Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Lungenversorgung zu beantworten, z. B. warum Patienten, die eine im Krankenhaus erworbene Lungenentzündung überleben, so schlechte Langzeitergebnisse erzielen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie einfach und zuverlässig ist, was bedeutet, dass jeder, der ins Labor kommt, sie lernen kann und am nächsten Tag nützliche und wiederholbare Daten generiert. Obwohl diese Analysemethoden angewendet werden können, um Einblicke in die Infektion von kultivierten Zellen in vitro zu erhalten, können sie auch auf Tiermodelle und menschliche Patienten angewendet werden.

Um einen zytotoxischen Überstand herzustellen, waschen Sie eine 150 Zentimeter große Schale mit Endothelzellen mit HBSS und verdünnen Sie eine P.aeruginosa-Kolonie auf eine Extinktion von 0,25 bei 540 Nanometern. Verdünnen Sie die Bakterienzellen weiter, um eine Vielzahl von Infektionen von 20 bis 1 von 20 Millilitern HBSS zu ermöglichen, und säen Sie die Bakterien auf die Platte der Endothelzellen. Legen Sie die infizierten Zellen dann für vier bis fünf Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen und 5%CO2-Inkubator.

Es ist wichtig, dass die Inkubation der Bakterien und der Endothelzellen über einen angemessenen Zeitraum erfolgt. Ist die Inkubation zu kurz, werden die Amyloide nicht in den Überstand abgegeben. Wenn die Inkubation zu lange dauert, lysieren die Zellen tatsächlich und geben ihren gesamten Inhalt an den Überstand ab.

Der Indikator, den wir für eine angemessene Inkubationsdauer verwenden, ist die Bildung von Lücken in der endothelialen Monoschicht. Wenn Lücken in der Zellmonoschicht durch Lichtmikroskopie beobachtet werden können, wird der Überstand für die Zentrifugation entnommen, um alle Zelltrümmer zu entfernen. Dekantieren Sie den Überstand in eine Spritze, die mit einem 0,2-Mikron-Filter ausgestattet ist, und leiten Sie den Überstand durch den Filter, um alle kontaminierenden Bakterien zu entfernen.

Stellen Sie dann 1,5 Milliliter sterilen Überstand für die Zytotoxizitätsuntersuchung beiseite und frieren Sie den Rest der Probe bei minus 80 Grad Celsius ein. Um die Zytotoxizität des entnommenen Überstands zu beurteilen, geben Sie das 1,5-Milliliter-Aliquot des filtersterilisierten Überstands in eine einzelne Vertiefung einer Sechs-Well-Platte, die eine konfluente pulmonale mikrovaskuläre Endothelzellkultur enthält. Legen Sie die Platte für 21 bis 24 Stunden in einen CO2-Inkubator.

Anschließend erhalten Sie Bilder von Regionen der behandelten und kontrollierten Kulturen. Importieren Sie die Bilder in ein benutzerdefiniertes imagej-Makro und stellen Sie den Kontrast auf 15% gesättigte Pixel ein. Duplizieren Sie die kontrastangepassten Bilder und verwenden Sie "Hintergrund subtrahieren", um kontrastreiche Bilder sowohl der intakten Zellen als auch des Lückenbereichs innerhalb des Sichtfelds zu erhalten.

Subtrahieren Sie dieses kontrastreiche Bild vom Originalbild und verwenden Sie den Bildrechner und die Funktion, um das resultierende Bild mit dem Originalbild zu kombinieren. Verwenden Sie die Schwellenwert-Funktion, um das kombinierte Bild in eine Maske umzuwandeln, bei der die Lücken in Schwarz und die intakten Zellen in Weiß sind. Und verwenden Sie die binäre Erosionsfunktion, um jegliches Rauschen aus dem Bild zu entfernen.

Verwenden Sie dann den Flächenbruch, um das Verhältnis von schwarzen zu weißen Pixeln innerhalb des resultierenden Bildes zu messen. Und plotten und drücken Sie die fraktionierten Flächen für jeden Behandlungszeitpunkt als Prozentsatz der maximalen Lückenfläche aus. Um die Amyloide im Überstand zu quantifizieren, fügen Sie 20 Mikroliter frisch zubereiteter und filtrierter 50-facher Thioflatin-T-Stammlösung zu einem Milliliter PBS in einer Ein-Milliliter-Spektrophotometer-Küvette hinzu und laden Sie die verdünnte Probe auf ein Spektrofluorometer.

Messen Sie die Fluoreszenzemission in der Basislinie mit einer 425-Nanometer-Anregung. Abtastung der Fluoreszenzemission von 450 bis 575 Nanometern in zwei Nanometerschritten. Stellen Sie dann das Gerät so ein, dass es einen Zeitrafferscan mit einer 425-Nanometer-Anregung und einer 482-Nanometer-Emission mit Datenerfassung alle 0,2 Sekunden für 60 Sekunden durchführt.

Pausieren Sie den Scan, nachdem Sie 20 Sekunden lang 10 Mikroliter Filter mit dem Überstand der Küvette sterilisiert haben. Nach dem Mischen durch Inversion wird die Küvette wieder auf das Spektrofluorometer geladen und der zeitbasierte Scan für die letzten 40 Sekunden fortgesetzt. Führen Sie nach Abschluss des Zeitraffers einen abschließenden Scan des Fluoreszenzemissionsspektrums mit den ursprünglichen Scaneinstellungen durch.

Die Zugabe von P.aeruginosa zu konfluenten Schichten pulmonaler mikrovaskulärer Endothelzellen induziert die Lückenbildung zwischen den Zellen. Unter Verwendung von imagej zur Beurteilung der überstehenden Zytotoxizität, wie sie in den ersten 12 Stunden der Behandlung gezeigt wurde, können noch gesunde konfluente Zellmonoschichten als alle weißen Bereiche innerhalb des mikroskopischen Feldes sichtbar gemacht werden. 18 Stunden nach der Zugabe des Überstands aus PA 103-infizierten Kulturen können jedoch Lücken in der Monoschicht festgestellt werden, wobei der zellfreie Bereich der Kulturschale bis 36 Stunden nach der Behandlung linear zunimmt, wobei zu diesem Zeitpunkt fast keine intakten Zellen mehr beobachtet werden können.

Ähnliche Ergebnisse können mit der Freisetzung von Laktatdehydrogenase als Marker für Zytotoxizität erzielt werden. Dabei wird die Laktatdehydrogenase erstmals 18 Stunden nach der Zugabe des zytotoxischen Überstands nachgewiesen und linear ansteigend, bis die maximale Zellabtötung nach 36 Stunden gemessen wird. Die Überstände können auch durch Immunoblot-Analyse oder durch Messung der Änderung der Thioflatin-T-Fluoreszenzintensität aufgrund von Bestätigungsänderungen, die durch Amyloidbindung induziert werden, bestimmt werden, um das Vorhandensein von zytotoxischen Amyloiden in den Überständen zu bestimmen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie zytotoxische Überstände nach einer Infektion von Endothelzellen mit Citomonsis aeruginosa erzeugt werden. Darüber hinaus sollten Sie sich mit den Arten von Assays auskennen, die zur Charakterisierung und Analyse der in diesen Überständen vorhandenen Zytotoxine erforderlich sind.