Mit Maus Eizellen menschliche Gen-Funktion während der Meiose zu beurteilen ich

Das übergeordnete Ziel dieser Assay-Serie ist es, die Funktion des menschlichen Gens während der Meiose I mit Maus-Eizellen zu untersuchen. Diese Methoden können helfen, wichtige Fragen im Bereich der menschlichen Fortpflanzung zu beantworten, z. B. ob es eine genetische Veranlagung für mütterliche Aneuploidie gibt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie Maus-Eizellen als Modell für die Meiose von Säugetieren verwendet, was angesichts der Unzugänglichkeit menschlicher Eizellen für Genfunktionsstudien nützlich ist.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erstmals, als wir die Exome von Frauen sequenzierten, die sich einer In-vitro-Fertilisation unterzogen hatten und deren embryonale Aneuploidieraten nicht durch ihr mütterliches Alter erklärt werden konnten. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte der Bildanalyse schwer zu erlernen sind und die Definition strenger Analyseparameter der Schlüssel zu Genauigkeit und Reproduzierbarkeit ist. Unter Verwendung einer validierten Klonierungsstrategie fügen Sie die kodierende Sequenz des interessierenden Gens in voller Länge in die multiple Klonierungsregion des In-vitro-Transkriptionsvektors ein.

Mutagenisieren Sie die DNA, wenn Einzelnukleotid-Polymorphismen oder Insertionen und Deletionen erzeugt werden, wie im Textprotokoll beschrieben. Wandeln Sie als Nächstes die mutagenisierte DNA in einen bakteriellen Wirt um. Verwenden Sie ein Kit, um das Plasmid gemäß den Anweisungen des Herstellers zu isolieren und zu reinigen.

Linearisieren Sie dann die Endprodukte mit Hilfe des Enzymverdaus der gereinigten DNA mit einer einzigen Restriktion. Reinigen Sie das verdaute Produkt mit einem validierten DNA-Aufreinigungsprotokoll oder einem Kit. Und eluieren Sie in 30 Mikrolitern RNase/DNase-freiem Wasser.

In vitro transkribieren Sie DNA mit T7-Polymerase gemäß dem Protokoll des Herstellers. Zum Schluss reinigen und eluieren Sie RNA in 30 Mikrolitern RNase/DNase-freiem Wasser mit einem Spin-Säulen-basierten Nukleinsäure-Aufreinigungskit mit Kieselsäurematrix gemäß dem Protokoll des Herstellers. Teilen Sie die Eizellen für die Mikroinjektion in gleiche Gruppen ein.

Mikroinjizieren Sie eine Gruppe mit experimenteller mRNA und die andere Gruppe mit den Wildtyp-Kontroll-NPBs oder GFP-mRNA. Mit einem hand- oder mundbetriebenen Pipettiergerät, bei dem die Glaspipettenöffnung etwas größer als der Durchmesser einer Eizelle ist, werden die Eizellen in einen 100-Mikroliter-Tropfen milrinonfreies Kulturmedium in eine Petrischale überführt, die mit Mineralöl in Embryoqualität bedeckt ist. Inkubieren Sie die Eizellen dann sieben Stunden lang bei 37 Grad Celsius in 5 % CO2, um eine ausreichende Reifung bis zur Metaphase der Meiose I zu ermöglichen.Nach der Inkubation verwenden Sie dieselbe Pipettenvorrichtung, um die Eizellen in eine Organkulturschale in der Mitte zu überführen, die 700 Mikroliter vorgekühltes MEM-Sammelmedium in der mittleren Vertiefung und 500 Mikroliter Wasser im äußeren Ring enthält.

Stellen Sie die Schüssel sieben Minuten lang auf Eis. Fixieren Sie die Eizellen, indem Sie sie in eine Vertiefung einer Klarglas-Spotplatte mit 400 Mikrolitern 2%Paraformaldehyd in 1x PBS umfüllen. 20 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Nach der Immunfärbung, wie im Textprotokoll beschrieben, werden die Eizellen mit einem 40- bis 63-fachen Objektiv an einem konfokalen Mikroskop abgebildet. Erfassen Sie kleine Schritte in der Z-Ebene, die für das Arbeitsziel optimiert ist, und bilden Sie den gesamten Bereich der Metaphase-Spindel ab. Um den Status des Kinetochor-Mikrotubuli-Anhangs zu ermitteln, öffnen Sie zunächst das Bild, indem Sie die Datei in die ImageJ-Symbolleiste ziehen.

Navigieren Sie in der geöffneten Z-Serie zum Dropdown-Menü Bild und klicken Sie auf der Unterregisterkarte Farbe auf Kanäle zusammenführen, um alle Kanäle sichtbar zu machen. Es ist wichtig, dass der Analytiker damit vertraut ist, welche Art von Bindungen an Kinetochore in Maus-Eizellen möglich sind. Die Qualität des Bildes hat einen großen Einfluss auf Ihre Fähigkeit, diese Daten richtig zu analysieren.

Bewegen Sie sich mit dem Umschalter am unteren Rand des Bildes durch die einzelnen Z-Schichten, und bestimmen Sie den Kinetochor-Mikrotubuli-Ansatz. Die Eizellen werden mit demselben Pipettengerät in einen 100-Mikroliter-Tropfen milrinonfreies Nährmedium unter Öl überführt. Inkubieren Sie die Eizellen sieben Stunden lang, um eine ausreichende Reifung bis zur Metaphase der Meiose I wie bisher zu ermöglichen.

Übertragen Sie dann die Eizellen in eine Organkulturschale in der Mitte, die 700 Mikroliter Kulturmedium enthält, das Monastrol in der mittleren Vertiefung und 400 Mikroliter Wasser im umgebenden Ring enthält. Inkubieren Sie zwei Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Spülen Sie das Monastrol aus, indem Sie die Eizellen durch drei Tropfen à 100 Mikroliter CZB-Nährmedium übertragen.

Dann werden die Eizellen in eine neue Organkulturschale in der Mitte überführt, die 700 Mikroliter Kulturmedium plus Proteasominhibitor im Mittelring enthält. Geben Sie 400 Mikroliter Wasser in den äußeren Ring und inkubieren Sie drei Stunden lang. Als nächstes fixieren Sie die Eizellen, indem Sie sie 20 Minuten lang bei Raumtemperatur in eine Vertiefung einer Klarglas-Spotplatte mit 400 Mikrolitern 2%-Paraformaldehyd in PBS geben.

Nehmen Sie die Eizellen mit einem 40- bis 63-fachen Objektiv an einem konfokalen Mikroskop ab, erfassen Sie weniger als ein Mikrometer große Schritte in der Z-Ebene und stellen Sie sicher, dass der gesamte Bereich der Metaphase-Spindel abgebildet wird. Um den Status der Chromosomenausrichtung zu ermitteln, öffnen Sie die Bilddateien mit einer Bildgebungssoftware. Ziehen Sie dann das Bild in die ImageJ-Systemsteuerung.

Verwenden Sie in der geöffneten Z-Serie das Punktwerkzeug, um Punkte am Ende jedes Spindelpols in der jeweiligen Z-Schicht zu markieren, indem Sie das Werkzeug über den Spindelpol im Bild legen und auf das Bild klicken. Fügen Sie diese Punkte zum ROI-Manager hinzu, indem Sie gleichzeitig die Befehlstaste und die T-Taste auf der Tastatur drücken. Bestimmen Sie die spezifischen Koordinaten für jede der eingestellten Positionen, indem Sie den spezifischen Punkt im ROI-Manager markieren und auf die Schaltfläche Messen klicken.

Dadurch wird eine Ergebnistabelle mit X- und Y-Koordinaten für jeden Punkt bereitgestellt, bei denen es sich um die Punkte X1, Y1 und X1 bzw. Y2 handelt. Bestimmen Sie als Nächstes die wahre Z-Koordinate. Dies geschieht durch Multiplikation der Schichtnummer der spezifischen Z-Scheibe im Z-Stapel, in der der Spindelpol durch die Stapeldicke identifiziert wurde.

Dabei handelt es sich um die Punkte Z1 und Z2. Bestimmen Sie die Spindellänge anhand der Satzgleichung des Pythagoras mit den zuvor definierten X-, Y- und Z-Koordinaten. Bestimmen Sie als Nächstes die Mittelzone der Spindel.

Diese wird als 1/2 der Länge der Spindel berechnet. Klicken Sie auf das Liniensymbol in der ImageJ-Symbolleiste und zeichnen Sie eine Linie, die von einem Spindelpol bis zur Spindelmitte verläuft. Die Länge wird in der ImageJ-Symbolleiste angezeigt.

Die Definition strenger Parameter für die Chromosomenausrichtung ermöglicht eine robuste quantitative Analyse, die für die Reproduzierbarkeit der Daten wichtig ist. Bestimmen Sie den Status der Chromosomenausrichtung, indem Sie den Chromosomenabstand von der Spindelmittelzone mit dem Linienmesswerkzeug bewerten. Klicken Sie auf das Liniensymbol in der ImageJ-Symbolleiste und ziehen Sie eine Linie von der Spindelmittelzone zum Chromosom.

Die Länge wird in der ImageJ-Symbolleiste angezeigt. Chromosomen, die mehr als vier Mikrometer von der Spindelmittelzone entfernt sind, gelten als nicht ausgerichtet. Nachdem die Eizellen einer Immunfärbung und Bildgebung unterzogen wurden, können korrekte Mikrotubuli-Kinetochor-Anhaftungen beurteilt werden.

Bei einer normalen Bindung ist jedes Schwester-Kinetochor-Paar des bivalenten Paares von gegenüberliegenden Polen an Spindel-Mikrotubuli befestigt. Es können bis zu drei verschiedene Arten von abnormalen Anhaftungen beobachtet werden. Ein Beispiel tritt auf, wenn keine Mikrotubuli mit dem Kinetochor in Kontakt kommen.

Alternativ können Mikrotubuli falsch binden, wodurch syntelische oder merotelische Bindungen entstehen. Syntelische Attachments bilden sich, wobei beide Paare von Schwester-Kinetochoren an Mikrotubuli befestigt sind, die von einem einzigen Pol ausgehen. Merotelische Attachments treten auf, wenn die Schwester-Kinetochore in einem Paar an gegenüberliegenden Polen befestigt sind.

Nachdem sich die Eizellen von der induzierten Fehlausrichtung erholt haben, wird die Fähigkeit der Chromosomen, sich neu auszurichten, durch bildgebende Verfahren beurteilt. In diesem Beispiel wird ein bivalentes Chromosom als falsch ausgerichtet betrachtet, da es sich mehr als vier Mikrometer von der Spindelmittelzone entfernt befindet. Bei der Auswahl des Assays, der für die Beurteilung der Funktion von Genvarianten geeignet ist, ist es wichtig, zu bedenken, dass die untersuchten menschlichen Genvarianten überexprimiert werden und dass die endogenen Maushomologe möglicherweise gleichzeitig depletiert werden müssen.

Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie CRISPR-Cas9 zur Erzeugung humanisierter Mausstämme durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, z. B. um zu verstehen, wie die Genvariante die Qualität von Eizellen und Embryonen beeinflusst und ob sie sich auf die reproduktive Gesundheit des Individuums auswirkt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Reproduktionsgenetik, um andere ursächliche Faktoren für die mütterliche Aneuploidie beim Menschen zu erforschen. Die Genidentifikation könnte eine leistungsfähige Diagnostik und eine Grundlage für Studien zur Korrektur von Aneuploidien liefern.

Danke für das Aufpassen. Viel Glück bei Ihren Experimenten.