Name: Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-12T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 27 s
Description: Lernen Sie Methoden zur Erkennung zytotoxischer Amyloide nach Infektion pulmonaler Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa. Diese einfache Technik ermöglicht reproduzierbare Daten für Infektionsforschung.

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Diese Forschung wurde in Teilen von NIH-Stipendien HL66299 TS, RB und SL, HL60024, TS und HL136869 MF finanziert.

Alle tierische Verfahren wurden überprüft und genehmigt durch die institutionelle und Animal Care Committee von der University of South Alabama und wurden in Übereinstimmung mit allen Bundes-, Landes- und lokalen Vorschriften durchgeführt. Primärkulturen von Ratte pulmonalen mikrovaskuläre Endothelzellen (PMVECs) wurden von der Zelle Kultur Core Facility der University of South Alabama Center für Lunge Biologie erhalten. Zellen wurden mit der zuvor beschriebenen Verfahren16zubereitet.
1. Generation von zytotoxischen Überstände
Hinweis: Hier verwenden wir zwei verschiedene Stämme von p. Aeruginosa: PA103, die verfügt über eine intakte Typ III-Sekretion in der Lage, die Exoenzymes ExoU und ExoT auf Zielzellen zu übertragen, während der Infektion und ∆PcrV, die einen Typ-III-Sekretion System fehlt und ist nicht in der Lage Exoenzymes auf Zielzellen nach Impfung zu übertragen.
<ol><li>Bakterien auf Vogel-Bonner (VB) Agar-Platten17 Streifen und wachsen über Nacht bei 37 ° C.<ol>
<li>Um Platten vorzubereiten, machen die folgenden Stammlösung (Vogel-Bonner Salze; 10 X Lager): 2 g MgSO4, 20 g Zitronensäure (freie Säure), 100 g K2PO4und 35 g NaH2PO4zu messen. 1 L und Autoklaven für 15 min mit langsamen Auspuff DdH2O hinzufügen.</li>
		<li>Platzieren Sie 7,5 g Agar in 450 mL DdH2O und Autoklaven wie oben beschrieben.</li>
		<li>Legen Sie nach Autoklavieren beide Lösungen in ein Wasserbad von 50 ° C abkühlen lassen.</li>
		<li>50 mL der 10 X VB Salz Vorratslösung zu Agar hinzufügen.</li>
		<li>400 µg/mL (für die Stämme von p. Aeruginosa verwendet wird) Carbenicillin hinzu und mischen Sie gut durch Schütteln der Flasche.</li>
		<li>Platz 5 mL der VB-Agar-Lösung in einzelnen sterilen Kultur Gerichte erlauben das Agar zu festigen, und dann bei 4 ° C bis zum Tag der bakterielle Aussaat aufbewahren.</li>
		<li>Am Tag der bakterielle Aussaat wärmen Sie eine Platte auf 37 ° C vor und dann Streifen Sie Bakterien auf die Platte mit einer sterilen Schleife. Ort der Platte in einem Inkubator 37 ° C über Nacht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>PMVEC Reinheit überprüfen, indem Sie positive Färbung mit fluoreszierenden Griffonia Simplicifolia Lektine und negative Färbung mit fluoreszierenden Helix Pomatia Lektin (ein Marker für arterielle Endothelzellen). Aliquoten Zellen und Einfrieren in flüssigem Stickstoff.</li>
	<li>Pflegen Sie für Experimente Zellen in Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM) ergänzt mit 10 % fötalen Rinderserum und wachsen Sie Zellen in einem 37 ° C Inkubator mit 5 % CO2. Verwenden Sie Zellen bei Passagen 5-15.<ol>
<li>Für die Erzeugung von zytotoxischen Überstände Platte 2 x 106 Zellen in einzelne 150 cm Gerichte und wachsen für 3-4 Tage bis Zusammenfluss erreicht ist. Verwenden Sie zwei Platten pro Experiment (siehe unten).</li>
		<li>Für die Analyse von zytotoxischen Überstände Platte 1 x 105 Zellen in einzelnen Vertiefungen eines 6-gut austeilen und für vier Tage, bis Zusammenfluss erreicht wird wachsen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Um überstand zu produzieren, eines der zwei 150 cm Gerichte des PMVECs aus Schritt 1.3.1 mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung waschen, trypsinize und dann zählen die Zellen (wir verwenden einen automatisierte Zelle Zähler und Folgen des Herstellers Protokoll; sehen Sie Tabelle der Materialien). Das andere Gericht des PMVECs mit Hank es ausgewogen Salz Lösung (HBSS) waschen und dann mit beiden Stamm von p. Aeruginosa bei einer Vielzahl von Infektionen (MOI) von 20:1 zu infizieren. Dies wird folgendermaßen erreicht:<ol>
<li>Für p. Aeruginosa, OD540 0,25 = 2 x 108 KBE/mL. Zur Vorbereitung dieser Verdünnung fügen Sie 1 mL HBSS eine 1 mL-Einweg-Küvette hinzu. Kratzen Sie genug Bakterien aus der Platte, die in Schritt 1.1 vorbereitet wurde, bis ein OD-540 von 0,25 erreicht ist, wenn mit einem Spektralphotometer gemessen. Im nächste Schritt wird eine Berechnung der wieviel Bakterien benötigt werden bieten.</li>
		<li>Sobald die Anzahl der PMVECs in der Kulturschale bestimmt ist (Schritt 1.4 oben), bestimmen die entsprechende Anzahl von Bakterien, die zweite, nicht trypsiniert Kulturschale mit der PMVECs hinzugefügt werden soll. Beispielsweise, wenn feststeht, dass der Kulturschale PMVECs 1,3 x 107 Zellen enthält, dann bereiten Sie 1,3 x 107 Zellen X 20 Bakterien/Zelle X 1 mL/2 x 108 KBE = 1,3 mL Bakterien.</li>
		<li>Verdünnen Sie die 1,3 mL Bakterien in HBSS zu einem Endvolumen von 20 mL, so dass die gesamte Oberfläche des einen 150 cm Schüssel kann mit Flüssigkeit bedeckt sein, dann fügen Sie die verdünnten Bakterien auf die Platte des PMVECs.</li>
		<li>Die PMVECs beimpft mit den Bakterien bei 37 ° C in einem 5 % CO2 Inkubator für 4-5 Std. bis Lücken zu sehen in der Zelle monomolekularen Film bilden, wenn die Platte mikroskopisch beobachtet wird (siehe Abbildung 1 für die richtige Ebene der Spaltbildung) inkubieren.</li>
		<li>Den überstand zu sammeln, dann Zentrifugieren für 10 min bei 2.000 x g in einer Tischplatte Zentrifuge, zelltrümmer zu entfernen. Hinweis: Jede Tischplatte Zentrifuge in der Lage, erzeugen ausreichend g zwingen, pellet-unlysed Zellen und großzellige Fragmente können für diesen Schritt verwendet werden.</li>
		<li>Gießen Sie den überstand in eine Spritze, die einen 0,2 µm-Filter angebracht zu seinem Ende, dann den Überstand durch den Filter zu entfernen Bakterien übergeben hat.</li>
		<li>Verwenden Sie ein Aliquot des sterilen Überstands Zytotoxizität zu testen (siehe 2.1) und den Rest des Überstands bei-80 ° C zur späteren Verwendung einfrieren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Analyse der zytotoxischen Überstände
<ol><li>Zytotoxizität Assay<ol>
<li>PMVECs in 6-Wohlen Teller bis Zusammenfluss wachsen. Wash-Brunnen hinzufügen, einmal mit HBSS, dann 1,5 mL Filter sterilisiert überstand (gesammelt von entweder geimpft PA103 oder ∆PcrV Zellen) individuelle Vertiefungen. Geben Sie sterile HBSS in einem anderen als Negativkontrolle.</li>
		<li>Legen Sie die Platte in den CO-2 -Inkubator für 21-24 h, dann Zelle Tötung/Zytotoxizität zu beobachten (siehe nächster Schritt). Überstände, die Zytotoxizität für weitere Experimente zeigen, und verwerfen Sie die Zelle Tötung nicht angezeigt werden.</li>
		<li>Quantifizierung der Zelle Tötung<ol>
<li>Maßnahme Laktat-Dehydrogenase (LDH) Entlassung aus abgestorbenen Zellen, die mit im Handel erhältlichen LDH-Assay Kits und des Herstellers empfohlenen Verfahren.</li>
			<li>Alternativ zu quantifizieren Zelle Tötung mikroskopisch mit ImageJ-Software. Dafür, mikroskopische Aufnahmen und Bereichen der Kulturschale mit intakten Zellen aufnehmen, dann quantifizieren Regionen fehlen Zellen (indikativ für Zelltod in einem monomolekularen Film) mit einem benutzerdefinierten ImageJ (National Institutes of Health)-Makro (siehe zusätzliche Codierung Datei ). Falls gewünscht, führen Sie das Makro Schritte manuell wie folgt:<ol>
<li>Bilder (RGB oder Tiff-Format) in das Makro eingegeben und Kontrast auf 15 % gesättigt Pixel. Doppelte Bilder Kontrast angepasst und führen Sie den Befehl "Subtrahieren Hintergrund", um ein kontrastreiches Bild der Zelle und Lücke in das Blickfeld zu erhalten.</li>
				<li>Dieses Bild aus dem Originalbild abziehen und das resultierende Bild mit dem Originalbild mit dem bildrechner "Und"-Funktion kombinieren. Konvertieren Sie das resultierende Bild in schwarz (Lücken) und weiß (Zellen) Maske mit der Schwelle-Funktion (mindestens 0, maximal 5), und verwenden Sie die Funktion "Binär untergraben" Lärm aus dem Bild entfernen.</li>
				<li>Messen Sie das Verhältnis von Schwarz bis weiße Pixel innerhalb des resultierenden Bildes mit "Bereich Bruchteil" Messung. Plotten und gebrochene Bereiche für jeden Zeitpunkt der Behandlung als Prozent der maximalen Spaltbereich äußern.</li>
				<li>Berechnen Sie Mittel zu und vergleichen Sie mit One-Way ANOVA mit Tukey post-hoc-Test, mit p -Werte weniger als 0,05 als bedeutende.</li>
			</ol>
</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie Immunoblot Analyse auf um das Vorhandensein von Amyloid, Oligomere Tau und Aβ in Kultur Überstände zu etablieren. Durchführen Sie Immunoblot Analyse mit Standardverfahren10,11,12, mit Ausnahme der Konzentration Kultur Überstände mindestens 10-divisibel vor der Elektrophorese.<ol>
<li>Überstand zu konzentrieren, legen Sie 1 bis 2 mL des Überstandes in eine Zentrifugation-Filter-Einheit, deren Membran ein Molekulargewicht Cut-off von 10 kDa hat. Dann setzen Sie die Filtereinheit in eine Tischplatte Zentrifuge und Zentrifuge bei 2.000 x g bis die nötige Konzentration ist erreicht (in der Regel 45-60 min).</li>
			<li>Bestimmen Sie die Menge des Proteins in der konzentrierten überstand11 und laden Sie gleiche Mengen von Proben in einzelnen Vertiefungen des Gels zu.</li>
			<li>Gele laufen dann Sonde Blots mit A11 Anti-Amyloid Antikörper, T22 Anti-Oligomere Tau Antikörper oder MOAB2 Anti-Aβ Antikörper, gefolgt von entsprechenden Sekundärantikörper Proteine auf Nitrozellulose übertragen. Die Flecken mit standard Chemilumineszenz-Verfahren zu entwickeln.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verwenden Sie ein Thioflavin T Assay Thioflavin T Fluoreszenz (ThT), um amyloide in Überstände zu quantifizieren. Verwenden Sie für diese Messungen Filter sterilisiert Überstände.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Stammlösung (50 X) von Thioflavin T die Aussetzung von 8 mg Thioflavin T (ThT) in 10 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS). Nach dem Mischen, Filtern Sie die Lösung durch einen 0,22 µm-Filter, Partikel zu entfernen.</li>
			<li>Fügen Sie für Messungen 20 µL der ThT-Lager zu 1 mL PBS in einer 1 mL-Spektralphotometer-Küvette hinzu. Legen Sie die verdünnte Probe in einem Spectrofluorimeter.</li>
			<li>Die Baseline-Fluoreszenz-Emission mit 425 nm Anregung und Scannen die Fluoreszenzemission von 450-575 nm in Schritten von 2 nm zu messen.</li>
			<li>Führen Sie einen Zeitraffer Scan mit 425 nm Anregung und 482 nm Emission mit Daten erworben jeden 0,2 s für 60 s.</li>
			<li>Die ersten 20 s der Zeitraffer Scan misst Fluoreszenz in der leere Küvette. Bei 20 s, den Scan anhalten und die Küvette 10 µL des Überstands Filter sterilisiert hinzufügen. Mischen Sie die Küvette durch Umkehrung und setzen Sie dann wieder in die Spectrofluorimeter.</li>
			<li>Wiederaufnahme den zeitbasierten Scan, Erwerb der letzten 40 s Daten.</li>
			<li>Durchführen Sie nach Abschluss des Time-Lapse Scans einen endgültigen Fluoreszenz Emissionsspektrum Scan mit identischen Einstellungen, wie in 2.1.5.3..</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Brancati, F. L., Chow, J. W., Wagener, M. M., Vacarello, S. J., Yu, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+pneumonia+really+the+old+man%27s+friend%3F+Two-year+prognosis+after+community-acquired+pneumonia%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Is pneumonia really the old man's friend? Two-year prognosis after community-acquired pneumonia.</a> Lancet. 342 (8862), 30-33 (1993).</li>
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<li>Balczon, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pseudomonas+aeruginosa+exotoxin+Y-mediated+tau+hyperphosphorylation+impairs+microtubule+assembly+in+pulmonary+microvascular+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Pseudomonas aeruginosa exotoxin Y-mediated tau hyperphosphorylation impairs microtubule assembly in pulmonary microvascular endothelial cells.</a> PLoS One. 8, e74343(2013).</li>
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</ol>

Nichts zu berichten.

Hier werden einfache in-vitro- Methoden beschrieben, die Demonstration der Generation von zytotoxischen amyloiden während der Infektion mit einer Lungenentzündung verursachen Organismus erlauben. Diese Methoden umfassen eine Zelle Kultur Zytotoxizität Assay, Immunoblotting, Quantifizierung der Zelle Tötung mit ein neues mikroskopische Verfahren und ThT Bindung. Analysen der Zytostatika haben gezeigt, dass sie Amyloid in der Natur (Abbildung 2 und <strong class="xf...

Patienten, die eine Lungenentzündung zu überleben haben erhöhte Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus Entlastung1,2,3,4,5,6. In den meisten Fällen tritt der Tod durch irgendeine Art von Ende-Organversagen einschließlich Nieren-, Lungen-, Herz-, oder Leber Veranstaltungen sowie Schlaganfall5,6. Der Grund für die erhöhte Sterblichkeit bei dieser Patientengruppe wurde nie eingerichtet.
Als wird entweder ambulant erworbener Pneumonie eingestuft oder nosokomiale (nosokomiale) und Agenten, die Pneumonie verursachen können auch Bakterien, Viren, Pilze und Chemikalien. Eine der wichtigsten Ursachen der nosokomialen Pneumonie ist das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa. P. Aeruginosa ist ein gramnegatives Organismus, der eine Typ-III-Sekretion-System verwendet, um verschiedene Effektor-Molekülen, genannt Exoenzymes, direkt in das Zytoplasma der Ziel-Zellen7,8übertragen. Während der Infektion von pulmonalen endothelial Zellen gezielt die Exoenzymes verschiedene intrazelluläre Proteine, einschließlich eine endotheliale Form der Mikrotubuli-assoziierten Protein Tau9,10,11,12 , was zu endotheliale Barriere Aufschlüsselung, was zu schweren Lungenödem, verringerte Lungenfunktion und oft zum Tod.
Wie bereits erwähnt, haben Patienten, die überleben die ersten Lungenentzündung Sterberaten in den ersten 12 Monaten nach Krankenhaus entlassen erhöht. Ein möglicher Mechanismus für die Erklärung dieses Phänomens ist, dass irgendeine Art von langlebigen Toxin während der anfänglichen Infektion entsteht, die schlechte Langzeitprognose führt. Zwei Beobachtungen unterstützen diese Möglichkeit. Erste, kultivierte pulmonale Endothelzellen, die ursprünglich mit p. Aeruginosa behandelt werden nicht für vermehren sich bis zu einer Woche nach der Bakterien durch Antibiotika13getötet werden. Zweite, langlebigen Prionen und Agenten mit Prion Eigenschaften wurden in verschiedene Krankheiten bei Mensch und Tier, insbesondere Erkrankungen im Zusammenhang mit dem Nervensystem14,15nachgewiesen.
Methoden für die Prüfung der möglichen Produktion von langlebigen Zytostatika in pulmonale Infektion sind nie beschrieben worden. Hier werden eine Reihe von einfachen in-vitro- Tests beschrieben, die für die Untersuchung von Zytotoxin Produktion und Aktivität nach Infektion mit einem gemeinsamen Lungenentzündung verursachen Mittel, p. Aeruginosaverwendet werden. Diese Tests sollten leicht anpassungsfähig zu untersuchen mögliche Zytotoxin Induktion nach Infektion mit anderen Agenten, die Pneumonie verursachen, und die Überstände, die generiert werden sollte auch für die Untersuchung von Auswirkungen der ZELLGIFTE ganz nützlich sein Organe oder Tiere. Schließlich werden die Assays, die hier, am ehesten beschrieben werden anpassungsfähig, tierische und menschliche biologische Flüssigkeiten zur Herstellung von Zellgiften während einer Lungenentzündung zu testen.

<table><tbody><tr><td>Kaninchen Anti-Beta-Amyloid</td><td>Thermo</td><td>71-5800</td><td></td></tr><tr><td>A11 Amyloid-Oligomer-Antikörper</td><td>StressMarq</td><td>SPC-506D</td><td></td></tr><tr><td>T22 Anti-Tau-Oligomer-Antikörper</td><td>EMD Millipore</td><td>ABN454</td><td></td></tr><tr><td>Thioflavin T</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T3516</td><td></td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>0,22 Mikron Spritzenvorsatzfilter</td><td>Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>HRP Ziegen-Antikaninchen IgG</td><td>Abcam</td><td>ab6721-1</td><td></td></tr><tr><td>Stämme PA103 und &Delta; PcrV</td><td></td><td></td><td>Diese Stämme von P. aeruginosa wurden von Dr. Dara Frank, University of Wisconsin Medical College, Milwaukee, WI</td></tr><tr><td>FITC Griffonia</td><td>Lektin Sigma Aldrich</td><td>L9381</td><td></td></tr><tr><td>TRITC Helix pomatia</td><td>Lektin Sigma Aldrich</td><td>L1261</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Fisher</td><td>BP1423-500</td><td></td></tr><tr><td>0,22 Mikron Nitrocellulose</td><td>BioRad</td><td>162-0112</td> <td>gewonnen</td></tr><tr><td>Kollagenase Typ 2</td><td>Worthington</td><td>LS004176</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Hyclone</td><td>SH30898.03IH</td><td></td></tr><tr><td>PenStrep</td><td>Gibco</td><td>15070063</td><td></td></tr><tr><td>Carbenicillin Dinatriumsalz</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>C1389</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozedrifugationskonzentratoren - 10.000 MW Cutoff-Gehalt</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat zweibasisch</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>795496-500G</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumphosphat-Heptahydrat</td><td>MP Biomedicals</td><td>MP021914221</td><td></td></tr><tr><td>Zitronensäure</td><td>G Biosciences</td><td>50-103-5801</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat zweibasisches Heptahydrat</td><td>Sigma</td><td>S9506-500G</td><td></td></tr><tr><td>Countess Automatisierter Zellzähler</td><td>Invitrogen</td><td>C10277</td><td></td></tr></tbody></table>

methoden zur erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende infektion der pulmonalen endothelzellen durch pseudomonas aeruginosa

Methods for Detecting Cytotoxic Amyloids Following Infection of Pulmonary Endothelial Cells by Pseudomonas aeruginosa

Patienten, die überleben, Lungenentzündung erhöht Sterberaten in den Monaten nach Krankenhaus entlassen. Es ist vermutet worden, dass Infektion des Lungen-Gewebes während der Lungenentzündung führt bei der Herstellung von langlebigen ZELLGIFTE, die nachfolgende Ende Organversagen führen kann. Wir haben in-vitro- Tests um die Hypothese zu testen, während pulmonale Infektion entstehen ZELLGIFTE entwickelt. Isolierte Ratte pulmonalen Endothelzellen und das Bakterium Pseudomonas Aeruginosa dienen als Modellsysteme und die Produktion von Cytoxins nach Infektion der Endothelzellen durch Bakterien zeigt mit Zellkulturen, gefolgt von direkte Quantifizierung mit Laktat-Dehydrogenase Assays und eine neuartige mikroskopische Methode ImageJ-Technologie. Amyloid Artder diese ZELLGIFTE wurde durch Thioflavin T Bindung Assays und Immunoblotting und Immunodepletion mit A11 Anti-Amyloid Antikörper nachgewiesen. Weitere Analysen mittels Immunoblotting nachgewiesen, dass Oligomere Tau und Aβ wurden produziert und veröffentlicht von Endothelzellen nach Infektion durch p. Aeruginosa. Diese Methoden sollten leicht anpassbar an Analysen der menschlichen klinischen Proben sein.

Eine einfache in-vitro- Test wurde entwickelt, um auf das Vorhandensein von Zellgiften in Überstände von Zellen infiziert mit dem Bakterium p. Aeruginosaassay. Grundsätzlich Kulturmedium aus infizierten Zellen ist 4 h nach bakteriellen Zugabe gesammelt, die Bakterien werden durch Filter Sterilisation der Überstand Kultur entfernt und dann der sterile Überstand wird hinzugefügt, um eine neue Population von Zellen. Die Zellen sind dann 21-24 h nach der Zugabe des Überstand...

Einfache Methoden sind für den Nachweis der Produktion von zytotoxischen amyloide nach Infektion der Lunge Endothel von Pseudomonas Aeruginosabeschrieben.

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

Patients who survive pneumonia have elevated death rates in the months following hospital discharge. It has been hypothesized that infection of pulmonary ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Lungenversorgung zu beantworten, z. B. warum Patienten, die eine im Krankenhaus erworbene Lungenentzündung überleben, so schlechte Langzeitergebnisse erzielen. Der Vorteil dieser Methode ist, dass sie einfach und zuverlässig ist, was bedeutet, dass jeder, der ins Labor kommt, sie lernen kann und am nächsten Tag nützliche und wiederholbare Daten generiert. Obwohl diese Analysemethoden angewendet werden können, um Einblicke in die Infektion von kultivierten Zellen in vitro zu erhalten, können sie auch auf Tiermodelle und menschliche Patienten angewendet werden.Um einen zytotoxischen Überstand herzustellen, waschen Sie eine 150 Zentimeter große Schale mit Endothelzellen mit HBSS und verdünnen Sie eine P.aeruginosa-Kolonie auf eine Extinktion von 0,25 bei 540 Nanometern. Verdünnen Sie die Bakterienzellen weiter, um eine Vielzahl von Infektionen von 20 bis 1 von 20 Millilitern HBSS zu ermöglichen, und säen Sie die Bakterien auf die Platte der Endothelzellen. Legen Sie die infizierten Zellen dann für vier bis fünf Stunden in einen 37 Grad Celsius heißen und 5%CO2-Inkubator.Es ist wichtig, dass die Inkubation der Bakterien

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Quelle: Balczon, R., et al. Verfahren zum Nachweis zytotoxischer Amyloide nach Infektion von Lungenendothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt das Protokoll zur Quantifizierung von Amyloiden in Kulturüberständen aus Lungenendothelzellen, die mit virulenten Bakterien infiziert sind, unter Verwendung von Thioflavin T, einem Fluoreszenzfarbstoff, der an Amyloid-Beta-Faltblattstrukturen bindet. Ein Anstieg der Fluoreszenz im Vergleich zum Ausgangswert deutet...

Quantifizierung bakterieller infektionsinduzierter Amyloide mittels Thioflatin-T-Fluoreszenz

Quelle: Balczon, R., et al. Verfahren zum Nachweis zytotoxischer Amyloide nach Infektion von Lungenendothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video zeigt das Verfahren zur Erzeugung eines zytotoxischen Überstands aus pulmonalen Endothelzellen nach einer Infektion mit Pseudomonas aeruginosa. Es wird beschrieben, wie bakterielle Effektorproteine die Struktur von Wirtszellen stören und die Freisetzung von zytotoxischen Amyloid-Oligomeren in den Überstand induzieren.

Gewinnung von zytotoxischen Amyloiden nach bakterieller Infektion von Lungenendothelzellen der Ratte

Source: Dubois, V., et al. Identification of Virulence Markers of Mycobacterium abscessus for Intracellular Replication in Phagocytes. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the procedure of co-culturing amoebae with mutant bacterial strains to evaluate their intracellular survival and identify virulence markers through differences in colony counts.

Detecting Bacterial Virulence Using Amoeba as a Host System

Wir beschreiben ein Verfahren zum Verfolgen der endomembrane Bruch hervorgerufen durch die intrazelluläre...

Single Cell Messungen Vacuolar Rupture durch intrazelluläre Erreger verursacht

Wir haben ein Modell für Lungenverletzungen von Mäusen durch intratracheale Injektion des Bakteriums Pseudomonas aeruginosa entwickelt. Dieses Modell ahmt Lungenschäden bei Lungenentzündungen nach und ist klinisch relevant.

Pseudomonas aeruginosa induzierte Lungenschädigung-Modell

Hier beschreiben wir die Herstellung und Verwendung eines aktivitätsbasierten Sonde (ARN14686, undec-10-ynyl- N - [(3 S) -2-oxoazetidin-3-yl] carbamat) , die zum Nachweis und zur Quantifizierung des ermöglicht aktive Form des proinflammatorischen Enzym N -acylethanolamine Säure Amidase (NAAA), sowohl in vitro und ex vivo.

Vorbereitung und<em&gt; In Vivo</em&gt; Die Verwendung eines aktivitätsbasierte Sonde für<em&gt; N</em&gt; -acylethanolamine Säure Amidase

Hier beschreiben wir einen Wachstumszustand, um die kleine Kolonievariante von Pseudomonas aeruginosazu kulturen. Wir beschreiben auch zwei separate Methoden zum Nachweis und zur Quantifizierung des von P. aeruginosa hergestellten Exopolysaccharidalginats mit einem traditionellen Uronsäure-Carbazol-Assay und einem alginatspezifischen monoklonalen Antikörper (mAb) basierenden ELISA.

Kultur der kleinen Kolonie Variante von Pseudomonas aeruginosa und Quantitation seines Alginats

Wir beschreiben ein Protokoll für ein dreidimensionales Co-Kultur-Modell infizierter Atemwege, mit CFBE41o- Zellen, THP-1 Makrophagen und Pseudomonas aeruginosa, die an der Luft-Flüssig-Schnittstelle eingerichtet wurden. Dieses Modell bietet eine neue Plattform, um gleichzeitig die Wirksamkeit von Antibiotika, die Epithelbarrierefunktion und entzündungshemmende Marker zu testen.

P. aeruginosa Infizierte 3D-Co-Kultur von Bronchialepithelzellen und Makrophagen an der Luft-Flüssig-Schnittstelle zur präklinischen Bewertung von Anti-Infektivika

Die Antibiotikaresistenz bei adhärent-invasiven Escherichia-coli-Stämmen stellt Herausforderungen bei der Beurteilung bakterieller Invasionen mit dem traditionellen Gentamicin-Schutztest dar. Eine verbesserte Methode zur quantitativen Bewertung der bakteriellen Invasion durch Aufzählung koloniebildender Einheiten und qualitativ durch die Visualisierung infizierter Zellen mittels Immunfluoreszenz-Konfokalmikroskopie wird beschrieben.

Amikacin-Schutztest zur Quantifizierung und Visualisierung der Escherichia-coli-Zellinvasion

Dieses Papier beschreibt verschiedene Methoden der...

Co-Kultur Modelle Pseudomonas aeruginosa Biofilme auf lebenden menschlichen Zellen gezüchtet Airway

Lernen Sie Methoden zur Erkennung zytotoxischer Amyloide nach Infektion pulmonaler Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa. Diese einfache Technik ermöglicht reproduzierbare Daten für Infektionsforschung.

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal

Methoden zur Erkennung von zytotoxischen amyloiden folgende Infektion der pulmonalen Endothelzellen durch Pseudomonas aeruginosa

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