Name: Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-09T14:45:00.000+00:00
Duration: 9 min 58 s
Description: Erfahren Sie die markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie zur Analyse von Kollagen- und Elastin-Mikroarchitekturen in lebenden menschlichen Widerstandarterien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung druckabhängiger Veränderungen der Gefäßwandmechanik.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren danken den dänischen Molekulare Biomedical Imaging Center an der Fakultät für Naturwissenschaften, Universität von Süddänemark für die Nutzung von Labors und Mikroskope. Kristoffer Rosenstand und Ulla Melchior sind ausgezeichnete technische Unterstützung für den Druck Myographie und imaging anerkannt.

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Arbeit stellt unser Vorschlag für eine standardisierte, kombinierte Bildgebung und Druck Myographie Ansatz, wertvoll für die gleichzeitige Prüfung der mechanischen Eigenschaften der Widerstand Arterien und der Druck im Zusammenhang mit Veränderungen in der Struktur der der arteriellen Wand über einem Druckbereich von 0 bis 100 MmHg. Das vorgestellte Konzept wurde entwickelt mit benutzerdefinierten gebauten Anlagen, jedoch Druck-Myograph, das passt auf eine zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop eingesetzt werden...

Die pathogenen Beitrag und Auswirkungen der Widerstand Arterie Umgestaltung sind essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom1,2,3,4,5dokumentiert. Entschlüsselung der Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand ist unerlässlich für die Entwicklung mathematischer Modelle dieses Vereins. Solche Modelle verbessert den Umbau Prozess zu verstehen und unterstützen die Entwicklung der in Silico Modellen pharmakologische Strategien zielen Krankheit im Zusammenhang mit Umbau der Arterienwand zu Testzwecken nützlich.
Vorherige Studien konzentrierten sich im Verständnis der Mikroarchitektur der Arterienwand bezieht sich auf die Arterienwand Mechanik durch den Einbau von mechanischen Maßnahmen und der Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix (ECM) werden fast ausschließlich auf große durchgeführt , elastische Conduit Arterien von Mäusen oder Schwein6,7,8,9,10,11. Bildgebung von Mikrostrukturen der Wand erfolgt in der Regel mit nichtlinearen optischen Techniken, unter Ausnutzung der Autofluoreszenz von Elastin und harmonische der zweiten Generation von Kollagen. Dadurch räumlich-zeitliche Darstellung der zwei wichtigsten Komponenten der extrazellulären Matrix, Elastin und Kollagen, ohne Notwendigkeit einer Färbung. Bildgebung der Arterienwand in voller Stärke ist eine Herausforderung in großen Conduit Arterien durch Streuung des Lichts in den dicken Tunika-Medien. Aber, um festzustellen, wie der Mikroarchitektur der Strukturbestandteile der Arterienwand beziehen sich auf die beobachteten mechanischen Eigenschaften, dreidimensionale Informationen während der mechanischen Prüfung einzuholen. Für die großen Arterien wie die menschliche Aorta erfordert dies biaxialen Montage, mechanische Tests und imaging-Regionen von Interesse in 1-2 cm2 Stück der Arterienwand7,9,10, 12. nur einen Teil der Wand abgebildet und mechanisch getestet werden kann.
Für kleinere Arterien aller Arten (z. B. menschlichen Herzbeutel13, pulmonale14 und subkutane15 Arterien, Ratten mesenterialen Arterien16,17,18, 19 , 20, Maus Cremaster, mesenterialen, zerebrale, femorale und Halsschlagadern21,22,23,24,25,26, 27) Bildgebung der gesamte Wanddicke ist möglich und kombinierbar mit mechanischen Tests. Dies ermöglicht die gleichzeitige Aufnahme von der mechanischen Eigenschaften und die strukturellen Vorkehrungen innerhalb der Wand. Jedoch wurde eine direkte mathematische Modellierung des Verhältnisses zwischen der beobachteten Veränderungen in der dreidimensionalen Struktur des ECM und geänderten mechanischen Eigenschaften der Arterienwand Widerstand nach bestem Wissen und gewissen nur berichtet auf vor kurzem in menschlichen Widerstand Arterien13,15.
In dieser Arbeit wird eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien beschrieben. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen sind für den Erhalt der Maßnahmen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit13 mit Fidschi28beschrieben. Kollagen und Elastin Volumen Dichte werden mit Ilastik Software29 bestimmt und schließlich die Aufnahme der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert.
Das Ziel der Bildgebung und Bild Analysen Techniken in Kombination mit der mathematischen Modellierung soll Prüfern eine systematische Vorgehensweise zu beschreiben und zu verstehen, zu beschreiben beobachtet Druckänderungen induziert in den ECM Widerstand Arterien. Die beschriebene Methode konzentriert sich bei der Quantifizierung der Änderungen in das ECM in einem Gefäß während der Druckbeaufschlagung, durch den Vergleich der Struktur des ECM bei 20 / 40 / 100 MmHg. Diese Belastungen wurden ausgewählt, für die Bestimmung der Struktur der Arterienwand nachgiebiger (20 MmHg), steif (100 MmHg) und Zwischenzustand (40 MmHg), beziehungsweise. Jedoch kann jeder Prozess in der Gefäßwand der live Arterien, einschließlich Änderungen induziert durch vasoaktive Komponenten, Hysterese und Flow, abhängig von der Forschung-Hypothese in Frage durch den Prüfarzt quantifiziert werden.
Die Verwendung von zwei-Photon Erregung Fluoreszenz-Mikroskopie (TPEM) in Kombination mit einer Druck-Myograph für Studium Druck (oder andere) induziert Veränderungen in der ECM live Arterien wird betont. Erstens, weil das simultane Erfassung der insgesamt dreidimensionale Struktur der Arterienwand (Durchmesser und Wandstärke) sowie dreidimensionale markierungsfreie Erwerb von hoher Qualität ermöglicht, detaillierte Bilder von Kollagen und elastin Mikroarchitekturen wie beschrieben13 unter Ausnutzung die Autofluoreszenz Elastin und Kollagen zweite harmonische Erzeugung Signal (SHG)30. Zweitens ermöglicht TPEM Verwendung von Niedrigenergie-Nah-Infrarot-Anregungslicht, lichtbedingten der Gewebe und somit wiederholte Bildgebung an genau der gleichen Position innerhalb der Gefäßwand zu minimieren darf ermöglichen wiederholte Messungen Analysen beobachtet, Änderungen.
Die Verwendung eines alternativen Ansatzes mit konfokale Bildgebung des Drucks behoben Arterien wird besprochen, damit Benutzer ohne Zugriff auf TPEM Gelegenheit, sowie das beschriebene Verfahren verwenden können. Informationen zu Struktur und Volumen Dichte ECM kann auch aus zweidimensionalen Analysen der Gewebe geschnitten in Serie, z. B. wie beschrieben von31,32abgerufen werden. Aufgrund der fehlenden Möglichkeit zum Abrufen von dreidimensionalen Strukturinformationen über die Längenskalen der Arterie sowie bei wechselnden Bedingungen mit dieser Methode, ist es jedoch nicht empfehlen die Verwendung dieses Ansatzes für Untersuchungen von Druck und Behandlung induziert dreidimensionale Änderungen in das ECM.
Die Mindestanforderung für die Ermittler, die hierin beschriebene Methode anzuwenden ist der Zugriff auf ein Setup für Kanülierung und Druckbeaufschlagung der Arterien in Kombination mit einem konfokalen oder zwei-Photon Erregung-Fluoreszenz-Mikroskop. Die Einrichtung in das folgende Protokoll beschrieben ist ein Custom-Built Druck Myograph mit einer längs Kraftaufnehmer, gebaut, um auf eine benutzerdefinierte gebaute umgekehrten zwei-Photon Erregung Fluoreszenzmikroskop passen.

<table><tbody><tr><td>Fine Science Tools</td><td>15401-12</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine Science Tools</td><td>11251-23</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>SMZ800N</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>761028</td><td>zum Sezieren</td><td></td></tr><tr><td>Vitrex Medical A/S, Herlev, Dänemark</td><td>1.63, 2.13, 210mm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Smiths medical Intl, UK</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ethicon</td><td>Ethilon 11-0</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonderanfertigung</td><td></td><td>DK Patentnummer 201200167, Universität von Süddänemark, J. Schoubo V. Jensen, F. Jensen. T.R. Uhrenholt</td><td></td></tr><tr><td>Mettler toledo</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>Nr. B3259</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>Nr. A7030</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>C5670</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>G7021</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>E3889</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Merck Millipore, Hellerup, Dänemark</td><td>1.00496.9010</td><td>Phosphatgepuffert (pH 6,9) 4%ige Formaldehydlösung</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>H3784</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>P9666&</td><td></td><td></td></tr><tr><td>nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>P5655</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>M2643</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>S2002</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>S5886</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>Nr. S5761</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>1.06462</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gibco, ThermoFisher Scientific</td><td>10010015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>PHR1423</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Sigma-Aldrich, Brôslash; ndby, Dänemark.</td><td>Z370525</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Tocris Bioscience, Bristol, UK</td><td>538944</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>Custom built</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spectra Physics, Mountain View, CA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Apo IR SR 60XWI NA 1.27</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nikon</td><td>CFI Plan Fluor 20XMI (multi-immersion) NA 0.75</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hamamatsu, Ballerup, Dänemark</td><td>H7422P-40</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Die AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Deutschland).</td><td>ChromaET 460 nm dichroitischer</td><td></td><td></td>Langpass</tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Deutschland).</td><td>Semrock FF01-520/35-25 BrightLine Filter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AHF analysentechnik AG (T&uuml; Bingen, Deutschland).</td><td>Chroma ET402/15X&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Die Dicke des Scotch TM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Deckglases sollte mit dem verwendeten Objektiv am Mikroskop (#1 oder #1.5) übereinstimmen, alternativ stellen Sie den Einstellkragen so ein, dass er dem Deckglas</td><td></td><td></td> entspricht</tr></tbody></table>

bewertung von kollagen und elastin druckabhängige mikroarchitekturen in leben, menschlichen widerstand arterien durch markierungsfreie fluoreszenz-mikroskopie

Assessing Collagen and Elastin Pressure-dependent Microarchitectures in Live, Human Resistance Arteries by Label-free Fluorescence Microscopy

Die pathogene Beitrag der Widerstand Arterie Umgestaltung ist essentieller Hypertonie, Diabetes und das metabolische Syndrom urkundlich erwähnt. Untersuchungen und die Entwicklung des microstructurally motiviert mathematische Modelle für das Verständnis der mechanischen Eigenschaften des menschlichen Widerstand Arterien in Gesundheit und Krankheit haben das Potential zum besseren Verständnis wie Krankheit und medizinische Behandlungen Auswirkungen auf die menschliche Mikrozirkulation. Um diese mathematische Modelle zu entwickeln, ist es wichtig, die Beziehung zwischen den mechanischen und Microarchitektonische Eigenschaften der mikrovaskuläre Wand zu entschlüsseln. In dieser Arbeit beschreiben wir eine ex-Vivo -Methode für die passive mechanische Prüfung und gleichzeitige markierungsfreie dreidimensionale Bildgebung der Mikroarchitektur von Elastin und Kollagen in der Arterienwand des isolierten menschlichen Widerstand Arterien. Das Image-Protokoll kann auf Widerstand Arterien aller Arten von Interesse angewendet werden. Bild-Analysen werden für die Quantifizierung i) Druck-induzierte Veränderungen der internen elastischen Lamina Verzweigung Winkel und adventitial Kollagen Geradheit mit Fidschi und (Ii) Kollagen und Elastin Volumen Dichte bestimmt, mit Ilastik-Software beschrieben. Vorzugsweise alle mechanischen und imaging sind Messungen auf live, PERFUNDIERTEN Arterien, jedoch ist ein alternativer Ansatz mit standard Video-Mikroskopie Druck Myographie in Kombination mit Post-Fixierung Bildgebung der erneut unter Druck stehenden Behälter diskutiert. Diese alternative Methode bietet dem Anwender mit verschiedenen Optionen für Analyse-Ansätze. Die Einbeziehung der mechanischen und bildgebenden Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik wird diskutiert, und zukünftige Entwicklung und Ergänzungen des Protokolls werden vorgeschlagen.

Die speziell angefertigten Druck Myograph für die Bildgebung verwendet in diesem Werk ist in Abbildung 1dargestellt. Besondere Aufmerksamkeit für die Gestaltung der Myograph war (i) der Kammer mit einer kleinen Menge (2 mL) und (Ii) die Möglichkeit zur Positionierung der Kanülen nahe und parallel mit Glasboden (Abbildung 1 b). Der Boden der Kammer passt ein 50 × 24 mm #1.5 Glas Deckglas (austauschbar). Der Druckregler entstand au...

Wir beschreiben, gleichzeitige mechanische Prüfung und 3D-Bildgebung der Arterienwand vereinzelter, Leben, menschlichen Widerstand Arterien und Fidschi und Ilastik Bild-Analysen für die Quantifizierung von Elastin und Kollagen räumliche Organisation und Volumen Dichte. Wir diskutieren die Verwendung dieser Daten in mathematische Modelle der Arterienwand Mechanik.

Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

The pathogenic contribution of resistance artery remodeling is documented in essential hypertension, diabetes and the metabolic syndrome. Investigations ...

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, ein standardisiertes Verfahren zur Gewinnung von Bildern lebender menschlicher Widerstandsarterien zur Analyse der Beziehung zwischen der Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix und der Mechanik der Arterienwand bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Gefäßbiologie und -mechanik zu beantworten, z. B. wie Druck Veränderungen in der Gesamtgeometrie sowie der Mikroarchitektur der Gefäßwand induziert. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass Sie Ihre Probe für die Bildgebung nicht markieren müssen.Obwohl diese Methode Einblicke in die Mechanik der Widerstandsarterien geben kann, kann eine modifizierte Version des Protokolls auf andere röhrenartige Organe wie die Bronchien oder auf Streifen aus der menschlichen Blase oder der Darmwand angewendet werden. Zu Beginn entnehmen Sie unmittelbar nach ihrer Exzision während der Operation Gewebeproben von Interesse und bereiten die Gefäße vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Eine kanülierte Arterie auf fünf Millimeter Quecksilbersäule unter Druck setzen.Richten Sie dann den Strahlengang für die Bildgebung ein, indem Sie den Zwei-Photonen-Laser aktivieren und die Anregungswellenlänge auf 820 Nanometer einstellen. Setzen Sie einen dichroitischen Langpassspiegel mit 460 Nanometern ein, um das Emissionslicht auf die Photovervielfacher aufzuteilen und die Emission gleichzeitig in zwei Kanälen zu sammeln. Verwenden Sie 30 bis 60 Nanometer breite Bandpassfilter, die bei 520 Nanometern zentriert sind, um die Elastin-Autofluoreszenz zu sammeln, und einen weiteren, der bei 410 Nanometern zentriert ist, um das Signal zur Erzeugung der zweiten Harmonischen des Kollagens zu sammeln.Stellen Sie nun die Verweilzeit und das Pixel des Lasers auf 10 Mikrosekunden ein. Stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 Pixel für 100 % Sichtfeld ein. Ermöglichen Sie kontinuierliches Scannen und verwenden Sie eine möglichst geringe Anregungslichtleistung und Pixelverweilzeit, um eine Beschädigung der lebenden Arterie durch das Foto zu vermeiden.Scannen Sie dann manuell durch die Arterie, um die Ebene mit dem maximalen Durchmesser zu finden. Wählen Sie als Nächstes eine rechteckige Scheibe, die den breitesten Durchmesser der Arterie abdeckt, und scannen Sie ein einzelnes Bild mit einer Pixelgröße von 300 Nanometern pro Pixel oder weniger. Speichern Sie dieses Bild für die Analyse zu einem späteren Zeitpunkt.Um den Lumendurchmesser und die Wandstärke bei maximalem Durchmesser der Arterie zu bestimmen, laden Sie das Bild zuerst in Fidschi. Stellen Sie die Skala ein, indem Sie auf das Hauptmenü klicken und dann zu Analysieren gehen, gefolgt von Skala einstellen. Geben Sie hier das Mikrometer pro Pixel und das Pixelverhältnis ein.Wählen Sie als Nächstes das Fidschi-Linienwerkzeug und zeichnen Sie eine Linie zwischen den beiden inneren elastischen Lamina auf jeder Seite des arteriellen Lumens. Klicken Sie dann auf Steuerelement M, um die Länge in der Ergebnistabelle anzugeben. Zeichnen Sie weitere Linien, um die Dicke jeder Wand zu messen, und speichern Sie die endgültige Messung.Wechseln Sie zu einem 60-fachen Objektiv mit einer numerischen Apertur von eins oder mehr. Stellen Sie die Kollagen- und Elastin-Mikroarchitektur bei fünf Millimetern Quecksilbersäule dar, indem Sie die gesamte Dicke der Arterienwand scannen. Definieren Sie als Nächstes die Start- und Endtiefe des Z-Stapels sowie den Z-Schrittabstand und die Pixeldichte.Achten Sie beim Entwerfen der Z-Stapel darauf, dass der interessierende Bereich klein genug ist, um Rückschlüsse auf die Krümmung bei der nachfolgenden Analyse zu vermeiden. Wenn Sie fertig sind, legen Sie fest, dass jeder Kanal separat gespeichert wird. Suchen Sie schließlich ein bis drei verschiedene Bereiche von Interesse und erhalten Sie 3D-Bildstapel von guter Qualität.Wenn Ihre Elastin-Autofluoreszenz bleicht, verwenden Sie eine zu hohe Anregungslichtleistung. Dies sollte vermieden werden. Um Ihr laufendes Experiment zu beenden, können Sie eine verdünnte Konzentration von Eosin hinzufügen, um die Elastin-Autofluoreszenz zu verbessern.Wenn Sie fertig sind, wiederholen Sie den gesamten Vorgang bei Drücken von bis zu 100 Millimetern Quecksilbersäule und ersetzen Sie den Puffer in der Myographenkammer nach jedem Druckschritt durch frisches HBS mit 37 Grad Celsius. Um mit der Bildanalyse zu beginnen, öffnen Sie den Elastin-Bildstapel in Fidschi. Gehen Sie dann zum Bild, klicken Sie auf Stapel und wählen Sie Z-Projekt, um die Bilder auszuwählen, mit denen gearbeitet werden soll, und wählen Sie die maximale Intensität für den Projektionstyp.Speichern Sie die Projektion mit maximaler Intensität als TIFF-Bild. Wählen Sie dann so viele interne elastische Lamellenfaserverzweigungspunkte wie möglich aus und messen Sie diese mit dem Winkelwerkzeug. Arbeiten Sie jedes Bild systematisch durch und speichern Sie das Fidschi-Ergebnisblatt, wenn Sie fertig sind.Um die Welligkeit des adventitiellen Kollagens zu messen, öffnen Sie den Kollagen-Bildstapel in Fidschi. Gehen Sie als Nächstes zu Bild nach unten zu Stapel und wählen Sie Z-Projekt, um Bilder auszuwählen, mit denen Sie arbeiten möchten, und um die maximale Intensität der Projektion einzustellen. Ändern Sie nun den Bildtyp in ein Acht-Bit-TIFF-Bild, indem Sie auf Bild, Eingabe und dann auf Acht-Bit klicken.Speichern Sie die Projektion mit maximaler Intensität als TIFF-Bild. Öffnen Sie das Neuron J-Plugin, indem Sie auf Fidschi klicken und Neuron J unter Plugins auswählen. Öffnen Sie dann die Acht-Bit-TIFF-Datei in Neuron J.Klicken Sie nach dem Öffnen auf Tracings hinzufügen und wählen Sie die zu analysierenden Fasern aus, indem Sie auf den Anfang und das Ende jeder Faser klicken.Gehen Sie als Nächstes zu Messverfolgungen und wählen Sie im Dialogfeld die Option Verfolgung und Scheitelpunktmessungen anzeigen aus. Um die Geradheit der Collagefaser zu berechnen, kopieren Sie zunächst die Werte im Fenster "Fiji-Spuren" in Excel. Die Längenwerte im Spurenfenster sind Maße für die volle Länge der analysierten Kollagenfasern Lf. Zweitens kopieren Sie für jedes analysierte Kollagenfaserbündel die ersten und letzten XY-Koordinaten des Fiji-Vertices-Fensters nach Excel.Berechnen Sie dann die Länge der Geraden, die jedes Ende der analysierten Kollagenfaser L0 verbindet, unter Verwendung des Satzes des Pythagoras. Die Geradheit der Kollagenfaser wird schließlich als L0/Lf berechnet. In Anlehnung an das eben gezeigte Protokoll wurde der breiteste Teil der Arterie identifiziert und zu diesem Zeitpunkt mit Hilfe der markierungsfreien Fluoreszenzmikroskopie gescannt, um den maximalen Gefäßdurchmesser und die Gefäßwanddicke zu messen.Durch die Verwendung einer höheren Vergrößerung für ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur können nicht nur der Gefäßdurchmesser und die Wandstärke gemessen werden, sondern auch die Mikroarchitekturen von Kollagen und Elastin. Die Mikroarchitekturen der Verzweigungswinkel der Elastinfaser und die Geradheit des Kollagens können mit der entsprechenden Bildanalysesoftware in aufeinanderfolgenden Bildabschnitten bestimmt werden. Dies ermöglicht eine direkte Analyse des Zusammenhangs zwischen den druckinduzierten Veränderungen in den Mikroarchitekturen von Kollagen und Elastin und dem inkrementellen Elastizitätsmodul bei verschiedenen Drücken.Nach diesem Verfahren können auch andere Informationen aus den Bildern extrahiert werden. Dies könnten die Orientierungswinkel von adventitiellem Kollagen entlang der Gefäßlängsachse sein, oder es könnte die Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix in Tunica media sein. Die mit dieser Methode aus den Bildern extrahierten quantitativen Maße können in mathematische Modelle eingespeist werden, um aufzuklären, wie der gesunde und der verstorbene menschliche Kreislauf auf unterschiedliche Bedingungen reagieren.Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gründliches Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre bildgebenden Experimente und die anschließende Bildanalyse planen, um Informationen darüber zu erhalten, wie Druck Veränderungen in der Mikroarchitektur der Widerstandsarterienwand induziert. Denken Sie daran, dass Sie bei der Arbeit mit der Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie jegliche Exposition gegenüber sichtbarem und unsichtbarem Licht vermeiden müssen.

assessing-collagen-elastin-pressure-dependent-microarchitectures-live

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Zellulären Prozessen wie Zellmigration haben sich traditionell auf zweidimensionale, steifen Kunststoff-Oberflächen untersucht. Dieser Bericht beschreibt eine Technik zur direkten Visualisierung von Protein-Lokalisierung und Analyse von Protein-Dynamik in Zellen wandern in eine physiologisch relevante, dreidimensionale Matrix.

Live-Cell-Imaging von wandernden Zellen mit dem Ausdruck Fluoreszenz-markierten Proteinen in einer dreidimensionalen Matrix

Raman-Spektroskopie ist eine geeignete Technik für die berührungslose, Label-freie Analyse lebender Zellen, Tissue-Engineering-Konstrukten und nativen Geweben. Quellenspezifische spektralen Fingerabdrücke können generiert und analysiert werden mit multivariaten Analyse.

Berührungslose, Label-freie Überwachung von Zellen und extrazellulären Matrix mittels Raman-Spektroskopie

Quelle: Alluri, H., et al. Sauerstoff-Glukose-Entzug und Reoxygenierung als In-vitro-Ischämie-Reperfusions-Verletzungsmodell zur Untersuchung der Blut-Hirn-Schranken-Dysfunktion. J. Vis. Exp. (2015). Das Video zeigt die fluoreszierende Lokalisierung von Tight-Junction-Proteinen und Stressfasern in mikrovaskulären Endothelzellen (RBMECs) des Rattengehirns. In der gestressten Monoschicht werden fluoreszenzmarkierte Antikörper verwendet, um die Tight-Junction-Proteine zu markieren, während...

Fluoreszenzlokalisation von Tight Junction Proteinen und Stressfasern in Endothelzellen

Zeitraffermikroskopie und Bildverarbeitungstechniken wurden eingesetzt, um die fibroblast-vermittelte Gelverdichtung und Die Fibrinfaser-Neuausrichtung in einem umweltkontrollierten Bioreaktor über einen Zeitraum von 48 Stunden zu beobachten und zu analysieren.

Beobachtung und Quantifizierung von Fibroblasten-vermittelter Fibrin-Gelverdichtung

Morbus Dupuytren (DD) ist ein fibroproliferative Erkrankung der Handfläche der Hand. Hier stellen wir ein Protokoll zur Kultur Resektionsproben aus DD in einem dreidimensionalen (3D) Kultur-System. Solche Kurzzeitkultur-System ermöglicht die Erhaltung der 3D-Struktur und molekularen Eigenschaften des fibrotischen Gewebe.

Menschen Dupuytren&#39;sche<em&gt; Ex vivo</em&gt; Kultur für das Studium der Myofibroblasten und extrazellulären Matrix-Interaktionen

Die Funktion der vaskulären Zellen hängt von der Aktivität der intrazellulären Botenstoffe ab.  Beschrieben wird hier ein ex vivo Zwei-Photonen-Bildgebungsverfahren, das die Messung des intrazellulären Calcium- und Stickoxidspiegels als Reaktion auf physiologische und pharmakologische Reize in einzelnen endothelialen und glatten Muskelzellen einer isolierten Aorta ermöglicht.

Zwei-Photonen-Imaging von intrazellulären Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Transport- und Stickoxid-Produktion in Endothelzellen und glatte Muskelzellen eines isolierten Rattenaorta

Präsentiert wird hier ein Protokoll zur Untersuchung der koronaren Mikrozirkulation im lebenden murinen Herzgewebe durch ex vivo-Überwachung des arteriellen Perfusionsdrucks und -flusses, der den Druck aufrechterhält, sowie gefäßvaskulärer Baumbestandteile, einschließlich der Kapillarbetten und Pericyten, da die Septalarterie kanüliert und unter Druck steht.

Dynamische Messung und Bildgebung von Kapillaren, Arteriolen und Pericyten im Mausherz

Wir haben eine Mechano-Imaging-Pipeline entwickelt, um die heterogenen strukturellen und mechanischen atherosklerotischen Plaqueeigenschaften zu untersuchen. Diese Pipeline ermöglicht die Korrelation des lokal vorherrschenden Winkels und der Dispersion der Kollagenfaserorientierung, des Bruchverhaltens und der Dehnungsfingerabdrücke des fibrösen Plaquegewebes.

Eine Methode zur Untersuchung der Korrelation zwischen lokaler Kollagenstruktur und mechanischen Eigenschaften von atherosklerotischem Plaque-Fasergewebe

Dieses Protokoll enthält eine Schritt-für-Schritt-Anleitung für die simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multiharmonische (SLAM)-Mikroskopietechnik, einschließlich Details zur Erzeugung der Laserlichtquelle, zur Vorbereitung einer Gewebeprobe, zur Durchführung der Bildgebung und zur Analyse der Daten. SLAM entwickelt die nichtlineare Mikroskopie weiter, indem es vier komplementäre markierungsfreie Kontraste misst, um die Mikroumgebung des Gewebes zu untersuchen.

Simultane markierungsfreie Autofluoreszenz-Multi-Harmonic-Mikroskopie

Hier stellen wir ein Protokoll zur Erhaltung der menschlichen arteriellen Architektur vor, indem gewebestabilisierendes Gel in das Gefäßlumen infundiert wird, bevor es für die molekulare oder histopathologische Analyse geschnitten wird.

In vitro Intraluminale Gelinfusion: Ein fortschrittlicher Ansatz für die mikroskopische Analyse menschlicher Widerstandsarterien

Erfahren Sie die markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie zur Analyse von Kollagen- und Elastin-Mikroarchitekturen in lebenden menschlichen Widerstandarterien. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung druckabhängiger Veränderungen der Gefäßwandmechanik.

Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie (Video) | JoVE Journal

Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

Weitere Videos entdecken