Name: Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Erfahren Sie, wie menschliche Genfunktion während der Meiose I mit Maus-Eizellen untersucht wird. Diese Methode hilft bei der Erforschung genetischer Prädispositionen für mütterliche Aneuploidie.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch ein Forschungsstipendium von der American Society for Reproductive Medicine und von der Karl und Johanna Busch Memorial Fund an der Rutgers, The State University von NJ, k.s. A.L.N. wurde durch einen Zuschuss aus dem N.I.H. (F31 HD0989597) unterstützt.

(1) molecular Cloning
<ol><li>Full-Length kodierende Sequenz des Gens von Interesse erhalten und die Plasmid in Vitro Transkription (pIVT) Vektor-11. Hinweis: In voller Länge cDNA Clones sind von verschiedenen Herstellern im Handel erhältlich oder können über reverse Transkription Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR) generiert werden. Das National Center for Biotechnology Information (NCBI) Online-Ressource bietet Transkript Sequenzen für Gene aus der Nucleotide und ausgedrückt Sequenz markiert (EST) Datenbanken. Zur Erleichterung des Proteins können Visualisierung und Analyse von Ausdruck Niveaus, Fusion, grün fluoreszierendes Protein (Gfp) oder eine andere geeignete fluoreszierende Tag in der Klonen Strategie erwünscht sein.</li>
	<li>Mittels einer validierten Klonen Strategie legen Sie die kodierende Sequenz des Gens von Interesse in mehreren Klonen und Umgebung pIVT. Eine detaillierte Beschreibung der molekularen Klonen und die erforderlichen Schritte wurden zuvor beschriebenen 12. Hinweis: Wenn ein Gen-Fusion Produkt generiert werden, sicher sein, dass das Klonen ist in den richtigen Leseraster.</li>
	<li>Sequenz das Konstrukt mit Globin Primer um sicherzustellen korrekte gen einsetzen, richtige in-Frame Fusion und keine Polymerase-induzierte Punktmutationen entstanden. Hinweis: Wenn DNA Sanger-Sequenzierung Ausrüstung nicht verfügbar ist, bieten viele Unternehmen kostengünstige Optionen der DNA-Sequenzierung.</li>
	<li>Mutagenize DNA, wenn Einzel-Nukleotid-Polymorphismen (SNPs) oder Einfügungen/Löschungen (INDELS) zu generieren. DNA-Mutagenese wird in Schritte 1.5-1.7 unten beschrieben. Wildtyp Konstrukte fahren Sie fort mit der Linearisierung Schritt 1,7.</li>
	<li>Design-Mutagenese Primer und vervollständigen die Mutagenese-PCR-Reaktion um mutierte Konstrukt pro des Herstellers Protokoll zu generieren. PCR-vermittelten Site-verwiesene Mutagenese wurde zuvor beschriebenen 13. Darüber hinaus bieten viele Unternehmen Site-verwiesene Mutagenese-Kits die Protokolle enthalten.</li>
	<li>Verwandeln Sie mutagenisierter DNA in bakterielle Host. Isolieren und Plasmid zu reinigen. Hinweis: Viele Unternehmen stellen Kits, die lässt sich leicht isolieren und reinigen Plasmid DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend. Wenn ein gramnegatives Bakterienstamm wie E. Coliverwenden, empfiehlt es sich, ein Kit zu verwenden, die Endotoxine entfernt.</li>
	<li>Die isolierte DNA aus bakteriellen transformanten verwenden standard Sanger-Sequenzierung zur Bestätigung der Einführung des gewünschten SNP oder INDEL-Sequenz.</li>
	<li>Linearisieren Sie Endprodukte mit einzelnen Beschränkung Enzym Verdauung der gereinigte DNA. Hinweis: Der pIVT Vektor enthält mehrere Single-Enzym schneiden in der Plasmid-Karte auf Addgene 14aufgeführten Websites.</li>
	<li>Stellen Sie sicher, dass das Produkt linear über Agarose-Gelelektrophorese. Die Methodik für die Agarose-Gelelektrophorese wurde zuvor definierten 14. Hinweis: Für alle verbleibenden Schritte verwenden Sie Barriere (Filter) pipettieren Tipps und RNase-freie Materialien zur Herstellung von stabilen, hochwertigen RNA zu gewährleisten.</li>
	<li>Reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem validierten DNA-Aufräum Protokoll oder Kit und eluieren in 30 µL RNase/DNase-freies Wasser. Hinweis: Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Kits sind empfehlenswert für qualitativ hochwertige, gereinigte DNA. Folgen Sie Hersteller-Protokoll entsprechend.</li>
	<li>
In-vitro- Transkription DNA mit Hilfe T7-Polymerase nach Protokoll des Herstellers.</li>
	<li>Reinigen Sie und eluieren Sie RNA in 30 µL RNase/DNase freies Wasser mit einem Silica-Matrix Spin spaltenbasierten Nukleinsäure Reinigung Kit nach der Hersteller-Protokolls.</li>
	<li>Führen Sie denaturierenden Agarose-Gelelektrophorese mit Formaldehyd, um die endgültige Größe der RNA-Produkt zu bestätigen. Finden Sie unter Schritte 1.13-1.22 unter 14. (Abbildung 1).</li>
	<li>Bereiten Sie Gel durch Erhitzen 1 g Agarose in 72 mL Wasser aufgelöst, dann auf 60 ° c abkühlen lassen</li>
	<li>Bereiten Sie 10 X MOPS laufen Puffer durch Zugabe von 0,4 M MOPS (pH 7,0), 0,1 M Natriumacetat und 0,01 M EDTA vor.</li>
	<li>Zugeben Sie 10 mL 10 X MOPS laufen Puffer und 18 mL 37 % Formaldehyd (12,3 M) bis zur gekühlten Agarose-Lösung.</li>
	<li>Kaste das Gel durch die Agarose-Lösung in einem gelbildenden Behälter gießen. Verwenden Sie einen Kamm groß genug für 10 µL. Nachdem Gel gesetzt hat und fest im Griff ist haben, entfernen Sie vorsichtig den Kamm.</li>
	<li>Montieren Sie das Gel in der Elektrophorese-Tank, und fügen Sie genug 1 X MOPS laufen Puffer, sicherzustellen, dass das Gel vollständig bedeckt ist.</li>
	<li>Bereiten Sie RNA-Probe durch Zugabe von 1 µg RNA bis 0,5 X Datenmengen formaldehydhaltigen laden Farbstoff vor.</li>
	<li>RNA-Lösung mit einer Konzentration von 10 µg/mL Interkalation Bromid hinzufügen.</li>
	<li>Denaturieren Sie RNA Beispiellösung bei 70 ° C für 5 Minuten.</li>
	<li>Verwendung von sterilen, 10 µL Filterspitzen, laden 5 µL Molekulargewicht Marker und 5 µL RNA Probe(n) in separaten Vertiefungen des Gels und electrophorese mit 5 V/cm, bis der Farbstoff mindestens zwei Drittel der Länge des Gels migriert hat.</li>
	<li>Visualisieren Sie die RNA in das Gel auf eine UV-Trans-Hilfslicht. Sicherstellen Sie, dass die RNA die richtige Größe hat, durch den Vergleich mit dem Molekulargewicht Marker.</li>
	<li>Zur Messung der Konzentration und Reinheit der RNA übertragen Sie 1,2 µL gereinigten RNA mit sterilen 10 µL-Filter-Tips auf einem UV-Spektrophotometer. Beachten Sie, dass hochwertige RNA Extinktion Verhältnisse der A260/280 (1,8-2,2) und 260/230 haben sollte (> 1,7) beziehungsweise.</li>
	<li>Verwenden 10 µL Filterspitzen, aliquoten die restlichen gereinigte RNA in sterile 0,5 µL Zentrifuge Röhren (3-5 µL/Rohr). Röhren bei-80 ° C bis bereit für die Mikroinjektion zu speichern. Hinweis: Eine Konzentration der letzten Injektion von 500 ng/µL ist ein optimaler Ausgangspunkt. Es wird empfohlen, die RNA verdünnen 1:2 in RNase H20 vor der Mikroinjektion zu verringern Klebrigkeit der RNA in Mikroinjektion Pipette frei.</li>
</ol>(2) Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Assay
<ol><li>Unterteilen Sie Eizellen in gleich große Gruppen für die Mikroinjektion. Hinweis: Eizellenentnahme, Transfer, Mikroinjektion und meiotischen Reifung hat in Jupiter ausführlich beschrieben wurden bisher 15.</li>
	<li>Microinject, eine Gruppe mit experimentellen mRNA und die anderen Gruppen mit dem WT-Kontrolle und PBS oder Gfp mRNA. Hinweis: 500 ng/µL ist die empfohlene Injektion Konzentration mit 10beginnen. Ein Picoinjector kann zur Injektion Beträge zu kontrollieren. Ein Injektionsvolumen von 5-10 pL wird 15empfohlen.</li>
	<li>Mit einer Hand oder Mund betriebenen pipettieren Apparat, wo das Glas pipette Öffnung, leicht ist im Embryo Qualität Mineralöl größer als der Durchmesser einer Eizelle (100-150 µm), Transfer Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium in einer Petrischale abgedeckt und inkubieren Sie Eizellen für 7 h bei 37 ° C in 5 % C02 ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) 15.</li>
	<li>Nach der Inkubation mit derselben Pipette Apparatur wie oben beschrieben, Eizellen in der Mitte gut Orgel Kulturschale mit 700 µL vorgekühlt minimale wesentlichen Medien (MEM) Sammlung Medium in der Mitte gut und 500 µL H20 in den äußeren Ring zu übertragen und Legen Sie Gericht für 7 min auf Eis. Hinweis: Es wird empfohlen, vorab chill MEM Media und Mitte gut Orgel Kultur Gerichte bei-20 ° C für mindestens 20 Minuten vor der Behandlung der Eizellen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Eizellen übertragen sie mit Hilfe der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in 1 X PBS für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Mit gleichen pipette Apparat, übertragen die Eizellen in einem anderen Brunnen auf einem Fleck Teller mit 400 µL blocking Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,01 % Tween-20 + 0,02 % NaN3) und Store bei 4 ° C bis bereit für Immunostaining verarbeiten. Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einem neuen Brunnen an einem Ort Platte mit 400 µL Permeabilisierung Lösung (PBS + 0,3 % BSA + 0,1 % TritonX-100 + 0,02 % NaN3) und Inkubation bei Raumtemperatur für 20 min. Transfer Eizellen schnell durch drei 400 µL Tropfen blockiert Lösung um jede verbleibende Reinigungsmittel zu entfernen. Hinweis: Eine 9-gut klare Glasplatte vor Ort eignet sich gut für Gruppen durch mehrere Behandlungen auf ein einziges Gericht (Schritte 2,4-2,5) verschoben.</li>
	<li>Führen Sie die verbleibenden Immunocytochemistry Verfahren in eine Feuchte Kammer, lichtgeschützt bei Raumtemperatur. Verwendung einer mittelständischen Kunststoff-Behälter gefüttert mit feuchten Papiertüchern und mit Alufolie abdecken.</li>
	<li>Mit der Pipette Apparat übertragen Eizellen zu 30 µL Lösung auf dem Deckel einer 96-Well-Platte und Ort innerhalb der Feuchte Kammer für 10 Minuten blockiert. Hinweis: In den runden Einkerbungen auf der Platte befinden sich Tropfen.</li>
	<li>Beschriften Sie Zentromere und Spindel, mit Hilfe der Pipette Apparat, transfer Eizellen zu 30 µL blockiert Lösung mit Anti-Zentromer Antigen (ACA, Crest) (01:30) und Anti-acetyliert Tubulin (1: 1000) und inkubieren Sie für mindestens 1 h.</li>
	<li>Spülen Sie Eizellen durch die Übertragung durch drei 30 µL Tropfen Lösung für 10 min zu blockieren.</li>
	<li>Mit Hilfe der Pipette Apparat, Transfer Eizellen zu 30 µL drop von blockierenden Lösung, komplementär zu den Antikörpern verwendet oben (Anti-Human IgG 1: 200, Anti-Maus IgG 1: 200) sekundäre Antikörper enthält und 1 h inkubieren.</li>
	<li>Wiederholen Sie die 3, 10 min spülen Schritte in 30 µL Lösung blockiert, wie in Schritt 2.11 beschrieben.</li>
	<li>Transfer die Eizellen, die mit der Pipette Apparat in 3-5 µL Montage mittlerer mit DAPI (5,9 µg/µL) auf einen Glas-Objektträger.</li>
	<li>Legen Sie 4 kleine Tropfen (groß wie ein Stecknadelkopf) Vaseline an den Ecken des Deckglases, Zerkleinerung von Eizellen zu verhindern.</li>
	<li>Legen Sie sanft die Deckglas Vaseline Seite nach unten auf die Folie.</li>
	<li>Versiegeln Sie Deckglas Kanten mit klaren Nagellack und 5 Minuten trocknen lassen.</li>
	<li>Bewahren Sie Folien bei 4 ° C bis zur Verarbeitung über konfokalen Mikroskopie lichtgeschützt auf. Hinweis: Sicherstellen der Brechungsindex des Eindeckmittel und Deckglas, Spiele die Mikroskop-Ziele genutzt. Empfohlene Montage, die Materialien bisher beschriebenen 15.</li>
	<li>Bild von Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, kleine Schritte zu erfassen (≤ 1 µm) in der Z-Ebene, für die Arbeiten Ziel, und das Image der gesamten Region der Metaphase Spindel optimiert. Hinweis: Stellen Sie sicher, dass alle 3 Kanäle, basierend auf spezifischen Sekundärantikörper verwendet im Schritt 2.11 Bild. Bild von durchschnittlich ≥ 4 und ein Zoom von 3 sind ideal für ausreichende Auflösung. Eine 1 µm Schrittgröße bietet übersichtliche Visualisierung von Mikrotubuli und Kinetochore in Maus Eizellen. Das Verfahren für die Bilderfassung variiert von Mikroskop, Mikroskop. Entnehmen Sie bitte der Hersteller konfokale Benutzerhandbuch für konkrete Schritte zum Mikroskop-Einstellungen konfigurieren.</li>
	<li>Identifizieren Sie Kinetochor-Mikrotubuli Anlage Status mithilfe von imaging-Software folgende Schritte 2.21-2.23. Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden. Anlage-Status, die Arten bisher definiert 16 .</li>
	<li>Bild öffnen, indem Sie die Datei in Bild J-Tool-Leiste ziehen.</li>
	<li>Machen Sie in der geöffneten Z-Serie alle Kanäle sichtbar (DNA, Kinetochor und Spindel) durch Klicken auf "Kanäle zusammenfügen", erhältlich im Dropdown-Menü "Bild" unter der Registerkarte "Farbe" Sub.</li>
	<li>Verwenden den Schalter am unteren Rand des Bildes, bewegen Sie sich durch jede Z-Scheibe und bestimmen Sie Kinetochor-Mikrotubuli-Anlage zu. Detaillierte Anlage, die Beschreibungen bisher beschriebenen 16
</li>
</ol>(3) Chromosom Ausrichtung Herausforderung Assay
<ol><li>Verwenden die Pipette-Apparat, wie unter Punkt 2.3 beschrieben, Eizellen zu einem 100 µL Tropfen Milrinone-freien Kulturmedium unter Öl zu übertragen und inkubieren Sie Eizellen für 7 h ermöglichen ausreichende Reifung zur Metaphase der Meiose ich (ich traf) wie oben beschrieben im Schritt 2.3 17 . Hinweis: Verfahren zur Eizelle Sammlung, Mikroinjektion und Reifung umrissen wurden bisher 15. Beziehen sich auf die Anlage Assay Protokoll in Schritte 2.1-2.2 für Steuerelemente und RNA Mikroinjektion Konzentrationen.</li>
	<li>Mit derselben Pipette Apparatur, Transfer Eizellen zu einer Kultur Zentrum gut Orgel Schale mit 700 µL Kulturmedium mit Monastrol [100 µM] im Zentrum gut und 400 µL H20 in das umgebende Ring und Inkubation bei 37 ° C für 2 h.</li>
	<li>Monastrol durch die Übertragung von Eizellen, mit Hilfe der Pipette Apparat als oben durch drei Tropfen 100 µL CZB Kulturmedium, ausspülen und übertragen dann die Eizellen für eine neue Mitte-gut Orgel Kulturschale mit 700 µL Kulturmedium + MG132 [5 µM] für 3 h in der Mitte Ring. Den äußeren Ring 400 µL H20 hinzufügen.</li>
	<li>Befestigen Sie die Eizellen durch Übertragung, mit der Pipette Apparat in einen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL 2 % Paraformaldehyd in PBS für 20 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Nach der Fixierung, die Eizellen zu übertragen, mit Hilfe der Pipette Apparat in einen neuen Brunnen aus einer klaren spot Glasplatte mit 400 µL blockierende Lösung und Store bei 4 ° C bis für Immunostaining verarbeitet. Hinweis: zum Speichern von Eizellen bei 4 ° C, Deckel Glasplatte vor Ort mit Parafilm um Verdunstung zu verhindern.</li>
	<li>Permeabilize und Eizellen über Immunocytochemistry zu kennzeichnen, wie 2,6-2.16 beschrieben.</li>
	<li>Eizellen mit einer 40-63 X Objektiv auf einem confocal Mikroskop, Erfassung Bild < 1 µm Schritte in der Z-Ebene und achten Sie auf die gesamte Region der Metaphase Spindel Bild.</li>
	<li>Ermittlung von Chromosom Ausrichtung Status offen über imaging-Software-Image-Dateien. Hinweis: Die folgenden Schritte beschreiben dieses Verfahren mit Bild J (NIH) kostenlos downloadbare Software, jedoch Alternativen imaging-Software genutzt werden.</li>
	<li>Ziehen Sie Bild in Bild J Bedienfeld.</li>
	<li>In der geöffneten Z-Serie, verwenden Sie das punktwerkzeug (verfügbar durch Klicken auf das Werkzeugsymbol Punkt auf der Bedienleiste Bild J), Punkte am Ende jeder Spindel Stange in ihre jeweiligen Z-Scheibe zu markieren, indem das Tool über die Spindel Pol im Bild und Klick auf das Bild. Fügen Sie diese Punkte auf die Region of Interest (ROI) Manager Command + t auf der Tastatur drücken.</li>
	<li>Bestimmen Sie die spezifischen Koordinaten für jede der Positionen durch Hervorhebung des spezifischen Punktes im ROI-Manager und klicken Sie auf die Schaltfläche Measure in Schritt 3.10 gesetzt. Dies wird ein Ergebnis liefern Tisch-haltigen x- und y-Koordinaten für jeden Punkt. Diese werden die Punkte X1, Y1, und X1, Y2, beziehungsweise.</li>
	<li>Bestimmen Sie als nächstes die wahre Z-Koordinate. Dies geschieht durch Multiplikation der Slice-Nummer des bestimmten Z-Segments im Z-Stapel in der Spindel Pol identifiziert wurde (d. h. Scheibe #2 von 6), die jeder einzelner Punkt ist durch die Dicke Stapel (d. h. 1 µm) (Beispiel: Schneiden Sie 2 x 1 µm = 2). Diese werden jeweils die Z1 und Z2 Punkte.</li>
	<li>Spindellänge unter Verwendung der Satz des Pythagoras-Gleichung zu bestimmen (eine2 + b2 = C2) unter Verwendung der zuvor definierten x-, y- und Z-Koordinaten von Schritten 3.11-3.13. Für jede Spindel ist die endgültige Länge gleich: √((x1-x2)2+(Y1-Y2)2+(Z1-Z2)2)</li>
	<li>Bestimmen Sie die Spindel Midzone. Dies errechnet sich die Hälfte der Länge der Spindel. Mit dem Linienwerkzeug in Bild J, indem Sie auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J zeichnen Sie eine Linie, die von einem Pol der Spindel zu Spindel Midzone ist. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt.</li>
	<li>Bestimmen Sie Chromosom Ausrichtung Status durch die Bewertung Chromosom Abstand von der Spindel Midzone mit dem Linienwerkzeug Messung. Verwenden das Linien-Werkzeug durch Klicken auf die Zeile-Symbol in der Symbolleiste Bild J, zeichnen Sie eine Linie von der Spindel Midzone auf dem Chromosom. Die Länge wird auf der Symbolleiste Bild J angezeigt. Chromosomen, die größer als 4 µm aus der Spindel Midzone gelten nicht ausgerichtete 18.</li>
</ol>

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<li>Kapoor, T. M., Mayer, T. U., Coughlin, M. L., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+spindle+assembly+mechanisms+with+monastrol%2C+a+small+molecule+inhibitor+of+the+mitotic+kinesin%2C+Eg5%5BTitle%5D)+AND+%22Eg5.+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing spindle assembly mechanisms with monastrol, a small molecule inhibitor of the mitotic kinesin, Eg5.</a> Eg5. J Cell Biol. 150 (5), 975-988 (2000).</li>
<li>Jones, K. T., Lane, S. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+causes+of+aneuploidy+in+mammalian+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Molecular causes of aneuploidy in mammalian eggs.</a> Development. 140 (18), 3719-3730 (2013).</li>
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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Wegen der raschen und zunehmende Identifizierung des menschlichen genetischen Varianten mit Krankheit verbunden ist es unerlässlich, dass Systeme entstehen, um deren biologische Bedeutung zu bewerten. Funktion des Proteins in menschlichen Meiose stellt besondere Herausforderungen zu verstehen, weil menschliche Eizellen kostbar sind und seltene und menschliche Spermien nicht zugänglich, Genmanipulation sind. Maus Eizellen sind Säugetiere Modellsystem wertvoll für die Bewertung der menschlichen meiotische Gene Funktion <su...

Unfruchtbarkeit ist eine Erkrankung, die 10-15 % der menschlichen Bevölkerung der gebärfähigen Alter 1, betroffen, von denen fast die Hälfte medizinische Behandlung 2suchen. Obwohl die Ätiologie der Unfruchtbarkeit vielfältig ist und in vielen Fällen multifaktoriell, die häufigste genetische Anomalie beim Menschen embryonale Aneuploidie 3 ist. Aneuploidie ist definiert als die Abweichung (Gewinn oder Verlust) der die richtige Anzahl an Chromosomen in einer Zelle. Das Phänomen der Aneuploidie in menschlicher Embryonen ist verbreitet und steigt mit dem mütterlichen Alter 4,5. Vier randomisierte kontrollierte Studien haben deutlich gemacht, dass den nutzen nur chromosomal normale (euploide) Embryonen für uterine Übertragung zu wählen, weil diese Strategie führte zu erhöhten Implantation Raten, niedrigere fehl- und eine kürzere Zeit für Schwangerschaft- 6,7,8,9zu erreichen. Daher haben Verständnis der Ätiologie der menschlichen Aneuploidie wichtige Implikationen in der assistierten Reproduktion.
Obwohl vor der Implantation Gentests für Aneuploidien bei unfruchtbarkeitbehandlungen vorteilhaft ist, fehlt noch ein gründliches Verständnis der wie Aneuploidien stammen. Es ist weithin anerkannt, dass es eine positive Korrelation von meiotischen Aneuploidien (entstanden während der Produktion von Gameten) und Alter der Mutter, aber einige Frauen anwesend embryonalen Aneuploidie-Preise, die von den Mittelkurs für ihre bestimmten Alter 4abweichen. Diese Fälle zeigen, dass Alter allein nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Andere Faktoren können eine Rolle bei der Erhöhung des embryonalen Aneuploidie, z. B. Genvarianten spielen.
Ein wesentlicher Aspekt den möglichen Beitrag der eine Genvariante, Aneuploidie während der Eizelle Meiose zu untersuchen ist, ein System für meiotische Genfunktion schnell bewerten zu entwerfen. Aufgrund der ethischen Einschränkungen und begrenzten Zugang ist es unpraktisch, diese Experimente mit menschlichen Eizellen. Diese Probleme können mithilfe der Maus Eizellen umgangen werden, und hier eine Reihe von Tests zu menschlichen Gens Funktion während der Meiose zu beurteilen sind ich beschrieben. Von microinjecting, die Boten-RNA (mRNA) Kodierung für die Genvariante von Interesse, die Lokalisierung des menschlichen Proteins in der Maus Ei visualisiert und verwendet, um festzustellen, ob die ektopische Expression des Wildtyp und mutierten menschlichen Proteins ergibt sich eine phänotypischen Veränderungen, die Aneuploidie führen könnte. Diese Phänotypen gehören eine Erhöhung der Mikrotubuli, die an die falsche Schwester Kinetochor und die Unfähigkeit, Chromosom Ausrichtung auf Metaphase der Meiose I. vor allem zu unterstützen, dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gewinn und Verlust der Funktion untersuchen genetische Varianten durch die Festlegung von bestimmter experimenteller Bedingungen wie herausfordern Schlüsselereignisse in Eizelle Meiose Spindel Gebäude und Chromosom Ausrichtung 10.

<table><tbody><tr><td>0,2 mL Seal-Rite PCR-Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1602-4300</td><td></td></tr><tr><td>1 kb DNA-Leiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0313</td><td></td></tr><tr><td>100 bp DNA-Leiter</td><td>Thermo Scientific</td><td>SM0243</td><td></td></tr><tr><td>6X DNA-Beladung Farbstoff</td><td>Thermo Scientific</td><td>R0611</td><td></td></tr><tr><td>9-Well-Glas-Spotplatte</td><td>Thomas Scientific</td><td>7812G17</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>Albumin aus Rinderserum&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3294&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alexa-Fluor-568 konjugiertes Anti-Maus-IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21050</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Alexa-Fluor-633 konjugiertes Anti-Human-IgG</td><td>Thermo Scientific</td><td>A21091</td><td>1:200 Verdünnung</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td></td><td>VWR AA0356</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Vibrationstisch</td><td>Technical Manufacturing Corp</td><td></td><td>jedes Standardmodell</td></tr><tr><td>Anti-Acetyliertes Tubulin Antikörper</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T7451</td><td>1:100 Diution</td></tr><tr><td>Anti-Zentromer (CREST) Antikörper</td><td>Antikörper Enthalten</td><td>15-234</td><td>1:30 Verdünnung&nbsp;</td></tr><tr><td>Barriere (Filter) Pipettenspitzen</td><td>Thermo Scientific</td><td>AM12635</td><td>Stellen Sie sicher, dass sie mit Ihren Pipettiermarken kompatibel sind. Diese sind mit Pipettierern der Marke Eppendorf kompatibel.</td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrierte Nährmedien: LB Agar, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0445-07-6</td><td></td></tr><tr><td>BD Difco Dehydrierte Nährmedien: LB Broth, Miller (Luria Bertani)</td><td>Fisher Scientific</td><td>DF0446-07-5</td><td></td></tr><tr><td>Kapillarschlauch</td><td>Sutter</td><td>B100-75-10</td><td></td></tr><tr><td>Center Well Organkulturschale</td><td>VWR</td><td>25381-141</td><td></td></tr><tr><td>CO2-Tank</td><td></td><td></td><td>Für Inkubator</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop</td><td>Zeiss</td><td></td><td>jedes Standardmodell</td></tr><tr><td>Zentrifuge (mit Kühlfähigkeit)</td><td>Thomas Scientific</td><td></td><td>jedes Standardmodell&nbsp;</td></tr><tr><td>Deckglas 11 x 22 mm</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663F10</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser</td><td>Thomas Scientific</td><td>6663-F10</td><td>Die Dicke variiert je nach Mikroskop</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>DEPC H20</td><td>Life Technologies</td><td>AM9922</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Trockenbad</td><td>Thermo Scientific</td><td>888700001</td><td></td></tr><tr><td>Easy A hoch Fidelity Klonierungsenzym</td><td>Agilent</td><td>600400</td><td>Für die DNA-Klonierung&nbsp;</td></tr><tr><td>Enzyme zur Linearisierung von pIVT</td><td>New England Biolabs</td><td></td><td>NdeI oder KasI können verwendet werden</td></tr><tr><td>Ethidiumbromid</td><td>Thermo Scientific</td><td>155585011</td><td></td></tr><tr><td>Fluoreszenzmikroskop&nbsp;</td><td></td><td></td><td>Jedes Fluoreszenzmikroskop kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Formaldehyd (37%)</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>9311</td><td></td></tr><tr><td>Formaldehyd-RNA-Ladefarbstoff</td><td>Ambion</td><td>8552</td><td></td></tr><tr><td>Frosted Mikroskop Slides (ungeladen) 25X75 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-Klone</td><td></td><td></td> in voller Länge <td>Kann von jedem Anbieter bezogen werden, der Open Reading liefert Rahmenklone</td></tr><tr><td>Gelelektrophoresegerät</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td>jedes Standardmodell</td></tr><tr><td>Glas Pasteur Pipets</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-200</td><td></td></tr><tr><td>Globin Forward Primer für pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- GAA GCT CAG AAT AAA CGC -3'.&nbsp; Kann von jedem Unternehmen erworben werden, das kundenspezifische Oligonucelotide herstellt</td></tr><tr><td>Globin Reverse Primer für pIVT Construct</td><td></td><td></td><td>5'- ATT CGG GTG TTC TTG AGG CTG G G -3' Kann von jedem Unternehmen erworben werden, das kundenspezifische Oligonucelotide herstellt</td></tr><tr><td>Haltepipetten</td><td>Eppendorf</td><td>930001015</td><td>Vacutip</td></tr><tr><td>Befeuchtete Kammer</td><td></td><td></td><td>Tupperware kann verwendet werden</td></tr><tr><td>Illustra Ready-To-Go RT-PCR-Beads</td><td>GE Life Sciences</td><td>27925901</td><td></td></tr><tr><td>Inkubator</td><td></td><td></td><td>Jedes Standardmodell mit CO2- und Wassermanteltechnologie</td></tr><tr><td>Inverses Mikroskop</td><td>Nikon-Instrumente</td><td></td><td>Jedes Standardmodell</td></tr><tr><td>Image J (NIH) Software</td><td>NIH</td><td></td><td>Bildanalysesoftware</td></tr><tr><td>Deckel der 96-Well-Platte</td><td>Nalgene Nunc International</td><td>263339</td><td></td></tr><tr><td>Geringe Adhäsion 0,5 mL Mikrozentrifgue-Röhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1405-2600</td><td></td></tr><tr><td>MacVector&nbsp;</td><td>MacVector</td><td></td><td>Sequenzanalysesoftware</td></tr><tr><td>MG132</td><td>Selleckchem</td><td>S2619</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-3&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Millenium RNA-Marker-Formaldehyd&nbsp;</td><td>Ambion</td><td>AM7151</td><td></td></tr><tr><td>Milrinone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4659</td><td>Resuspendierung in DMSO bei 2,5 mM</td></tr><tr><td>Mineralöl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5310</td><td>Nur verwendet embryogetestet, sterilfiltriert</td></tr><tr><td>Monastrol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8515</td><td>Resuspendierung in DMSO bei 100 mM</td></tr><tr><td>Mundstück</td><td>Biodiseno</td><td>MP-001-Y</td><td></td></tr><tr><td>N2 Tank</td><td></td><td></td><td>für Antivibrationstisch</td></tr><tr><td>Nagellack; Auswahl zurücksetzen</td><td></td><td></td><td>Jeder klare Nagellack kann verwendet werden</td></tr><tr><td>NanoDrop Microvolume UV-Vis Spektralphotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>jedes Standardmodell</td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Denaturierungsgel Puffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8676</td><td></td></tr><tr><td>NorthernMax 10X Laufpuffer</td><td>Life Technologies</td><td>AM8671</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS Laufpuffer</td><td>Thermo Scnentific</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>Organkulturschale 60x15mm</td><td>Life Technologies</td><td>08-772-12</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Polysciences, Inc.&nbsp;</td><td></td><td></td>577773</tr><tr><td>PCR Thermocycler</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 139 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>501V</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale 35 mm</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>121V</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, 60 mm</td><td>Falcon BD</td><td>351007</td><td></td></tr><tr><td>Picoinjector</td><td>XenoWorks Digital Microinjector</td><td></td><td>jedes Standardmodell</td></tr><tr><td>Pipettenabzieher</td><td>Flaming-Brown Mikropipettenabzieher</td><td>Modell P-1000</td><td></td></tr><tr><td>pIVT-Plasmid</td><td>AddGene</td><td>32374</td><td>Leerer Vektor, geeignet für die Eizellexpression.</td></tr><tr><td>Trächtige Stute Serum Gonadotropin</td><td>Lee BioSolutions</td><td>493-10</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep Kit</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td>Aufreinigung von bis zu 20 μl Plasmid-DNA</td></tr><tr><td>QIAquick PCR-Aufreinigungskit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Quikchange II Site Directed Mutagenese</td><td>Kit Agilent&nbsp;</td><td>200523</td><td>Mutagenese-Kit für Insertionen und Deletionen</td></tr><tr><td>Quikchange Lightning Multi-Site Directed Mutagenese Kit</td><td>Agilent&nbsp;</td><td>210512</td><td>Mutagenese-Kit für Veränderungen an einer einzelnen Stelle</td></tr><tr><td>Schere (feine Spitze)</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>14393</td><td></td></tr><tr><td>Schere (mittlere Spitze)</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>WP114225</td><td></td></tr><tr><td>Seal-Rite 1,5 mL Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>USA Scientific</td><td>1615-5500</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerwärmer</td><td></td><td></td><td>für jedes Standardmodell</td></tr><tr><td>Spektralphotometer (Nanotropfen)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-ONE-W</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td></td><td></td><td>beliebiges Standardmodell</td></tr><tr><td>Subklonierungseffizienz DH5a Kompetente Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientifc 18265017</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spritze</td><td>BD Bioscienes</td><td>309623</td><td>1 ml, 27G(1/2)</td></tr><tr><td>T4 DNA-Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>T7 mMessage Maschine mit hoher Ausbeute Kappen-RNA-Transkriptionskit</td><td>Life Technologies</td><td>AM1340</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>x-100</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>274348</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette (feine Spitze - Größe 5)</td><td>Feinwissenschaftliche Werkzeuge</td><td>SN.743.12.1</td><td></td></tr><tr><td>Ultrareines Dnase/Rnase-freies destilliertes Wasser</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>10977015</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure Ethidium Bromide 10mg/mL</td><td>Thermo Fisher Scientifc</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>UVP UV/White lite Transilluminator</td><td>Fisher</td><td>Scientific UV95041501</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

mit maus eizellen menschliche gen-funktion während der meiose zu beurteilen ich

Using Mouse Oocytes to Assess Human Gene Function During Meiosis I

Embryonalen Aneuploidie ist die große genetische Ursache der Unfruchtbarkeit beim Menschen. Stammen die meisten dieser Ereignisse während der weibliche Meiose, und wenn auch positiv korreliert mit dem mütterlichen Alter, Alter allein ist nicht immer prädiktiv für das Risiko eines aneuploiden Embryonen zu erzeugen. Daher könnten falsche Chromosom Abtrennung während Oogenese Genvarianten entfallen. Angesichts der Tatsache, dass Zugang zu menschlichen Eizellen für Forschungszwecke beschränkt ist, eine Reihe von Tests wurden entwickelt, um menschliche Gen-Funktion während der Meiose ich benutze Maus Eizellen untersuchen. Erstens sind Boten-RNA (mRNA) des Gens und Genvariante des Interesses in Prophase-verhaftet Maus Eizellen mikroinjiziert. Nachdem Sie Zeit für Ausdruck, Eizellen sind synchron freigesetzt meiotische Reifung Meiose abgeschlossen ich. Durch die Kennzeichnung der mRNA mit einer Abfolge von fluoreszierenden Reporter, wie grün fluoreszierendes Protein (Gfp), kann die Lokalisierung des menschlichen Proteins neben der phänotypischen Veränderungen beurteilt werden. Z. B. Gewinn oder Verlust der Funktion durch die Gründung der experimenteller Bedingungen, die das Genprodukt meiotischen Fehler beheben Herausforderung untersucht werden kann. Obwohl dieses System bei der Untersuchung von menschlichen Proteinfunktion während Oogenese vorteilhaft ist, sollten angemessene Interpretation der Ergebnisse durchgeführt werden, da die Proteinexpression auf endogene Ebenen nicht ist und, sofern nicht für (d.h. klopfte gesteuert heraus oder unten) sind murinen homologe auch im System vorhanden.

Nach in-vitro- haben Transkription hochwertige RNA eine A260/A280 Verhältnis (1,8-2,2) eine A260/A230 Verhältnis ≥1.7, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Das Bild in Abbildung 1 zeigt die Migration von in-Vitro-RNA auf einem denaturierenden Agarosegel nach Elektrophorese hergestellt. Eine Band, die verschmiert ist, Muster oder ein Beispiel, das hat mehrere große Bänder kann Verunreinigung oder Zerstörung der Probe angeben. Alternati...

Wie die genetischen Varianten, verbunden mit der menschlichen Krankheit beginnen, aufgedeckt zu werden, ist es immer wichtiger, Systeme, um schnell die biologische Bedeutung dieser identifizierten Varianten bewerten zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt Methoden zur Bewertung der menschlichen Genfunktion während weibliche Meiose ich benutze Maus Eizellen.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Embryonic aneuploidy is the major genetic cause of infertility in humans. Most of these events originate during female meiosis, and albeit positively ...

Das übergeordnete Ziel dieser Assay-Serie ist es, die Funktion des menschlichen Gens während der Meiose I mit Maus-Eizellen zu untersuchen. Diese Methoden können helfen, wichtige Fragen im Bereich der menschlichen Fortpflanzung zu beantworten, z. B. ob es eine genetische Veranlagung für mütterliche Aneuploidie gibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Maus-Eizellen als Modell für die Meiose von Säugetieren verwendet, was angesichts der Unzugänglichkeit menschlicher Eizellen für Genfunktionsstudien nützlich ist.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir die Exome von Frauen sequenzierten, die sich einer In-vitro-Fertilisation unterzogen hatten und deren embryonale Aneuploidieraten nicht durch ihr mütterliches Alter erklärt werden konnten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Bildanalyse schwer zu erlernen sind und die Definition strenger Analyseparameter der Schlüssel zu Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ist. Unter Verwendung einer validierten Klonierungsstrategie fügen Sie die kodierende Sequenz des interessierenden Gens in voller Länge in die multiple Klonierungsregion des In-vitro-Transkr

using-mouse-oocytes-to-assess-human-gene-function-during-meiosis-i

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Dieses Protokoll zeigt die Technik zur Gewinnung von Eizellen oder Early-Stage-befruchteten Embryonen aus dem Eileiter von Mäusen. Die Fähigkeit, die infindibulum identifizieren und legen Sie eine stumpfe Ende Nadel in ist es wichtig, richtig Durchführung des Verfahrens.

Retrieval von Maus-Oozyten

Eizellen sind anfällig für Aneuploidie aufgrund von Fehlern in Chromosomensegregation während meiotischen Reifung. Aneuploiden Eier können zu Unfruchtbarkeit, Fehlgeburten oder Entwicklungsstörungen wie dem Down-Syndrom. Hier beschreiben wir Methoden, um Material der Wahl in Oozyten und Methoden zur meiotischen Reifung zu studieren und zu bewerten Ploidie einzuführen.

Maus Oocyte Mikroinjektion, Reifung und Ploidie Beurteilung

Hier präsentieren wir ein Protokoll für spezifische siRNA-vermittelten mRNA-Abbau, gefolgt von Immunfluoreszenz-Analyse, um meiotische Spindel-Anordnung und Organisation in der Maus-Oozyten zu bewerten. Dieses Protokoll ist für die in vitro-Abreicherung von Transkripten und funktionale Bewertung verschiedener Spindel und / oder MTOC-assoziierten Faktoren in Oocyten.

Meiotischen Spindel Assessment in Maus-Oozyten von siRNA-vermittelte Silencing

Wir präsentieren Protokolle für die Entnahme, Aufbereitung und Bildgebung von reifen Drosophila-Eizellen. Diese Methoden ermöglichen die Visualisierung des Chromosomenverhaltens sowie des Spindelaufbaus und der Funktion während der Meiose.

Techniques for Imaging Prometaphase und Metaphase der Meiose I in fester<em&gt; Drosophila</em&gt; Oozyten

Oogenese bei Säugetieren ist bekanntermaßen anfällig für Fehler, vor allem auf Chromosom Missegregation. Dieses Manuskript beschreibt Chromatin verteilt Präparationsmethoden für Maus Prophase, Metaphase I und II inszeniert Eizellen. Diese grundlegenden Techniken ermöglichen die Untersuchung der Chromatin-gebundene Proteine und Chromosom Morphologie in Säugetieren Oogenese.

Chromatin verteilt die Vorbereitungen für die Analyse der Maus Eizelle Progression von Prophase, Metaphase II

Es wird ein optimiertes Protokoll vorgestellt, das die Depletion zytoplasmatischer Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen während der Metaphase I mit einem Nahinfrarot-Femtosekundenlaser ermöglicht.

Multiphotonen-Laserablation von zytoplasmatischen Mikrotubuli-Organisationszentren in Maus-Eizellen

Fehler in der Chromosomentrennung sind ein häufiges Merkmal bei Eizellen. Daher gibt die Untersuchung des Spindelanordnungs-Checkpoints wichtige Hinweise auf die Mechanismen, die zur Produktion gesunder Eier erforderlich sind. Das vorliegende Protokoll beschreibt drei komplementäre Assays zur Beurteilung der Integrität des Spindelaufbau-Checkpoints in Maus-Oozyten.

Evaluation der Integrität des Spindel-Assemblierungs-Checkpoints in Maus-Eizellen

Die Aufrechterhaltung der Integrität des Eizellgenoms ist notwendig, um die genetische Genauigkeit des resultierenden Embryos zu gewährleisten. Hier stellen wir ein genaues Protokoll zum Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in weiblichen Keimzellen von Säugetieren vor.

Nachweis von DNA-Doppelstrangbrüchen in Maus-Eizellen

Dieses Protokoll bietet einen experimentellen Rahmen, um den physikalischen Einfluss des Zytoskeletts auf die Kernform und die inneren membranlosen Organellen im Eizellsystem der Maus zu dokumentieren. Das Framework kann für die Verwendung in anderen Zelltypen und Kontexten angepasst werden.

Erfassung der zytoskelettbasierten Agitation des Maus-Eizellkerns über räumliche Skalen hinweg

Meiotische Fehler in Synapsen und Rekombination sind bei Säugetier-Eizellen üblich. Eine rigorose Analyse der Proteine, die an diesen Prozessen beteiligt sind, ist unerlässlich, um zu verstehen, wie und warum die Oogenese oft schief geht. Die hier vorgestellten Techniken ermöglichen ein umfassendes Monitoring von Rekombination und Synapsen, um die Eizellqualität bei Mäusen zu bewerten.

Präparation meiotischer Chromosomenspreizungen aus Maus-Eizellen zur Beurteilung von Synapse und Rekombination

Erfahren Sie, wie menschliche Genfunktion während der Meiose I mit Maus-Eizellen untersucht wird. Diese Methode hilft bei der Erforschung genetischer Prädispositionen für mütterliche Aneuploidie.

Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

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