Name: Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-30T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Lernen Sie die Isolierung primärer humaner Deziduazellen aus fetalen Membranen der reifen Plazenta. Diese Methode ermöglicht hochwertige Zellpräparationen für reproduktionsbiologische Forschung und Schwangerschaftsstudien.

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Die Autoren möchten den Spendern, die RCWIH-BioBank und der Mount Sinai Hospital/UHN Abteilung für Geburtshilfe und Gynäkologie für die menschliche Exemplare in dieser Studie verwendeten danken. Wir möchten den Mitgliedern des Lauge Labor, insbesondere Dr. Caroline Dunk für ihre Hilfe bei der Methodenentwicklung danken. Diese Arbeit wird von der Burroughs-Willkommen-Fonds (Grant #1013759) unterstützt.

Plazentas werden aus gesunden Begriff nicht in Arbeit Frauen elektiven Kaiserschnitt gesammelt. Die Sammlung, Verarbeitung und des humanen Proben Einweg Befolgen der Richtlinien des Mount Sinai Hospital Ethics Board. Jeder Patient ist eine schriftliche Einwilligung eingeholt. Diese Studie wird durch das Research Ethics Board am Mount Sinai Hospital genehmigt.
1. Vorbereitungen
Hinweis: Alle Schritte müssen durchgeführt werden, unter einer Abzugshaube und alle chirurgische Geräte per Autoklav vor der Platzierung in der Dunstabzugshaube sterilisiert werden muss. Alle anderen Materialien (50 mL-Tuben, Flaschen, etc.) müssen mit 70 % Ethanol sterilisiert werden. Immer jederzeit tragen persönlicher Schutzausrüstung bei der Arbeit mit biogefährlichen Abfällen (Kittel, Handschuhe, lange Haare zurück gebunden, etc.).
<ol><li>
Enzymatische Verdauung Lösung (endgültige Lösung: 200 mL)
	<ol>
<li>180 mL HBSS - Pipette / - in einen 500-mL-Becherglas, sterile rühren Magnet hinzufügen und platzieren Sie auf Platte bei Raumtemperatur rühren.</li>
		<li>Abwiegen und fügen Sie Folgendes zum HBSS/Lösung langsam und sequenziell: 20 mL FBS, 400 mg Kollagenase 2 ([final] = 2 mg/mL), 20 mg Soja-Bohne-Trypsin-Inhibitor ([final] = 0,1 mg/mL), 30 mg DNase-1 ([final] = 0,15 mg/mL), und 200 mg BSA ([final] = 1 mg/mL)</li>
		<li>Das Rühren auf mittlerer Geschwindigkeit festgelegt und lassen Sie die Mischung für 10-20 min (Abdeckung mit Zinn Folie oder Paraffin Film unter Rühren) gerührt.</li>
		<li>Gießen Sie die gemischte Lösung in einer 250 mL-Glasflasche mit einem Kunststoff-Trichter und in der Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Übergeben Sie die Lösung durch ein Kunststoff Top Filteranlage (0,22 μm Membranfilter, 500 mL), aliquoten 20 mL in 50 mL Tuben (insgesamt 10 Rohre) und Speicher bei-20 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RPMI 1640 Medien (2 % Lösung und 10 % komplette Wachstumsmedium waschen)
	<ol>
<li>RPMI 1640 und FBS in einer Glasflasche in der Dunstabzugshaube zu kombinieren.</li>
		<li>Kombinieren Sie für 2 % FBS Lösung 490 mL RPMI 1640 und 10 mL FBS.</li>
		<li>Kombinieren Sie für 10 % FBS Lösung 450 mL RPMI 1640 und 50 mL FBS.</li>
		<li>Pipette 500 μL des Normocin in der 500 mL Flasche aus dem vorherigen Schritt mit RPMI Medien und FBS (50 mg/mL Brühe, 0,05 mg/mL arbeiten Konzentration).</li>
		<li>Übergeben Sie Medien über eine 0,22 μm Membranfilter und speichern in einer 500 mL-Glasflasche bei 4 ° C bis zur Verwendung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>30 min vor Beginn des Experiments Platz eine 20 mL Aliquot der enzymatischen Verdauung Lösung in einem 37 ° C Perle Bad eingefroren, Platz 2 % FBS und 10 % FBS RPMI 1640 Medien in einem 37 ° C Perle Bad, schalten die rockigen Wasserbad und auf 37 ° C , 2 g und Satz einer Zentrifuge kontrollierter Temperatur um 4 ° C.</li>
</ol>2. Sammlung von Deziduale Gewebe aus Begriff Plazentar Membranen
<ol><li>Stellen Sie Flaschen mit HBSS + / +, HBSS-/- und fünf 50 mL Röhrchen in einem Rack unter dem Abzug. Pipette 25 mL HBSS + / + in eine Röhre.</li>
	<li>
Herausnehmen Sie die Begriff Plazenta mit behandschuhten Händen aus dem Behälter für den Transport vom OP-Saal Theater verwendet. Die Plazenta auf das Windel-Pad (mütterliche Seite nach oben) und verteilen Sie die fetalen Membranen, mit Schere und Pinzette.
	<ol>
<li>Legen Sie überlappende Windel-Pads auf der Dunstabzugshaube.</li>
		<li>Verwenden Sie eine separate Windel, um die Plazenta zu kippen, so dass die mütterliche Seite aufgedeckt ist.</li>
		<li>Finden Sie den Punkt des Bruches der Membran und Schnitte um die Membran zu nicht entfalten und flach auf der Oberfläche des Fumehood zu ermöglichen. Hinweis: Sobald die Membran aus der Plazenta zurück gezogen wird, werden die Dezidua aufgedeckte ruht auf dem Chorion-Layer mit der Amnion-Schicht auf der Rückseite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Mit einem Schaber Kunststoff Zelle vorsichtig kratzen das deziduale Gewebe aus dem Chorion und in der 50 mL-Tube mit 25 mL HBSS + / +.</li>
	<li>Kratzen Sie die Membran mit mäßigem Druck. Gelten Sie nicht zu viel Druck, wie es Chorion Kontamination führen kann. Sammeln Sie kleine Blutgerinnsel sowie, als diese einige deziduale Zellen enthalten. Achtung: Nach deziduale Sammlung, Plazenta muss verpackt in einem Plastikeimer Biohazard und im Eisschrank vor der entsprechenden Entsorgung (nach Ihren institutionellen Regeln)-20 ° C eingefroren. Blutige Windel Pads müssen in einer Dichtung-Dichte Plastiktüte verpackt und in ein Biohazard-Safe entsorgt werden.</li>
</ol>3. Waschen und enzymatische Verdauung des Deziduale Gewebes
<ol><li>Waschen Sie die gesammelten Gewebe indem sanft die 50 mL-Tube von hand schütteln und durch ein 250 μm metallsieb (250 μm, Größe 60 Mesh) ruhen auf einem sterilen Probe (Urin) Container übergeben.</li>
	<li>Wiederholen Sie das Waschen zweimal mit HBSS + / + und zweimal mit HBSS-/ - in frischen Rohre für jede Wäsche. (Finale wäscht mit HBSS-/-ermöglicht die Entfernung von Calcium und Magnesium in HBSS vorhanden + / +, die wäre sonst mit der folgenden enzymatische Verdauung stören). HINWEIS. Während die Waschschritte werden Chorion Gewebe Kontamination offensichtlich, als das deziduale Gewebe ist hellrosa Farbe und amorph, während das Chorion ist weiß, dicht und strähnig. Chorion Kontamination kann daher leicht mit der Pinzette entfernt werden.</li>
	<li>Optional, wenn das deziduale Gewebe dick ist, überträgt es auf eine sterile 10 cm Durchmesser Petrischale und gehen Sie zum Zerkleinern des Gewebes mit zwei gegnerischen Skalpelle in der Schale.</li>
	<li>
Legen Sie das gewaschene Gewebe in sterilen 50 mL-Tube mit 100 mg von Gewebe/mL enzymatische Verdauung Lösung (siehe Vorbereitungen).
	<ol>
<li>Als Bezugspunkt sicherzustellen Sie, dass die deziduale Gewebe zur 5-10 mL-Markierung auf die 50 mL Tube erreicht.</li>
		<li>Verwenden Sie ca. 20 mL der enzymatischen Verdauung Lösung (vorbereitet in Schritt 1.1), die insgesamt Dezidua gesammelt von einer gesamten Laufzeit fetalen Membran zu verdauen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Versiegeln Sie die Kappe des Rohres mit dem Paraffin-Film (die Röhre verschließen und wickeln Paraffin Film rund um die Kappe und die Oberseite des Rohres) unter die Kultur Haube und inkubieren Sie deziduale Gewebe bei 37 ° C für 20 min in einem schütteln Wasserbad (145 u/min 2 g).</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Inkubation den Paraffin-Film zu und Sterilisieren Sie die Oberfläche des Rohres, die verdaute Gewebe mit 70 % Ethanol enthält und unter dem Abzug zu bringen. Schütteln Sie das Rohr von hand kurz.</li>
	<li>Sammeln Sie Zellsuspension durch metallsieb (250 μm, Größe 60 Mesh) in einen neuen sterilen Probe Behälter. Verdünnen Sie mit ein gleiches Volumen (20 mL) von RPMI + 10 % FBS mit 0,1 % Normocin enzymatische Reaktion zu stoppen. Gehen Sie direkt zu Zentrifugationsschritt 4.1.</li>
	<li>Bei Bedarf setzen Sie die restliche unverdaute Gewebe wieder in eine neue 50 mL-Tube mit 20 mL frische enzymatische Verdauung Lösung und wiederholen Sie Verdauung (20 min, 37 ° C, schütteln Wasserbad) zu.</li>
	<li>Wenn eine zweite Verdauung notwendig ist, legen Sie das erste Rohr mit Zellsuspension auf Eis (Abdeckung mit Paraffin-Film steril zu halten). Wiederholen Sie die Schritte 3,5-3,6 und kombinieren Sie die zwei Zellen-Suspensionen.</li>
</ol>(4) erzeugen eine einzelne Zelle Suspension
<ol><li>Zentrifugieren der Zellsuspension (420 g, 4 ° C, 11 min.).</li>
	<li>Entfernen Sie den überstand und Aufschwemmen der Zellen in 40 mL RPMI + 2 % FBS mit 0,1 % Normocin ("Waschpuffer"). Hinweis: Zelle Pellets werden lose und wegen der roten Blutzelle Verschmutzung gallertartig, Aspirieren überstand mit Vorsicht. Entfernung der oberen Phase mit einer manuellen Pipette kann erforderlich sein.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Zentrifugation bei 420 g bei 4 ° C für 11 min.</li>
	<li>Sorgfältig entfernen des Überstandes (wie in Anmerkung Schritt 4.2 erwähnt) und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 5 mL Waschpuffer und 35 mL Erythrozyten Lyse Puffer im gleichen Rohr. Hinweis: Wenn das Diabolo groß oder sehr blutig ist, kann es in zwei Röhren für den Erythrozyten Lyse Schritt aufgeteilt werden durch Hinzufügen von 10 mL Waschpuffer und Teilen gleich in zwei Röhren und dann 35 mL Erythrozyten Lyse Puffer für jedes Rohr.</li>
	<li>Inkubation auf Eis für 20 min. kurz Wirbel Tube(n) am Anfang und am Ende der Inkubation, die roten Blutkörperchen lysiert.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie bei 420 g für 11 Minuten bei 4 ° C.</li>
	<li>Sorgfältig, überstand zu entfernen und das Pellet in 40 mL Waschpuffer aufzuwirbeln.</li>
	<li>Durchlaufen Sie die Zellen einen 70 μm Nylon Filter, Zelle Klumpen zu entfernen.</li>
	<li>Zentrifuge bei 420 g für 11 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Entfernen den überstand und Aufschwemmen der Zelle Pellet in 10 mL komplette Medium (RPMI 10 % + FBS mit 0,1 % Normocin).</li>
	<li>
Anzahl Zellen mit Hilfe der Trypan blau Farbstoff-Ausschlußverfahren Hemocytometer wie unten beschrieben:
	<ol>
<li>Unter der Haube Kultur pipette vorsichtig Zellsuspension nach oben und unten 3 X um gründlich vor dem kombinieren mit Trypan blau mischen. In einer 1,5 mL Tube bereiten Zellsuspension, verdünnt 1:2 (Mähdrescher 20 μL Trypan blau-Lösung) und 20 μL deziduale Zellsuspension. Mischen Sie durch nach oben und unten ein paar Mal (diese Lösung ist nicht steril) pipettieren Trypan blau-Zelle Lösung sorgfältig.</li>
		<li>Platzieren Sie die Hemocytometer auf der Bühne des Mikroskops mit Glas Deckglas an der Spitze. Hinweis: Hemocytometer ist ein Mikroskop-Objektträger mit Gitter drauf, neun große Quadrate geteilt durch drei Linien geben. Jedes große Quadrat hat eine Fläche von 1 mm2, und die Flüssigkeit in der Kammer beträgt 0,1 mm. Daher ist das Volumen der Flüssigkeit, die jedes große Quadrat füllen kann 1 mm * 1 mm * 0,1 mm = 0,1 mm3= 10-4 mL.</li>
		<li>Fügen Sie 10 μL der Trypan blau-Zelle Mischung langsam in die Nut des Hemocytometer, so dass Kapillarwirkung zu zerstreuen die Zelle-Mischung über die gesamte Folie (Stop bevor Mischung gut ausfüllt hinzu)</li>
		<li>Sehen Sie die Zellen unter dem Mikroskop (bei 10 X Vergrößerung) und zählen Sie alle weiß/grün-Zellen, die Trypan blau (diese sind der lebensfähigen Zellen) in den vier großen äußeren Quadraten von der Hemocytometer ausschließen. Wenn Zellen zählen, die die Linie berühren, zählen Sie nur diejenigen die Note der rechten und oberen Zeilen, nicht aber die Berührung der linken und unteren Zeilen. Zählen Sie nicht Dunkele blaue Zellen; blauer Farbe weist darauf hin, dass die Zelle tot ist, wie Trypan blau färben leicht über die Plasmamembran in das Zytoplasma eindringen kann.</li>
		<li>Berechnen Sie die Anzahl der lebensfähigen Zellen in 1 mL Zellsuspension (X): <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/57443/57443eq1v2.jpg"> 2 = Verdünnungsfaktor 10.000 = Umrechnungsfaktor (1 mL = 1 cm3 = 10, 000 * 0,1 mm3)</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deziduale Zellen auf eine wünschenswerte Endkonzentration in RPMI + 10 % verdünnen FBS (Wachstumsmedium). Hinweis: Für Gewebekultur Plating, pipette 2 * 106 Zellen/Brunnen in einen Kunststoff 6-Well-Platte, 10 * 106 Zellen in einer 10-cm-Kunststoffplatte oder 75.000 zu einem Glas deckgläschen.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben

Das hier beschriebene Protokoll zeigt eine Kosten- und Zeit effektive Methode zur Isolierung von primärer deziduale Zellen gesammelt aus den fetalen Membranen des ganzen menschlichen Begriff plazentas, sehr zugänglich und unkompliziert ist. Der Erfolg dieses Protokolls ist abhängig von zwei entscheidende Faktoren, (1) die Effizienz der deziduale Schaben aus dem Chorion-Layer die fetalen Membranen und (2) die Pflege, mit der die deziduale Zellen im gesamten Protokoll behandelt werden. Es ist wichtig, dass Chorion Gewebe K...

Das Endometrium, eines der aktivsten erwachsenen weiblichen Gewebe durchläuft dramatischen Umbau jedes Menstruationszyklus in Reaktion auf die Stimulation durch Eierstockhormone, Östrogen (E2) und Progesteron (P4). Die Decidua, auch bekannt als die schwangere Endometrium, ist ein entscheidender Bedeutung reproduktives Gewebe, das durch das Ende der postovulatorischen Phase infolge P4-driven Differenzierung nach der E2-dominante proliferative Phase entsteht. Deziduale Zellen sind verantwortlich für die Sekretion von hormonellen Faktoren für eine erfolgreiche Blastozyste Implantation und für die Entwicklung der Utero-plazentaren Schnittstelle für die Aufrechterhaltung der mütterlichen Toleranz gegenüber der fetale Allograft.
Decidualization ist für die Implantation und die anschließende Umgestaltung der deziduale Spirale Arterien erforderlich. Endometriale Stromazellen Zellen durchlaufen Decidualization, unter der Kontrolle der P4 und Lager, während der späten luteal Phase des Menstruationszyklus1. Dieser Prozess ist rund um die Blutgefäße und breitet sich im ganzen das Stroma, was seine Rolle im Gefäßsystem Umbau und Leukozyten Menschenhandel Verordnung eingeleitet. Diese zellulären Transformation zeichnet sich durch eine kreisförmige Morphologie, erhöhte Kerngröße und Erweiterung des rauen endoplasmatischen Retikulum und Golgi-Apparat2. Decidualized Stromazellen Zellen sind in der Lage, Parakrine Faktoren unterstützen die Einnistung der Blastozyste und zeichnet sich durch die Ausschüttung zahlreicher Hormone (z. B. Prolaktin), angiogene Wachstumsfaktoren, Insulin Wachstumsfaktor binding Protein-1 (IGFBP-1), Prostaglandin (PG) E (Stimulator der intrazellulären cAMP), Zytokine, Komponenten der extrazellulären Matrix und Nährstoffe essentiell für plazentare Einnistung und Entwicklung3,4,5,6 .
Die deziduale Zellpopulation besteht nicht nur aus decidualized Stromazellen Zellen enthält aber auch große, Schwangerschaft-spezifische deziduale Leukozyten Populationen. Decidualization beinhaltet die transiente lokalisierte Ödeme und Zustrom von natürlichen killer (NK)-Zellen, T-Zellen, Dendritische Zellen und Makrophagen. Die größten Leukozyten Teilgesamtheit ist die uterinen NK-Zellen, bestehend aus ca. 50-70 % aller mütterlichen Leukozyten infiltrieren die Dezidua die eine Quelle von Zytokinen und angiogenen Faktoren, die möglicherweise Hilfe bei der Decidualization-Prozess und Zunahme der Anzahl in der gesamten Schwangerschaft7. Makrophagen, wird die zweitgrößte Subpopulation von Immunzellen, befinden sich rund um den Implantationsort und während der Schwangerschaft8erhöhen. Sie sind eine Quelle von Zytokinen und Wachstum Faktoren wie Kolonie stimulierende Faktor (CSF-1)9, Tumor-Nekrose-Faktor α (TNF)10 und Prostaglandin (PG) E11.
Während der gesamten Schwangerschaft und vor der Wehentätigkeit ist der Dezidua eine Hauptquelle der Zytokine und Chemokine verantwortlich für mütterliche peripheren Leukozyten-Aktivierung und anschließende Migration in die Gebärmutter Gewebe, Arbeit zu initiieren. Tierstudien zeigten, dass zahlreiche Pro-inflammatorischen Zytokinen bis in die Maus Dezidua geregelt während der wehen, wie TNF-a, IL-6, IL-12 und IL-1 b12. In der menschlichen Dezidua weisen Pro-inflammatorische Zytokine IL-1 b, IL-6 und IL-8 (große Neutrophilen lockstoffgradient) höheren Ausdruck während der Wehen im Vergleich zu nicht im Labor13. Diese Zytokine führen zu einer Aktivierung und Zustrom von Leukozyten in deziduale Gewebe14abgesondert; eine Zunahme der deziduale Makrophagen und Neutrophilen Infiltration in der Mensch und Ratte ist während der Wehentätigkeit, mit deziduale Infiltration vor Myometrial 4-fach größer ist, zeigt eine Kaskade von Aktivierung zwischen diese zwei benachbarte uterine Gewebe gesehen. 15. diese infiltrieren Leukozyten produzieren PGs in der Lage, synchrone Kontraktionen der Gebärmutter16zu aktivieren, Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) Membran initiieren Bruch17,18, sowie Pro-inflammatorischen Zytokinen, die uterine Aktivierung ("Zytokin-Sturm") zu verstärken.
Während können verschiedene Krankheiten durch viele wichtige Funktionen von deziduale Zellen, wie spielen eine entscheidende Rolle bei der Implantation Aufrechterhaltung mütterlich fötalen Toleranz in der frühen Schwangerschaft und die Teilnahme an der Aktivierung der Arbeit am Begriff auftreten. Schwangerschaft. (1) Unfruchtbarkeit aufgrund von wiederkehrenden Implantation Scheitern und wiederkehrende schwangerschaftverlust kann beispielsweise nach einem Ausfall der deziduale Reifung führen; (2) intrauterine Wachstumsretardierung (IUGR) und Präeklampsie durch unsachgemäße Entwicklungs- und Funktionsstörungen der Dezidua/Plazenta oder kompromittierten Gefäße Umgestaltung an der Kreuzung deziduale Myometrial; sowie (3) Frühgeburt, die von der vorzeitigen deziduale Aktivierung führen kann.
Vor dem Hintergrund dieser wichtigen Erkrankungen, gepaart mit den ethischen und praktischen Einschränkungen des menschlichen in-Vivo -Studien, zur Gründung von primären humanen deziduale Zelllinien ist essentiell für in-vitro- Analyse mit dem Ziel besser zu verstehen und Klinisches Management von Komplikationen während der Schwangerschaft zu verbessern. Daher war das Ziel unserer Forschung, ein Protokoll zu entwickeln, die für die Isolierung von menschlichen primären deziduale Zellen mit hohe Zellausbeute und Lebensfähigkeit, gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas ermöglicht. Das aktuelle Protokoll klar beschreibt ein Zeit und Kosten wirtschaftlicheren Verfahren für bestimmte Subtypen von deziduale isolieren die Zellen für eine Vielzahl von in-vitro- Analysen verwendet werden. Charakterisierung der Fülle und Phänotyp der deziduale Sub-Populationen am Begriff und Vergleich zum ersten oder zweiten Trimester ist entscheidend für ihre Rollen in der gesamten menschlichen Schwangerschaft zu definieren.

<table><tbody><tr><td>Hank' s ausgewogene Salzlösung mit Calcium und Magnesium</td><td>Hergestellt in der Anlage (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hank' s ausgewogene Salzlösung ohne Kalzium und Magnesium</td><td>Vorbereitet in der Einrichtung (LTRI)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Windeleinlagen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>Große chirurgische Schere</td><td>AL Medical</td><td>2018-12-20.</td><td></td></tr><tr><td>Große chirurgische Zange</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-18</td><td></td></tr><tr><td>Einweg-Zellschaber aus Kunststoff (25 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>83.183</td><td></td></tr><tr><td>250 mm (Größe 60 mesh) Metallsieb</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S1020-5EA</td><td></td></tr><tr><td>Einwegskalpell mit Kunststoffgriff (#21)</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-927-5D</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Petrischale aus Kunststoff (Durchmesser 10 cm)</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.001</td><td></td></tr><tr><td>Steriler Probenbehälter (Urinbecher, 4,5 oz)</td><td>VWR</td><td>25384-146</td><td></td></tr><tr><td>Nylonfilter (70 mm)</td><td>VWR/Corning</td><td>21008-952</td><td></td></tr><tr><td>Erythrozyten-Lysepuffer</td><td>Qiagen</td><td>79217</td><td></td></tr><tr><td>Trypanblau, 0,4%ige Lösung</td><td>Lonza</td><td>17-942E</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-10</td><td></td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>Reichert</td><td>1490</td><td></td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Nährmedien</td><td>Invitrogen</td><td>11835-055</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Wisent</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Normocin (50mg/ ml)</td><td>Invivogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>Filtrationseinheit aus Kunststoff (0,22 mm Membran, 500 mL)</td><td>Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>Kollagenase 2, lyophilisiertes Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>Sojabohnen-Trypsin-Inhibitor, Pulver</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T9003-250mg</td><td></td></tr><tr><td>DNase-Pulver</td><td>Roche</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin (BSA-Pulver)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-100</td><td></td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop mit Spinning-Scheibe - Leica DMI 6000B</td><td>Leica</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bildgebendes Durchflusszytometer - Image Stream MK2</td><td>Amnis</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IDEA Software</td><td>Millipore Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>APC-konjugierter Vimentin-Antikörper</td><td>R& D Systems</td><td>IC2105A</td><td></td></tr><tr><td>APC H7-konjugierter CD45-Antikörper</td><td>BD</td><td>641399</td><td></td></tr><tr><td>FITC-konjugierter Cytokeratin-Antikörper</td><td>MACs Miltenyi Biotec</td><td>130-080-101</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-konjugierter Cytokeratin 7-Antikörper</td><td>Novus</td><td>NBP2-47941PCP</td><td></td></tr><tr><td>eFluor450 Fixierbarer Viabilitätsfarbstoff</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>65-0863-14</td><td></td></tr><tr><td>Vimentin primärer Antikörper</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-7558</td><td></td></tr><tr><td>CD45 primärer Antikörper</td><td>Dako</td><td>M0701</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin primärer Antikörper</td><td>Dako</td><td>M0821</td><td></td></tr><tr><td>Cytokeratin 7 primärer Antikörper</td><td>Dako</td><td>M7018</td><td></td></tr><tr><td>Maus IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2025</td><td></td></tr><tr><td>Ziege IgG</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-2028</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 546 Sekundärantikörper</td><td>Invitrogen</td><td>A10036</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 Sekundärantikörper</td><td>Fisher Scientific</td><td>A-11058</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D9542</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation von primären menschlichen deziduale zellen aus der fetalen membranen der begriff plazentas

Isolation of Primary Human Decidual Cells from the Fetal Membranes of Term Placentae

Die Decidua, auch bekannt als die schwangere Endometrium, ist ein entscheidender Bedeutung reproduktives Gewebe. Deziduale Zellen, hauptsächlich bestehend aus decidualized Stromazellen und immune Zellen sind verantwortlich für die Sekretion von hormonellen und entzündliche Faktoren sind entscheidend für eine erfolgreiche Blastozyste Implantation, plazentar Entwicklung und spielen eine Rolle bei der Einleitung der Arbeit am Begriff und Frühgeborenen. Viele Komplikationen während der Schwangerschaft können durch Störungen der eine feine Balance der unterschiedlichen Zellpopulationen bestehend aus Dezidua entstehen. Veränderungen im Verhältnis von bestimmten deziduale Zelltypen können diese entscheidenden Prozesse stören und erhöhen das Risiko für schwere Komplikationen der Schwangerschaft, wie Embryo Implantation Versagen, intrauterine Wachstumsretardierung, Präeklampsie und Preterm Arbeit. Die hier beschriebene Protokoll zeigt eine Kosten- und Zeitaufwand die fetalen Membranen der Begriff plazentas wirksame Methode für die Isolierung von primären humanen deziduale Zellen entnommen. Durch die Kombination von enzymatischen Verdauung und sanfte mechanische Störung des deziduale Gewebes, erhielt eine hohe Ausbeute an deziduale Zellen praktisch ohne Chorion-Kontamination. Wichtig ist, zeichneten sich isolierte deziduale Zellen (Stromazellen Zellen (55-60 %), Leukozyten (35 %), epithelialen (1 %) oder Trophoblast (0,01 %) Zellen) und hohe Tragfähigkeit (80 %) die durch mehrfarbige bildgebenden Flow Cytometry Assay bestätigt wurde. Dieses Protokoll ist spezifisch für die Dezidua Parietalis und an ersten und zweiten Trimester plazentas angepasst werden kann. Einmal isoliert, können deziduale Zellen für eine Vielzahl von experimentellen Anwendungen mit dem Ziel zu verstehen, die Rolle der verschiedenen deziduale Zelle Sub-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft verwendet werden.

Um die Effizienz und Rentabilität der isolierten Zellen zu überprüfen, sie zeichneten sich durch zwei Methoden: flow Cytometry und Immunocytochemistry (ICC). 4-Zell-Populationen wurden gezielt; decidualized Stromazellen Zellen wurden von der Anti-Vimentin Antikörper erkannt, Pan-Leukozyten Marker CD45 wurde verwendet, um deziduale Immunzellen zu identifizieren, Cytokeratin wurde zur epithelialen/endothelial Zellen zu erkennen und schließlich Cytokeratin 7 wurde verwendet, um irgendwelche ...

Dieses Protokoll zeigt eine Methode zur Isolierung von primären menschlichen deziduale Zellen gesammelt von den fetalen Membranen der Begriff plazentas, die für eine Vielzahl von Anwendungen (z. B. Immunocytochemistry, Durchflusszytometrie, etc.) verwendet werden können mit dem Ziel zur Untersuchung der Rolle von verschiedenen Zell-Populationen in Komplikationen während der Schwangerschaft.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

The decidua, also known as the pregnant endometrium, is a critically important reproductive tissue. Decidual cells, comprised mainly of decidualized ...

Das übergeordnete Ziel dieses Zellisolationsprotokolls ist es, eine Methode zur Isolierung primärer Dezidualzellen mit hoher Ausbeute an Endzellviabilität zu entwickeln. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet der menschlichen Fortpflanzung zu beantworten, wie z. B. die Rolle des Milchstoffwechsels bei der Blastozystenimplantation und der Geburtseinleitung. Es kann auch Einblicke in verschiedene schwangerschaftsbedingte Pathologien geben.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine zeit- und kosteneffiziente Methode für die Isolierung von primären Dezidualzellen mit hoher Viabilitätsendausbeute bietet. Lassen Sie zunächst fünf 50-Milliliter-Röhrchen auf einem Gestell und zwei Flaschen HBSS und HBSS im Abzug. Pipettieren Sie dann 25 Milliliter HBSS in das entsprechend beschriftete Röhrchen.Legen Sie als Nächstes überlappende Windeln in den Abzug. Nehmen Sie dann den Begriff Plazenta aus dem Behälter und legen Sie ihn in den Abzug. Positionieren Sie die Plazenta mit der mütterlichen Seite nach oben auf der Windeleinlage.Wenn die Plazenta mit der mütterlichen Seite nach unten liegt, verwenden Sie eine zusätzliche Windel, um die Plazenta zu drehen. Suchen Sie nach der Stelle des Membranrisses und machen Sie mit Schere und Pinzette Schnitte, damit sich die Membran entfalten und flach auf der Oberfläche des Abzugs aufliegen kann. Verwenden Sie dann einen Zellschaber, um das Dezidualgewebe vorsichtig vom Chorion abzukratzen.Übertragen Sie das Gewebe in ein 50-Milliliter-Röhrchen mit 25 Millilitern HBSS Denken Sie daran, auch kleine Blutgerinnsel zu sammeln, da diese auch einige Dezidualzellen enthalten. Schütteln Sie das 50-Milliliter-Röhrchen vorsichtig, um das gesammelte Gewebe zu waschen, und führen Sie das Gewebe dann durch ein 250-Mikrometer-Metallsieb. Wiederholen Sie den Waschvorgang zweimal mit HBSS, gefolgt von zwei Wäschen mit HBSS in frischen Tuben.Chorionverunreinigungen sind aufgrund ihrer fadenförmigen Form und helleren Farbe leicht sichtbar und können nach dem Waschen entfernt werden. Nach dem Waschen wird das Gewebe in ein steriles 50-Milliliter-Röhrchen gegeben, das 20 Milliliter enzymatische Verdauungslösung enthält, um die gesamte Dezidua zu verdauen, die aus der gesamten fetalen Membran gewonnen wird. Verwenden Sie Paraffinfolie, um die Kappe der Tube zu verschließen.Dann inkubieren Sie das Röhrchen bei 37 Grad Celsius in einem schüttelnden Wasserbad. Stellen Sie den Timer auf 20 Minuten. Sobald die Inkubation beendet ist, entfernen Sie den Paraffinfilm.Verwenden Sie 70%iges Ethanol, um die Oberfläche des Röhrchens mit dem verdauten Gewebe zu sterilisieren, und legen Sie es unter den Abzug. Schütteln Sie die Tube kurz. Geben Sie dann die Zellsuspension durch ein Metallsieb in einen neuen sterilen Probenbehälter.Verdünnen Sie die Zellsuspension mit dem gleichen Volumen des Kulturmediums, um die enzymatische Reaktion zu stoppen. Übertragen Sie die Zellsuspension in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen. Dann zentrifugieren Sie die Zellen bei 420 G für 11 Minuten bei vier Grad Celsius.Geben Sie bei Bedarf das verbleibende unverdaute Gewebe in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen mit 20 Millilitern frischer enzymatischer Aufschlusslösung und wiederholen Sie den Verdauungsvorgang. Wenn der Aufschluss ein zweites Mal durchgeführt wird, lassen Sie das erste Röhrchen mit der Zellsuspension auf Eis. Sobald der zweite Verdau abgeschlossen ist, kombinieren Sie beide Zellsuspensionen.Nach dem Zentrifugieren wird der Überstand vorsichtig abgesaugt. Möglicherweise ist eine manuelle Pipette erforderlich, um den Überstand zu entfernen. Suspendieren Sie dann das Zellpellet wieder in Waschpuffer.Wiederholen Sie nach dem Waschen der Zellen den Zentrifugationsvorgang. Am Ende des Zentrifugationsprozesses aspirieren Sie den Überstand und suspendieren das Zellpellet in fünf Millilitern Waschpuffer und 35 Millilitern Erythrozytenlysepuffer erneut. Um die roten Blutkörperchen zu lysieren, wirbeln Sie das Röhrchen zu Beginn und am Ende der Inkubation kurz durch.Inkubieren Sie dann die Zellsuspension 20 Minuten lang auf Eis. Wiederholen Sie nach der Inkubation den Zentrifugationsvorgang. Nach der Zentrifugation wird der Überstand abgesaugt und das Pellet in 40 Millilitern Waschpuffer erneut suspendiert, dann werden die Zellen durch einen 70-Mikrometer-Nylonfilter geleitet, um Zellklumpen auszuschließen.Wiederholen Sie den Zentrifugationsvorgang. Aspirieren Sie den Überstand, sobald die Zentrifugation abgeschlossen ist. Suspendieren Sie dann das Zellpellet erneut in 10 Millilitern Nährmedium.Zählen Sie die Anzahl der Zellen mit einem Hämozytometer unter Verwendung der Trypanblau-Farbstoffausschlussmethode. Um die Zelltypzusammensetzung der dezidualen Zellpopulation zu bestimmen, wurde eine mehrfarbige bildgebende Durchflusszytometrie-Gating-Strategie entwickelt. Die Analyse zeigt den Ausschluss von Zelldubletten und Zelltrümmern mittels seriellem Gating.Sobald eine trümmerfreie Einzelzellpopulation erhalten wurde, wird die Zellviabilität mit einem fixierbaren Viabilitätsfarbstoff bestimmt. Die Analyse zeigt eine 80%ige Lebensfähigkeit der gesamten dezidualen Zellpopulation, die durch das Blue Gating angezeigt wird. Anschließend werden die isolierten Dezidualzellen mit Fluorophor-konjugierten monoklonalen Maus-Antikörpern gefärbt.Dies dient der Analyse des Vorhandenseins von Stroma-, Immun-, Epithel- und Trophoblastzellmarkern und des Lebensfähigkeitsfarbstoffs. Diese Marker bestimmen die dezidualen Zelltypen. Durchflusszytometrische Fluoreszenzbilder zeigen eine positiv gefärbte Zelle für alle vier Marker und den Viabilitätsfarbstoff.Diese Marker werden dann verwendet, um den prozentualen Anteil jedes Zelltyps in der dezidualen Zellpopulation zu bestimmen. Interessanterweise stellen die Vimentin-positiven Stromazellen die höchste Zellpopulation dar, während es praktisch keine Trophoblastzellen gibt. Diese Ergebnisse zeigen die Reinheit und hohe Lebensfähigkeit der isolierten primären humanen Dezidualzellen.Hier zeigen die erhaltenen Punktdiagramme das Gating für die positiven Zelltyppopulationen. Fluoreszierende Minus-Eins-Kontrollen werden verwendet, um die richtig positiven dezidualen Zellpopulationen genau zu bestimmen. Als nächstes werden aufgenommene konfokale Mikroskopiebilder der Spinning-Disk verwendet, um die durchflusszytometrischen Ergebnisse zu validieren, indem gezeigt wird, dass die deziduale Zellpopulation hauptsächlich aus Vimentin-positiven Stromazellen ohne Kontamination der Trophoblastzellen besteht.Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Stunden abgeschlossen werden. Nach diesem Verfahren können die Dezidualzellen auf verschiedene Weise analysiert werden, um die Gen- und Proteinexpression zu untersuchen, was uns helfen kann, die zellulären Veränderungen, die bei Schwangerschaftskomplikationen auftreten, besser zu verstehen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir haben die Plazenta als wichtiger blutbildenden Organ während der Entwicklung identifiziert. Wir fanden, dass hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind beide generiert und erweitert in der Plazenta in einzigartige Mikroumgebung Nischen. Hier beschreiben wir experimentelle Techniken zur Isolierung und Visualisierung von HSZ in der Maus Plazenta erforderlich.

Isolierung und Analyse von hämatopoetischen Stammzellen aus der Plazenta

In diesem Protokoll beschreiben wir die Zerlegung der Plazenten von der Maus auf die Schwangerschaft d10.5, durch Isolation von Trophoblastzellen mit einem Percoll-Gradienten folgen. Wir demonstrieren dann Verwendung der isolierten Zellen in einem Matrigel Invasionsassay.

Isolation of Primary Maus Trophoblastzellen und Trophoblastinvasion Assay

Wir beschreiben ein Protokoll zur Isolierung und Kultivierung von humanen Amnionenepithelzellen (hAECs) unter Verwendung von Reagenzien ohne tierische Produkte in Übereinstimmung mit den aktuellen Richtlinien der guten Herstellungspraxis (cGMP).

Isolation, Kryokonservierung und Kultur der Menschen Amnion Epithelzellen für Klinische Anwendungen

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und weiteren Untersuchung der infiltrierenden Leukozyten der Decidua basalis und der Decidua parietalis - der menschlichen mütterlich-fetalen Schnittstelle - beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, wie die Durchflusszytometrie-Analyse beweist.

Isolation von Leukozyten aus dem menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle

Hierin wird ein Protokoll zur Isolierung und Analyse der infiltrierenden Leukozyten von Geweben an der mütterlich-fetalen Grenzfläche (Uterus, Dezidua und Plazenta) von Mäusen beschrieben. Dieses Protokoll bewahrt die Integrität der meisten Zelloberflächenmarker und liefert genügend lebensfähige Zellen für nachgelagerte Anwendungen, einschließlich Durchflusszytometrie-Analysen.

Isolierung von Leukozyten aus dem Mausgeweben an der Maternal-Fetal-Schnittstelle

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur siRNA effizient transfizieren in frisch isolierten menschlichen villöse Zytotrophoblasten Verwendung Mikroporation und Identifizieren von DNA-Protein-Komplexe in diesen Zellen. Transfizierte Zellen können durch Western-Blot überwacht werden und EMSA-Analysen während der 4-tägigen Kulturzeit.

siRNA-Transfektion und EMSA-Analysen auf frisch isolierten menschlichen Villöse Cytotrophoblasten

Hier beschreiben wir Verfahren zur Präparation von fetalen und mütterlichen Geweben aus menschlichen Plazenta, gefolgt von der Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stromazellen (MSC) aus diesen Geweben.

Isolierung und Expansion von mesenchymalen Stamm- / Stroma-Zellen aus humanen Placenta Gewebe gewonnen

Eine einfache Methode, primäre menschliche Plazenta (Villi) und dezidualen Organkulturen zu etablieren beschrieben. Villöse und dezidualen Organkulturen sind wertvolle Werkzeuge Pathogenese an der menschlichen Mutter und Fötus-Schnittstelle für das Studium. Eine Infektion mit dem Bakterium fakultativ intrazellulären Listeria monocytogenes nachgewiesen wird .

Menschliche Plazenta und Deziduale Organkulturen Infektionen zu studieren an der Maternal-fetale Schnittstelle

Diese Studie stellt eine standardisierte und validierte Methode zur Isolierung und Kultur der primären Maus endometrial Stroma und Epithelzellen, die in einer Co - Kultur - System verwendet werden kann , in vitro decidualization zu studieren.

Isolierung von Maus Endometrial Epithelial und Stromazellen für<em&gt; In Vitro</em&gt; decidualization

Diese Studie bietet eine validierte und optimierte Verfahren zur Isolierung und Kultur menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen in Vitro Decidualization Assay durchzuführen. Darüber hinaus bietet diese Studie einer detaillierte Methode, um effizient Knockdown ein bestimmtes Gen mit SiRNAs in menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen.

Isolation von menschlichen endometrialen Stromazellen Zellen für In-vitro- Decidualization

Dieses Protokoll ermöglicht die Reinigung, Charakterisierung und Kultivierung primärer HLA-G+-extravillöser Trophoblasten (EVT) aus der Decidua basalis und der chorionischen Membran menschlicher Term-Plazentas. Primäre EVT-Kulturen erhalten die Lebensfähigkeit 96 Stunden lang aufrecht, was eine Kokultivierung mit probengematchten mütterlichen Immunzellen sowie eine anschließende zytometrische und molekulare Analyse ihrer Interaktionen ermöglicht.

Reinigung von HLA-G+ -Extravillen-Trophoblasten aus menschlichen Term-Plazentageweben für Phänotypisierung und funktionelle Analyse

Lernen Sie die Isolierung primärer humaner Deziduazellen aus fetalen Membranen der reifen Plazenta. Diese Methode ermöglicht hochwertige Zellpräparationen für reproduktionsbiologische Forschung und Schwangerschaftsstudien.

Isolation von primären menschlichen Deziduale Zellen aus der fetalen Membranen der Begriff Plazentas

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