Automatisierte Dia scannen und Segmentierung in Gewebekulturen beschriftet Gewebe mit einem Weitfeld High-Content Analysesystem
3. Mai 2018
Hier beschreiben wir ein Protokoll für die automatische Segmentierung von eindringmittel beschrifteten Gewebe auf Folien mit einem Weitfeld-High-Content-Analyse-System (WHCAS). Dieses Protokoll hat breite Anwendungen in allen Bereichen umfasst die Quantifizierung der fluoreszierenden Marker in biologischen Geweben, einschließlich der biologischen Wissenschaften, Medizintechnik und Gesundheitswissenschaften.
Das übergeordnete Ziel dieser Bildgebungs- und Analysemethode ist es, einen einfach einzurichtenden Arbeitsablauf für die automatische Segmentierung von fluoreszenzmarkierten Gewebeproben zu generieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Biowissenschaften zu beantworten, wie viel eines bestimmten Proteins in einem bestimmten Bereich einer interessierenden Gewebeprobe zu finden ist. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass die zeitoptimierenden Protokolle für die automatisierte Segmentierung eingespart werden können, so dass diese Methode auf nachfolgende fluoreszenzmarkierte Gewebeproben angewendet werden kann.
Die Idee zu dieser Methode hatten wir, als wir neue Zellen im Hirngewebe bei hoher Vergrößerung quantifizieren mussten. Öffnen Sie nach dem Importieren der Erfassungen das Dialogfeld Plattenerfassung einrichten und öffnen Sie die Registerkarte Objektiv und Kamera. Stellen Sie die Vergrößerung auf das Vierfache, die Kamera-Binning auf eins und die Verstärkung auf zwei ein.
Öffnen Sie die Registerkarte Plattenobjektträger-Scannen, und geben Sie die entsprechenden experimentellen Einstellungen ein. Füllen Sie auf der Registerkarte Zu besuchende Standorte die Vertiefungen gleichmäßig mit den Standorten, und öffnen Sie die Registerkarte Einstellungen für den Plattenboden bearbeiten, um die entsprechenden experimentellen Werte einzugeben. Nachdem Sie diese Einstellungen als Einstellung A gespeichert haben, öffnen Sie die Registerkarte "Objektiv und Kamera" und stellen Sie die Vergrößerung auf das 40-fache, das Kamera-Binning auf eins und die Verstärkung auf zwei ein.
Vergewissern Sie sich, dass alle Einstellungen auf den Registerkarten "Plate Slide Scanning" und "Edit Plate Bottom Settings" mit den Einstellungen für "Einstellung A" übereinstimmen.Öffnen Sie die Registerkarte "Acquisition Loop". Geben Sie die Anzahl der in der Probe vorhandenen Wellenlängen ein und aktivieren Sie die Optionen "Laserbasierte Fokussierung aktivieren" und "Bildbasierte Fokussierung aktivieren". Speichern Sie dann diese Einstellungen als Einstellung B.Legen Sie als Nächstes bis zu drei Objektträger mit dem Deckblatt nach unten und dem Etikett an der Seite der Kerbe in den Folienadapter ein.
Und drücken Sie F4, um das Hauptmenü zu öffnen. Wählen Sie Slide Scanning (Objektträger-Scan) und klicken Sie auf Open Door Eject Slide, um den Slide-Adapter in das Weitfeld-High-Content-Analysesystem einzusetzen. Klicken Sie dann auf Türladeschieber schließen.
Stellen Sie zunächst sicher, dass die entsprechende Wellenlänge ausgewählt ist. Wechseln Sie zu anderen Standorten innerhalb des Live-Feature-Bildes, bis sich der Interessenbereich befindet. Konzentrieren Sie sich auf die Region.
Wenn es nicht scharf ist, verwenden Sie die Schaltfläche Autofokus oder passen Sie die Schrittweite an, bis sie scharf ist. Verwenden Sie Snap, um das Bild aufzunehmen, wenn Sie den Fokus manuell anpassen, indem Sie die Schrittweite ändern. Um einen vorherigen Scan einzurichten, laden Sie zuerst Einstellung A und wählen Sie Folienvorschau aus.
Geben Sie die Anzahl der Folien an, und wählen Sie OK aus. Wählen Sie als Vergrößerung das Vierfache. Wählen Sie dann Deckglas nach unten und fahren Sie mit der Auswahl Ihrer Grundeinstellungen für den vorherigen Scanvorgang fort. Stellen Sie sicher, dass sowohl die Erfassungseinstellung als auch die Kalibrierungen aktiviert sind, bevor Sie Abbrechen auswählen und auf Weiter klicken.
Klicken Sie auf der Registerkarte W1:DAPI auf Live und dann auf Auto Expose, gefolgt von Snap. Drücken Sie danach auf Schließen. Wählen Sie das Verzeichnis aus und geben Sie einen Namen für den vorherigen Scan ein.
Das Dialogfeld Bereich zeichnen wird automatisch angezeigt. Verwenden Sie das Werkzeug für rechteckige Bereiche, um den gesamten vorherigen Scanbereich auszuwählen, und klicken Sie auf Weiter. Laden Sie am Ende des vorherigen Scans Einstellung B und öffnen Sie die Registerkarte Zu besuchende Websites.
Stellen Sie zunächst sicher, dass die entsprechende Wellenlänge ausgewählt ist. Wechseln Sie zu anderen Standorten innerhalb des Live-Feature-Bildes, bis sich der Interessenbereich befindet. Konzentrieren Sie sich auf die Region.
Wenn es nicht scharf ist, verwenden Sie die Schaltfläche Autofokus oder passen Sie die Schrittweite an, bis sie scharf ist. Verwenden Sie Snap, um das Bild aufzunehmen, wenn Sie den Fokus manuell anpassen, indem Sie die Schrittweite ändern. Klicken Sie dann auf der Registerkarte W1 DAPI auf Automatisch belichten, und vergewissern Sie sich, dass das DAPI-Bild für Plate Acquisitions Snap gestochen scharf ist.
Klicken Sie im Hauptmenü auf Journal und wählen Sie im Pulldown-Menü die Option Journal ausführen aus. Doppelklicken Sie auf das Setup-Journal für die Erfassung des Objektträgerbereichs, um es zu starten, und klicken Sie auf Weiter, wenn das Dialogfeld Erfassung des Objektträgerbereichs einrichten angezeigt wird. Wenn Sie dazu aufgefordert werden, wählen Sie den DAPI-Scan aus, um das Diabild mit geringer Vergrößerung auszuwählen, und klicken Sie auf OK. Wenn Sie nach dem Plattenerfassungs-Snap gefragt werden, markieren Sie den Plate-Acquisition-Snap-DAPI und klicken Sie auf OK. Wenn das Feld "Bereiche erstellen oder laden" angezeigt wird, verwenden Sie das Werkzeug "Rechteckiger Bereich", um die Bereiche auszuwählen, die im DAPI-Scan von Interesse sind, und klicken Sie auf "Weiter".
Markieren Sie mit dem Locator-Werkzeug den Interessenbereich, und klicken Sie im Dialogfeld Region auswählen auf Weiter. Wenn das Feld "Regionen bestätigen" angezeigt wird, klicken Sie auf "Weiter" und entscheiden Sie, ob die Region gespeichert werden muss, wenn das Dialogfeld "Regionen speichern" angezeigt wird. Es erscheinen drei Dialogfelder.
Klicken Sie auf Weiter, um das Feld Setup abgeschlossen zu schließen. Um das Rätselraten bei der Suche nach Stichprobenstandorten zu vermeiden, stellen Sie sicher, dass Bilder während der Erfassung auf der Registerkarte Anzeigeeinstellungen aktiviert ist, und öffnen Sie die Registerkarte Zusammenfassung, um auf Platte erfassen zu klicken, um die Bühne des vorausgewählten Interessenbereichs zu positionieren. Wenn die Kamera über eine Site schwenkt, die die gewünschten Zellen enthält, klicken Sie auf Abbrechen, um die Bildaufnahme zu stoppen.
Seien Sie nicht beunruhigt, wenn das Bild unscharf ist. Dieser Schritt dient ausschließlich dazu, die Bühne der ersten Website in der von Ihnen ausgewählten Interessenregion zu positionieren. Vergewissern Sie sich, dass sich die Bühne über der Stichprobe befindet und dass Sie die Anzahl der Standorte korrekt eingegeben haben.
Optimieren Sie die Wellenlängeneinstellungen, um sicherzustellen, dass ein Bild mit hohem Dynamikbereich fokussiert wird. Öffnen Sie dann erneut die Registerkarte Zusammenfassung und klicken Sie auf Platte übernehmen. Wählen Sie am Ende der Analyse die Registerkarte Anzeige aus.
Wählen Sie im Pulldown-Menü Bild-Overlay die Option Well-Informationen anzeigen aus, um die Site-Nummern in der oberen linken Ecke anzuzeigen. Scrollen Sie durch die Stellen und schließen Sie alle Stellen aus, die unscharf sind und/oder Gewebefalten oder Blasen und Risse im Gewebe enthalten. In diesem repräsentativen Bild werden Miniaturansichten mit hoher Vergrößerung aller Stellen innerhalb des definierten Interessenbereichs angezeigt.
Jede Website sollte überprüft werden, um die Websites zu identifizieren, die von der Analyse ausgeschlossen werden sollten. In diesem Experiment war beispielsweise die Stelle 149 unscharf, die Stelle 219 hatte Blasen und die Stelle 54 enthielt eine Falte. Alle drei Standorte wurden von der Analyse ausgeschlossen.
Hier zeigen entsprechende Overlays, die vom Multi-Wellenlängen-Zellscoring-Modul erzeugt werden, die Ergebnisse der automatisierten Segmentierung, die an Standort 59 durchgeführt wurden, wie sie gemäß den experimentellen Spezifikationen angepasst wurden. Nach der Segmentierung können die quantitativen Daten des Anteils der Zellen erhalten werden, die für jeden Marker, beide Marker, keine Marker, die mittlere gefärbte Fläche und die mittlere Fluoreszenzintensität gefärbt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Ihr Weitfeld-High-Content-Analysesystem einrichten, um einen automatisierten Workflow für die Bildgebung und Segmentierung einer auf Objektträgern montierten Gewebeprobe zu erstellen.
Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll für die automatisierte Segmentierung fluoreszenzmarkierter Gewebe mithilfe eines breitfeldbasierten Hochdurchsatz-Analysesystems (WHCAS) vor. Diese Methode vereinfacht die Quantifizierung fluoreszierender Marker in biologischen Geweben und profitiert verschiedener Fachgebiete, darunter die Biowissenschaften und die medizinische Technik.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Biologische Wissenschaften
- Medizintechnik
- Gesundheitswissenschaften
Hintergrund
- Die automatisierte Segmentierung verbessert die Analyse fluoreszenzmarkierter Gewebe.
- Systeme zur hochinformativen Analyse ermöglichen detaillierte Abbildungen biologischer Proben.
- Die Quantifizierung von Proteinen in Gewebeproben ist entscheidend für das Verständnis biologischer Prozesse.
- Diese Methode wurde entwickelt, um Herausforderungen bei der Quantifizierung neuer Zellen im Gehirngewebe zu bewältigen.
Zweck der Studie
- Ein effizientes Workflow-Verfahren für die automatische Segmentierung von Gewebeproben zu erstellen.
- Die Genauigkeit und Geschwindigkeit der Quantifizierung fluoreszierender Marker zu verbessern.
- Einen standardisierten Protokollablauf bereitzustellen, der auf verschiedene Gewebetypen anwendbar ist.
Verwendete Methoden
- Aufbau eines Weitfeld-High-Content-Analysesystems für die Bildgebung.
- Konfiguration der experimentellen Einstellungen für eine optimale Bildaufnahme.
- Verwendung von Software-Tools für die Bildakquisition und -analyse.
- Implementierung von Autofokus- und bildbasierten Fokussiertechniken.
Hauptergebnisse
- Eine erfolgreiche Segmentierung fluoreszenzmarkierter Gewebe wurde erreicht.
- Mit der Hochvergrößerungsabbildung wurden detaillierte Ansichten der Gewebeproben erhalten.
- Interessierende Bereiche wurden genau identifiziert und analysiert.
- Ausschlusskriterien für unscharfe oder beschädigte Bilder wurden festgelegt.
Schlussfolgerungen
- Das automatisierte Segmentierungsprotokoll reduziert die Analysezeit erheblich.
- Diese Methode kann auf eine breite Palette biologischer Gewebe angewendet werden.
- Zukünftige Anwendungen könnten die Forschung in verschiedenen wissenschaftlichen Bereichen verbessern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Die automatisierte Objektträger-Durchsicht und Segmentierung mithilfe eines breitfeldbasierten Hochdurchsatz-Analysesystems (WHCAS) behebt den Engpass bei der Quantifizierung fluoreszierender Marker in großen Gewebeschnitten und ermöglicht eine reproduzierbare, hochdurchsatzfähige Analyse zur Zielvalidierung und Assay-Entwicklung. Durch die Standardisierung der Bildakquisition und der Segmentierungsworkflows verringert dieses Verfahren die Variabilität und beschleunigt die präklinische Bewertung gewebebasierter Biomarker, wodurch datengestützte Go/No-Go-Entscheidungen in der frühen Entdeckungsphase unterstützt werden.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch Quantifizierung von Proteinexpressionsmustern in krankheitsrelevanten Geweben.
- Operationaler Wert: Verringert den Zeitaufwand für die Optimierung von Protokollen pro Einzelexperiment und ermöglicht eine schnelle Anwendung über mehrere fluoreszenzmarkierte Zielstrukturen hinweg.
- Prädiktiver Wert: Unterstützt die mechanistische Entschärfung von Risiken durch konsistente, quantitative Auswertungen der Lokalisation und Expression von Markern.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Bereitet validierte biologische Systeme für nachgeschaltete Screening-Verfahren vor, indem standardisierte, segmentierte Gewebebilder erzeugt werden, die für hochinhaltsreiche Assays geeignet sind.
- Operativer Wert: Verbessert die Standardisierung und Reproduzierbarkeit von Assays durch automatisierte Regionenauswahl und Ausschluss beschädigter Stellen (z. B. unscharfe, gefaltete oder blasige Gewebestellen).
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Wiederverwendung der Plattform über verschiedene Marker und Gewebetypen hinweg mittels vorkonfigurierter Softwaremodule für Proteinlokalisation, Proliferation, Vitalität, Apoptose und Angiogenese.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhalt: Gewährleistet Konsistenz von der Entdeckung bis zur präklinischen Validierung, indem quantitative Daten zu Anteilen markerpositiver Zellen, mittlerer angefärbter Fläche und Fluoreszenzintensität bereitgestellt werden.
- Risikoadjustierte Weiterentwicklung: Unterstützt die Entscheidungsfindung in der präklinischen Forschung durch verlässliche, auschlussgefilterte Datensätze, die das tatsächliche biologische Signal widerspiegeln.
- Krankheitsrelevante Systematik: Nachgewiesene Anwendbarkeit in der Analyse von Gehirntumorgewebe, mit Übertragbarkeit auf jeden fluoreszenzmarkierten nukleären oder zytoplasmatischen Marker in auf Objektträgern montierten Gewebeproben.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode ist in die Entdeckungskette von der frühen Entdeckung über die Identifizierung von Wirkstoffkandidaten bis hin zur präklinischen Forschung integriert und ermöglicht eine standardisierte Gewebeanalyse in jeder Phase.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Hypothesenprüfung und die Aufklärung von Signalwegen durch die Quantifizierung der Markerexpression in spezifischen, interessierenden Geweberegionen.
- Screening: Stellt Bereitschaft für Assays sicher durch automatisierte Segmentierung und quantitative Ausgaben, die eine zuverlässige Bewertung von Substanzen an verschiedenen Standorten ermöglichen.
- Analytik: Erzeugt messbare Ergebnisse, einschließlich des Anteils positiver Zellen, der mittleren gefärbten Fläche und der mittleren Fluoreszenzintensität, und ermöglicht so den Vergleich zwischen verschiedenen Bedingungen.
- Translationale Forschung: Schafft Anschluss an die präklinische Kontinuität, indem sie quantitative, biomarkerbasierte Gewebedaten bereitstellt, die für Validierungsstudien geeignet sind.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Funktioniert als wiederverwendbare Fähigkeit über verschiedene Projekte hinweg und nutzt vorkonfigurierte Softwaremodule sowie gespeicherte Einstellungen (Einstellung A und B) für konsistente Objektträger-Scans und Segmentierungen.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Vorhersagegenauigkeit bei der Zielvalidierung, Verringerung mechanistischer Mehrdeutigkeiten in gewebebasierten Assays.
- Operationaler Wert: Standardisierung, Reproduzierbarkeit und Skalierbarkeit von Workflows zur Gewebeabbildung und -analyse.
- Strategischer Wert: Verbesserte Go/No-Go-Entscheidungen, Kapitaleffizienz durch reduzierte Zeit für die Protokolloptimierung und geringeres biologisches Risiko in späteren Phasen.
- Portfolio-Implikation: Risikoadjustierte Priorisierungs- und Weiterentwicklungsentscheidungen basierend auf quantitativen, ausschlussbasiert validierten Gewebedaten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse im Betrieb von Widefield-High-Content-Analysesystemen und in der Navigation der zugehörigen Software.
- Ist abhängig von Instrumenten, die eine Objektträger-Scanning-Funktion, Mehrwellenlängen-Aufnahme sowie laser- und bildbasierte Fokussierung ermöglichen.
- Setzt eine standardisierte Abstimmung der Aufnahmeparameter (z. B. Vergrößerung, Binning, Verstärkung) und der Definition von Interessenbereichen über mehrere Teams hinweg voraus.
- Erfordert Anpassungen, wenn die Methode auf verschiedene Gewebetypen, Markerexpressionen oder Objektträgerdicken angewendet wird.
- Beinhaltet praktische Einschränkungen, wie beispielsweise die manuelle Ausschließung von Aufnahmestellen mit Artefakten (z. B. unscharfe Bilder, Geweisfalten, Blasen), trotz automatisierter Bildaufnahme.
