Bewertung von Kollagen und Elastin druckabhängige Mikroarchitekturen in Leben, menschlichen Widerstand Arterien durch markierungsfreie Fluoreszenz-Mikroskopie

Das übergeordnete Ziel dieser Methodik ist es, ein standardisiertes Verfahren zur Gewinnung von Bildern lebender menschlicher Widerstandsarterien zur Analyse der Beziehung zwischen der Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix und der Mechanik der Arterienwand bereitzustellen. Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen der Gefäßbiologie und -mechanik zu beantworten, z. B. wie Druck Veränderungen in der Gesamtgeometrie sowie der Mikroarchitektur der Gefäßwand induziert. Der Hauptvorteil der Technik besteht darin, dass Sie Ihre Probe für die Bildgebung nicht markieren müssen.

Obwohl diese Methode Einblicke in die Mechanik der Widerstandsarterien geben kann, kann eine modifizierte Version des Protokolls auf andere röhrenartige Organe wie die Bronchien oder auf Streifen aus der menschlichen Blase oder der Darmwand angewendet werden. Zu Beginn entnehmen Sie unmittelbar nach ihrer Exzision während der Operation Gewebeproben von Interesse und bereiten die Gefäße vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Eine kanülierte Arterie auf fünf Millimeter Quecksilbersäule unter Druck setzen.

Richten Sie dann den Strahlengang für die Bildgebung ein, indem Sie den Zwei-Photonen-Laser aktivieren und die Anregungswellenlänge auf 820 Nanometer einstellen. Setzen Sie einen dichroitischen Langpassspiegel mit 460 Nanometern ein, um das Emissionslicht auf die Photovervielfacher aufzuteilen und die Emission gleichzeitig in zwei Kanälen zu sammeln. Verwenden Sie 30 bis 60 Nanometer breite Bandpassfilter, die bei 520 Nanometern zentriert sind, um die Elastin-Autofluoreszenz zu sammeln, und einen weiteren, der bei 410 Nanometern zentriert ist, um das Signal zur Erzeugung der zweiten Harmonischen des Kollagens zu sammeln.

Stellen Sie nun die Verweilzeit und das Pixel des Lasers auf 10 Mikrosekunden ein. Stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 Pixel für 100 % Sichtfeld ein. Ermöglichen Sie kontinuierliches Scannen und verwenden Sie eine möglichst geringe Anregungslichtleistung und Pixelverweilzeit, um eine Beschädigung der lebenden Arterie durch das Foto zu vermeiden.

Scannen Sie dann manuell durch die Arterie, um die Ebene mit dem maximalen Durchmesser zu finden. Wählen Sie als Nächstes eine rechteckige Scheibe, die den breitesten Durchmesser der Arterie abdeckt, und scannen Sie ein einzelnes Bild mit einer Pixelgröße von 300 Nanometern pro Pixel oder weniger. Speichern Sie dieses Bild für die Analyse zu einem späteren Zeitpunkt.

Um den Lumendurchmesser und die Wandstärke bei maximalem Durchmesser der Arterie zu bestimmen, laden Sie das Bild zuerst in Fidschi. Stellen Sie die Skala ein, indem Sie auf das Hauptmenü klicken und dann zu Analysieren gehen, gefolgt von Skala einstellen. Geben Sie hier das Mikrometer pro Pixel und das Pixelverhältnis ein.

Wählen Sie als Nächstes das Fidschi-Linienwerkzeug und zeichnen Sie eine Linie zwischen den beiden inneren elastischen Lamina auf jeder Seite des arteriellen Lumens. Klicken Sie dann auf Steuerelement M, um die Länge in der Ergebnistabelle anzugeben. Zeichnen Sie weitere Linien, um die Dicke jeder Wand zu messen, und speichern Sie die endgültige Messung.

Wechseln Sie zu einem 60-fachen Objektiv mit einer numerischen Apertur von eins oder mehr. Stellen Sie die Kollagen- und Elastin-Mikroarchitektur bei fünf Millimetern Quecksilbersäule dar, indem Sie die gesamte Dicke der Arterienwand scannen. Definieren Sie als Nächstes die Start- und Endtiefe des Z-Stapels sowie den Z-Schrittabstand und die Pixeldichte.

Achten Sie beim Entwerfen der Z-Stapel darauf, dass der interessierende Bereich klein genug ist, um Rückschlüsse auf die Krümmung bei der nachfolgenden Analyse zu vermeiden. Wenn Sie fertig sind, legen Sie fest, dass jeder Kanal separat gespeichert wird. Suchen Sie schließlich ein bis drei verschiedene Bereiche von Interesse und erhalten Sie 3D-Bildstapel von guter Qualität.

Wenn Ihre Elastin-Autofluoreszenz bleicht, verwenden Sie eine zu hohe Anregungslichtleistung. Dies sollte vermieden werden. Um Ihr laufendes Experiment zu beenden, können Sie eine verdünnte Konzentration von Eosin hinzufügen, um die Elastin-Autofluoreszenz zu verbessern.

Wenn Sie fertig sind, wiederholen Sie den gesamten Vorgang bei Drücken von bis zu 100 Millimetern Quecksilbersäule und ersetzen Sie den Puffer in der Myographenkammer nach jedem Druckschritt durch frisches HBS mit 37 Grad Celsius. Um mit der Bildanalyse zu beginnen, öffnen Sie den Elastin-Bildstapel in Fidschi. Gehen Sie dann zum Bild, klicken Sie auf Stapel und wählen Sie Z-Projekt, um die Bilder auszuwählen, mit denen gearbeitet werden soll, und wählen Sie die maximale Intensität für den Projektionstyp.

Speichern Sie die Projektion mit maximaler Intensität als TIFF-Bild. Wählen Sie dann so viele interne elastische Lamellenfaserverzweigungspunkte wie möglich aus und messen Sie diese mit dem Winkelwerkzeug. Arbeiten Sie jedes Bild systematisch durch und speichern Sie das Fidschi-Ergebnisblatt, wenn Sie fertig sind.

Um die Welligkeit des adventitiellen Kollagens zu messen, öffnen Sie den Kollagen-Bildstapel in Fidschi. Gehen Sie als Nächstes zu Bild nach unten zu Stapel und wählen Sie Z-Projekt, um Bilder auszuwählen, mit denen Sie arbeiten möchten, und um die maximale Intensität der Projektion einzustellen. Ändern Sie nun den Bildtyp in ein Acht-Bit-TIFF-Bild, indem Sie auf Bild, Eingabe und dann auf Acht-Bit klicken.

Speichern Sie die Projektion mit maximaler Intensität als TIFF-Bild. Öffnen Sie das Neuron J-Plugin, indem Sie auf Fidschi klicken und Neuron J unter Plugins auswählen. Öffnen Sie dann die Acht-Bit-TIFF-Datei in Neuron J.Klicken Sie nach dem Öffnen auf Tracings hinzufügen und wählen Sie die zu analysierenden Fasern aus, indem Sie auf den Anfang und das Ende jeder Faser klicken.

Gehen Sie als Nächstes zu Messverfolgungen und wählen Sie im Dialogfeld die Option Verfolgung und Scheitelpunktmessungen anzeigen aus. Um die Geradheit der Collagefaser zu berechnen, kopieren Sie zunächst die Werte im Fenster "Fiji-Spuren" in Excel. Die Längenwerte im Spurenfenster sind Maße für die volle Länge der analysierten Kollagenfasern Lf. Zweitens kopieren Sie für jedes analysierte Kollagenfaserbündel die ersten und letzten XY-Koordinaten des Fiji-Vertices-Fensters nach Excel.

Berechnen Sie dann die Länge der Geraden, die jedes Ende der analysierten Kollagenfaser L0 verbindet, unter Verwendung des Satzes des Pythagoras. Die Geradheit der Kollagenfaser wird schließlich als L0/Lf berechnet. In Anlehnung an das eben gezeigte Protokoll wurde der breiteste Teil der Arterie identifiziert und zu diesem Zeitpunkt mit Hilfe der markierungsfreien Fluoreszenzmikroskopie gescannt, um den maximalen Gefäßdurchmesser und die Gefäßwanddicke zu messen.

Durch die Verwendung einer höheren Vergrößerung für ein Objektiv mit hoher numerischer Apertur können nicht nur der Gefäßdurchmesser und die Wandstärke gemessen werden, sondern auch die Mikroarchitekturen von Kollagen und Elastin. Die Mikroarchitekturen der Verzweigungswinkel der Elastinfaser und die Geradheit des Kollagens können mit der entsprechenden Bildanalysesoftware in aufeinanderfolgenden Bildabschnitten bestimmt werden. Dies ermöglicht eine direkte Analyse des Zusammenhangs zwischen den druckinduzierten Veränderungen in den Mikroarchitekturen von Kollagen und Elastin und dem inkrementellen Elastizitätsmodul bei verschiedenen Drücken.

Nach diesem Verfahren können auch andere Informationen aus den Bildern extrahiert werden. Dies könnten die Orientierungswinkel von adventitiellem Kollagen entlang der Gefäßlängsachse sein, oder es könnte die Mikroarchitektur der extrazellulären Matrix in Tunica media sein. Die mit dieser Methode aus den Bildern extrahierten quantitativen Maße können in mathematische Modelle eingespeist werden, um aufzuklären, wie der gesunde und der verstorbene menschliche Kreislauf auf unterschiedliche Bedingungen reagieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gründliches Verständnis dafür haben, wie Sie Ihre bildgebenden Experimente und die anschließende Bildanalyse planen, um Informationen darüber zu erhalten, wie Druck Veränderungen in der Mikroarchitektur der Widerstandsarterienwand induziert. Denken Sie daran, dass Sie bei der Arbeit mit der Zwei-Photonen-Anregungsfluoreszenzmikroskopie jegliche Exposition gegenüber sichtbarem und unsichtbarem Licht vermeiden müssen.