RNAi induzieren gehören Fütterung10,19,20,21, Mikroinjektion22, Träger wie Liposomen einweichen 23und anderen Techniken-24. RNAi war erste gezeigt in Caenorhabditis Elegans , Unc-22 Genexpression durch Feuer zum Schweigen zu bringen und Mello25, gefolgt von Zuschlag im Ausdruck der frittierten Gene in Drosophila Melanogaster26. Funktionale ausgangsstudien genutzt Mikroinjektion DsRNA in Insekten, wie z. B. Apis Mellifera22,27, Acyrthosiphon Pisum28, Blattella Germanica29zu liefern, H. Halys30und Lepidoptera Insekten (rezensiert von Terenius Et al. 31). Mikroinjektion ist vorteilhaft, eine genaue und präzise Dosierung an den Ort von Interesse in das Insekt zu liefern. Wenn auch solche septischen Punktionen Expression immun Verwandte Gene durch Trauma32, daher seine Praxistauglichkeit in landwirtschaftlichen Biopestizide Entwicklung auszuschließen entlocken können.
Eine andere Methode der Bereitstellung von DsRNA in Vivo wird durch einweichen, was einschließt, Verschlucken oder Aufnahme von DsRNA durch Aussetzung der Tiere oder Zellen in der Regel im extrazellulären DsRNA-haltigem Medium. Einweichen wurde verwendet, um effizient induzieren RNAi in Drosophila S2 Gewebekultur Zellen hemmen Downstream von Raf1 (DSOR1) Mitogen-activated Protein Kinase-Kinase (MAPKK)20sowie in C. Elegans die zum Schweigen zu bringen POS-1 gen33. DsRNA geliefert mit Einweichen ist jedoch weniger effizient im Vergleich zu Mikroinjektion20RNAi induzieren. RNAi vermittelte Stummschaltung in Kauen Insekt wurde erstmals in der Maiswurzelbohrer (WCR) (Diabrotica Virgifera Virgifera) durch Infusion die DsRNA in eine künstliche Agar Diät10gezeigt. In früheren Berichten haben Methoden zur DsRNA infundiert in natürliche Ernährung speziell für Arthropoden34liefern zusammengefasst. Diese Lieferung Methoden waren weiter entschlossen, vergleichsweise effektiv sein, künstliche Mittel der Lieferung; wie der Fall von der Tsetse-Fliege (Glossina Morsitans Morsitans), wo gleich Knockdown von eine immunvermittelte gen beobachtet wurde als DsRNA entweder durch Blutmehl oder mikroinjiziert35geliefert wurde. Ähnlich, Lieferung von DsRNA durch Tröpfchen in leichte braune Apfel Motte (Epiphyas Postvittana)36, Diamondback Moth (Plutella Xylostella) Larven37sowie Honig Bienen38,39 effiziente RNAi induziert. Am effektivsten RNAi-Experimente in Hemipteran haben Injektion von DsRNA40 verwendet, weil mündliche Lieferung von DsRNA in hemipteran Insekten mühsam ist, da es durch die Wirtspflanze Vascular Gewebe geliefert werden muss. Effektive RNAi wurde auch in AKP-Staaten und glasig-winged Sharpshooter Leafhopper (GWSS), Homalodisca Vitripennisbeobachtet: DsRNA wurde durch Zitrusfrüchten und Weinreben, die in der Vascular Gewebe durch Wurzel durchnässen, Blatt-DsRNA absorbiert hatte geliefert Sprays, Stamm-Injektionen oder Absorption durch Stecklinge41,42,43,44,45,46. Dies führte auch zu das erste Patent für DsRNA gegen die AKP-Staaten (2016, uns 20170211082 A1). Lieferung von SiRNA und DsRNA mit Fluggesellschaften wie Nanopartikel und Liposomen vermittelt Stabilität und Erhöhungen der gelieferten DsRNA Wirksamkeit entstehen schnell23,47,48,49 ,50. Eine neue Klasse von Nanopartikel-basierte auslieferfahrzeuge für Nukleinsäuren für in Vitro und in Vivo , die speziell für therapeutische Anwendungen immenses Potential vermitteln können, wie geeignet Lieferung51Vektoren zusammengefasst wurde. Nanopartikel als Träger für DsRNA möglicherweise Nachteile einschließlich Löslichkeit, Hydrophobie oder begrenzte Bioakkumulation52, aber eine geeigneten Polymers Unterstützung Lieferung kann diese Nachteile zu kompensieren. Entwicklung und Nutzung von selbst liefern Nukleotiden entstehen auch genannt "antisense Oligonukleotide", die einzigen stranded RNA/DNA Duplex46sind.
Vitellogenesis in Arthropoden ist ein Schlüssel Prozess Steuerung Reproduktion und Juvenilhormon (JH) oder Ecdyson geregelt, die sind die wichtigsten Induktoren der Vg Synthese von Körperfett; Das Vg wird schließlich von der entwickelnden Eizelle über Vg Rezeptor-vermittelte Endozytose53aufgenommen. VG ist eine Gruppe von Polypeptiden synthetisiert Extraovarially, die wesentlich für die Entwicklung der großen Ei Eigelb Eiweiß, Vitellin54,55, und daher ist es wichtig bei der Fortpflanzung und Alterung56. VG hat erfolgreich zum Schweigen gebracht worden in Nematoden57 sowie in Honigbiene (Apis Mellifera) wo RNAi Erschöpfung der Vg vermittelte in Erwachsene und Eiern22beobachtet wurde. RNAi vermittelte posttranskritionelle gen-silencing VG wurde getestet, weil man dachte, dass seine Erschöpfung führe zu einem beobachtbaren phänotypische Wirkung wie verringert Fruchtbarkeit und Fruchtbarkeit, um potenziell BMSB Kontrolle zu helfen. Das JHAMT-gen, das die S-Adenosyl-L-Methionin (SAM) kodiert-abhängige JH Säure O-Methyltransferase katalysiert den letzten Schritt der JH Biosynthese Weg58. In diesem Pfad Farnesyl Pyrophosphat (FPP) nacheinander von Farnesol, Farnesoic Säure, gefolgt von der Umwandlung von Methyl-Farnesoate, JH durch JHAMT wandelt sich. Dieser Weg ist konserviert in Insekten und Arthropoden speziell für Metamorphose, ein Prozess, der Hormone59,60,61Entwicklungsgeschichtlich geregelt ist. In B. Morizufolge JHAMT Genexpression und die JH biosynthetische Aktivität in den Corpora Allata die transcriptional Unterdrückung des JHAMT -Gens für die Beendigung der JH Biosynthese58entscheidend. Daher wurden die JHAMT und Vg Gene für gezielte Erschöpfung mit RNAi ausgewählt. RNAi wurde auch Zitrusbäume für die Kontrolle der AKP-Staaten und GWSS getestet. Zitrusbäume mit DsRNA durch Wurzel durchnässen behandelt wurden, ergeben sich Hahn (Stamm Injektionen), sowie Blatt-Sprays mit DsRNAs gegen Insekten bestimmte Arginin Kinase (AK) Abschriften42,44. Die topische Anwendung von DsRNA erkannt wurde überall auf dem Vordach der Zitrusbäume, effiziente Lieferung durch die Pflanzen Vascular Gewebe angibt, und führte zu erhöhten Mortalität in den AKP-Staaten und GWSS41,42, 45.
In der aktuellen Studie haben wir eine natürliche Ernährung Übermittlungsmethode für Behandlungen wie DsRNA identifiziert. Diese neu entwickelte Technik diente anschließend für die JHAMT und Vg-Stummschaltung mit spezifischen DsRNAs gen in BMSB Nymphen als mRNA zeigten frühere62. Diese neue Übermittlungsprotokolle demonstriert hier ersetzen konventionelle RNA-Delivery-Systeme, die topischen Sprays oder Mikroinjektionen verwenden. Obst und Gemüse, Stamm Hahn, Boden Tränken und Ton Absorptionsmittel in können verwendet werden für die Lieferung von DsRNA, die ist entscheidend für die weitere Entwicklung der Schädlinge und Krankheitserreger Management verwand.

<table><tbody><tr><td>BMSB (H. halys) Insekten&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ACP (D. citri) Insekten&nbsp;</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bio grüne Bohnen</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zitruspflanzen</td><td>USDA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Natriumhypochloritlösung</td><td>J.T. Baker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>grüne Lebensmittelfarbe&nbsp;</td><td>McCormick & Co., Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermoforma-Kammern&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magenta Gefäß (Kultur)</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Primer&nbsp;</td><td>IDT DNA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SensiMix SYBR</td><td>Bioline</td><td></td><td></td></tr><tr><td>qPCR ABI 7500</td><td>Angewandte Biosysteme&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sprühflasche</td><td>N/A</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>American Can Company</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TaKaRa Ex Taq</td><td>Clontech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAquick</td><td>Qiagen</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

double-stranded rna oral liefermethoden induzieren rna-interferenz im phloem und pflanze-sap-fütterung hemipteran insekten

Double-stranded RNA Oral Delivery Methods to Induce RNA Interference in Phloem and Plant-sap-feeding Hemipteran Insects

Phloem und Pflanze SAP-Fütterung Insekten dringen in die Integrität von Pflanzen und Früchten zum Abrufen von Nährstoffen in den Prozess Nahrungspflanzen zu beschädigen. Hemipteran Insekten entfallen eine Reihe von wirtschaftlich erhebliche Schädlinge der Pflanzen, die Schäden an Kulturpflanzen durch die Fütterung auf Phloem Sap. Braun Marmorated Gestank Fehler (BMSB), Halyomorpha Halys (Heteroptera: Pentatomidae) und asiatische Zitrus Psyllid (ACP), Diaphorina Citri Teru (Hemiptera: Liviidae) sind hemipteran Schädlinge eingeführt in Nordamerika, wo sie sind Sie eine invasive landwirtschaftlichen Schädlingsbekämpfung hochwertige Spezialität, Zeile, und Nutzpflanzen und Zitrusfrüchte sowie ein Ärgernis-Schädling, wenn sie drinnen aggregieren. Insektizid-Widerstand in vielen Arten führte zu die Entwicklung von alternativen Methoden der Schädlingsbekämpfung-Management-Strategien. Doppelsträngige RNA (DsRNA)-vermittelten RNA-Interferenz (RNAi) ist ein Gen-silencing-Mechanismus für funktionelle Genomforschung Studien, die potenzielle Anwendungen als Werkzeug für das Management von Schadinsekten. Exogen synthetisiert DsRNA oder kleine interferierende RNA (SiRNA) auslösen kann, hocheffiziente gen-silencing durch den Abbau der endogene RNA, die Homolog zu, die vorgestellt wird. Effektive und ökologische Nutzung der RNAi als molekulare Biopestizide für Biocontrol hemipteran Insekten erfordert die in Vivo -Lieferung von DsRNAs durch die Fütterung. Hier zeigen wir Methoden für die Lieferung von DsRNA an Insekten: Laden von DsRNA in grünen Bohnen durch Untertauchen und Absorption von Gen-spezifischen DsRNA mit mündlichen Lieferung durch Verschlucken. Wir haben auch nicht-transgenen Pflanze Lieferung Ansätzen Blatt-Sprays, Wurzel durchnässen, Stamm Injektionen sowie tongranulat, die möglicherweise wichtig für anhaltende Freisetzung von DsRNA skizziert. Effiziente Bereitstellung von oral eingenommenen DsRNA wurde als eine effektive Dosierung induzieren eine signifikante Abnahme der Ausdruck gezielt Gene, wie Juvenilhormon Säure O-Methyltransferase (JHAMT) und Vitellogenin (Vg) bestätigt. Diese innovativen Verfahren stellen Strategien für die Lieferung von DsRNA im Pflanzenschutz und Umwelt meistern zur Schädlingsbekämpfung.

Pflanzlichen vermittelten DsRNA Lieferung durch Fütterung in BMSB 4th Instar Nymphen wurde für die Entwicklung der molekularen Biopestizide mit RNAi für invasive Schädlinge getestet. BMSBs Feed mit ihren nadelartigen Stilett durch einen Mechanismus bekannt als Zerfleischen und spülen, wodurch erhebliche Schäden an Kulturpflanzen. Schlanke Bio grüne Bohnen, p. Vulgaris L., wurden verwendet, um zu testen, ob Nährstoffe oder DsRNA in Vivo an BMSB durch Fütterung<...

Dieser Artikel beschreibt neuartige Techniken für mündliche Lieferung doppelsträngige RNA (DsRNA) durch die Leitbündel Gewebe von Pflanzen für die RNA-Interferenz (RNAi) im Phloem Sap Futterinsekten entwickelt.

Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

Phloem and plant sap feeding insects invade the integrity of crops and fruits to retrieve nutrients, in the process damaging food crops. Hemipteran ...

Das übergeordnete Ziel dieser Verfahren ist es, eine natürliche orale Verabreichungsmethode zu demonstrieren. Für genspezifische dsRNAs, um RNA-Interferenz in vivo zu induzieren und Insektenschädlinge. Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen zu beantworten, wie Biomoleküle in Insekten eingebracht werden können, die Wirkung von RNAi-basierten molekularen Biopestiziden aufzuklären und Insekten in der Umwelt zu kontrollieren.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass die Verabreichung durch Nukleinsäure-vermitteltes Gen-Silencing sowohl auf die Fütterung von Pflanzensaft als auch auf kauende Insekten angewendet werden kann. Die hier aufgeführten Methoden zeigen jedoch die Abgabe von doppelsträngiger RNA an hemipterische Schädlinge wie die Marmorierte Baumwanze, die Harlekinwanze und die Asiatische Zitrus-Psyllid. Sie können auf andere Insekten angewendet werden.Um das Protokoll zu beginnen, wählen Sie die frühe 4. Instar Braun marmorierte Baumwanze oder BMSB-Nymphen aus, die aus der Eimasse geschlüpft sind, und hungern Sie sie 24 Stunden lang vor der dsRNA-Fütterung. Wählen Sie anschließend schlanke, zertifizierte grüne Bohnen aus kontrolliert biologischem Anbau au

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Research

Forschung

JoVE Journal

Environment

Umwelt

In diesem Protokoll beschreiben wir zwei Strategien, die gleichzeitig zwei Gene unterdrücken (doppelte Gen Knockdown) in Honigbienen. Dann präsentieren wir, wie die Rüssel extension response (PER) Test, um die Wirkung der doppelten Gen Knockdown auf Honigbiene geschmacklichen Wahrnehmung studieren verwenden.

RNAi-vermittelte Gene Knockdown Doppelzimmer und Gustatorisch Perception Measurement in Honey Bees (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Hemmung der Genfunktion in Krankheitsvektor Mücken durch die Verwendung von Chitosan / interferierenden RNA-Nanopartikel, die durch Larven aufgenommen werden.

Chitosan / interfering RNA Nanopartikel vermittelten Gen-Stummschaltung in Disease Vector Mückenlarven

RNA-Interferenz (RNAi) ist ein äußerst wertvolles Werkzeug zur Aufdeckung der Genfunktion. Die Fähigkeit, Gene mit RNAi im präadulten Stadium anzugreifen, ist jedoch bei dem wichtigsten menschlichen Malariavektor Anopheles gambiae begrenzt. Wir beschreiben ein RNAi-Protokoll zur Verringerung der Genfunktion durch direkte Injektion während der Puppenentwicklung.

RNAi-Trigger Lieferung in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupae

Hier präsentieren wir Protokolle für die Aufzucht eines intermediären Keimkäfers, Dermestes maculatus (D. maculatus) im Labor. Wir teilen auch Protokolle für embryonale und elterliche RNAi und Methoden zur Analyse embryonaler Phänotypen, um die Genfunktion bei dieser Spezies zu untersuchen.

Zucht- und RNA-vermittelte Gene Knockdown in der ausblenden Doppelstrang-Käfer, Dermestes maculatus

Diese Handschrift zeigt die Erschöpfung der Gen-Expression in den Mitteldarm der deutschen Schabe durch orale Einnahme von doppelsträngige RNA in Liposomen verkapselt.

Praktische Anwendung der RNA-Interferenz: mündliche Lieferung von Double-Stranded RNA in Liposomen Träger für Schaben

RNA-Interferenz ist eine weit verbreitete, leistungsfähige Technik zur Manipulation der Genexpression in bestimmten Entwicklungsstadien. Hier beschreiben wir die notwendigen Schritte zur Umsetzung dieser Technik im Wassertauchkäfer Thermonectus marmoratus, vom Erwerb von Gensequenzen bis zum Knockdown von Genen, die Struktur oder Verhalten beeinflussen.

RNA-Interferenz in Wasserkäfern als leistungsstarkes Werkzeug zur Manipulation der Genexpression an bestimmten Entwicklungszeitpunkten

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Methode, um mit einem künstlichen Medium ausreichend Speichel von piercing-saugenden Insekten zu sammeln. Dies ist eine bequeme Methode, um Insektenspeichel zu sammeln und die Speichelfunktion auf das Fressverhalten von Insekten und die Übertragung von vektorübertragenen Viren zu untersuchen.

Zweischichtige Membran-Sandwich-Methode für Laodelphax striatellus Speichelsammlung

Die orale Verabreichung von dsRNA, die von Bakterien produziert wird, eine Verabreichungsmethode für RNA-Interferenz (RNAi), die routinemäßig bei Caenorhabditis elegans angewendet wird, wurde hier erfolgreich auf erwachsene Moskitos angewendet. Unsere Methode ermöglicht robuste Studien zur Umkehrgenetik und übertragungsblockierende Vektorstudien ohne den Einsatz von Injektionen.

Effektive orale RNA-Interferenz (RNAi) Verabreichung an erwachsene Anopheles gambiae-Mücken

Hier stellen wir eine detaillierte Einweichmethode der RNA-Interferenz in Bursaphelenchus xylophilus vor, um die Untersuchung von Genfunktionen zu erleichtern.

Anwendung von RNA-Interferenz im Kiefernnematoden, Bursaphelenchus xylophilus

Die Manipulation der RNA-Interferenz (RNAi) stellt bei vielen parasitoiden Arten mit geringer Größe, wie z. B. Trichogramma-Wespen , eine gewaltige Herausforderung dar. Diese Studie beschrieb eine effiziente RNAi-Methode in Trichogramma denrolimi. Die vorliegende Methodik bietet ein robustes Modell für die Untersuchung der Genregulation bei Trichogramma-Wespen .

RNA-Interferenz im Ei-Parasitoiden, Trichogramma dendrolimi matsumura

Hier wird ein Protokoll für die Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln in Seidenraupenlarven der Bombyx mori vorgestellt, um Gen-Silencing durch Verschlucken zu induzieren.

Larvale RNA-Interferenz in der Seidenraupe Bombyx mori durch Verabreichung von Chitosan/dsRNA-Nanopartikeln

Erfahren Sie eine orale dsRNA-Liefermethode zur RNA-Interferenz bei phloemsaugenden Hemipteren-Schädlingen. Diese Technik ermöglicht gezielte Gen-Silencing für nachhaltigen Pflanzenschutz.

Double-Stranded RNA Oral Liefermethoden induzieren RNA-Interferenz im Phloem und Pflanze-Sap-Fütterung Hemipteran Insekten

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