Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Sortierprotokoll im Bereich der Stammzellen zu beantworten, indem sie ein Verfahren zur direkten Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus der Synovialflüssigkeit bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll für die Isolierung und Reinigung von MACS aus der Synovialflüssigkeit des Kaninchens entwickelt haben. Generell betreiben wir in der Forschung aufgrund dieser Methode große Anstrengungen, da die Pluration der Zellpopulation von der Produktion einer einzigen Zellsuspension abhängt.

Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir feststellten, dass derzeit nur das magnetisch-aktivierte Zellsortierverfahren von der FDA für klinische Anwendungen zugelassen ist. Beginnen Sie diesen Vorgang mit einer Tieranästhesie, wie im Textprotokoll beschrieben. Um eine Sammlung von Gelenksynovialflüssigkeit aus dem Knie des Kaninchens durchzuführen, wählen Sie einen Bereich von etwa fünf mal fünf Zentimetern Größe um das Knie aus.

Rasieren Sie die Kaninchenhaare in diesem Bereich mit einem Sicherheitsrasierer. Alternativ desinfizieren Sie die Eingriffsstelle dreimal mit Povidon-Jod-Lösung und 75%igem Ethanol. Tragen Sie dann sterile Abdecktücher auf, nachdem der Bereich gründlich getrocknet ist.

Verwenden Sie eine sterile Injektionsspritze, um ein bis zwei Milliliter isotonische Kochsalzlösung aus dem lateralen Gelenkspalt in die Kniegelenkhöhle zu injizieren. Bewegen Sie das Knie drei- bis viermal und saugen Sie dann die gesamte Synovialflüssigkeit bei Raumtemperatur ab. Filtern Sie die Synovialflüssigkeit innerhalb von vier Stunden durch ein 40-Mikron-Nylon-Zellsieb, um Ablagerungen zu entfernen.

Um die Kaninchen-SF-MSCs zu kultivieren, sammeln Sie die gefilterte Flüssigkeit in 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie sie zehn Minuten lang bei Raumtemperatur bei 1.500 U/min. Entsorgen Sie den Überstand nach der Zentrifugation und waschen Sie das Pellet mit PBS. Nachdem Sie das Pellet mit dem vollständigen Nährmedium resuspendiert haben, füllen Sie das Medium in 100-Milliliter-Schalen.

Inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Atmosphäre, die 5 % Kohlendioxid enthält. Füllen Sie das Geschirr nach 48 Stunden mit frischem Medium auf, um nicht anhaftende Zellen zu entfernen. Tauschen Sie das Medium zwei Wochen lang zweimal pro Woche als Durchgang Null aus.

14 Tage nach dem ersten Plattieren sollten sich viele Völker in den Kulturschalen gebildet haben. Wählen Sie die Kolonien aus, die einen Durchmesser von mehr als zwei Millimetern haben. Markieren Sie, wo sich die ausgewählten Kolonien befinden, indem Sie ihren Umfang auf dem Schalenboden nachzeichnen.

Entsorgen Sie die Kolonien, die weniger als zwei Millimeter breit sind, mit Zellschabern. Die ausgewählten Kolonien werden mit etwa fünf Mikrolitern 0,25%igem Trypsin unter Verwendung eines Klonierungszylinders verdaut und in eine neue Schale zur Passage überführt. Wenn die Zellen eine Konfluenz von etwa 80 % erreichen, aspirieren Sie das Medium.

Geben Sie dann ein bis zwei Milliliter 0,25 % Trypsin-EDTA in jedes Gericht. Inkubieren Sie die Schalen zwei bis drei Minuten lang, damit sich die Zellen ablösen können. Sobald die Zellen abgelöst sind, fügen Sie eine gleiche Menge des Kulturmediums hinzu, um das Trypsin zu inaktivieren.

Die Zellsuspension wird durch ein 40-Mikron-Zellsieb geleitet und das Filtrat in einem 15-Milliliter-Röhrchen gesammelt. Dann schleudern Sie die Zellen zehn Minuten lang bei Raumtemperatur bei 600-facher G herunter. Resuspendieren Sie das Zellpellet im MACS Running Buffer.

Um eine magnetische Markierung durchzuführen, bestimmen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer. Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 300-fachem G für zehn Minuten bei vier Grad Celsius. Nach vollständiger Aspiration des Überstands werden 80 Mikroliter Resuspensionspuffer pro zehn Millionen Zellen zugegeben.

Für insgesamt zehn Millionen Zellen fügen Sie 20 Mikroliter Mikrokügelchen hinzu, die mit einem monoklonalen Anti-Kaninchen-CD90-Antikörper konjugiert sind. Mischen Sie die magnetischen Kügelchen und Zellen gleichmäßig in den Röhrchen. Dann inkubieren Sie sie bei vier Grad Celsius für 15 Minuten im Dunkeln.

Geben Sie einen Milliliter Puffer pro zehn Millionen Zellen in das Röhrchen und zentrifugieren Sie dann zehn Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 300 mal G, um die Zellen zu waschen. Den Überstand nach der Zentrifugation verwerfen. Resuspendieren Sie das Pellet in 500 Mikrolitern Puffer pro zehn Millionen Zellen.

Platzieren Sie die Säule mit den Säulenflügeln nach vorne in das Magnetfeld des Magnetabscheiders. Spülen Sie die Magnetabscheidersäule mit 500 Mikrolitern des Puffers pro zehn Millionen Zellen. Übertragen Sie die einzellige Suspension in die Säule.

Lassen Sie die negativen Zellen das Magnetfeld passieren, um diese unmarkierten Zellen zu verwerfen. Waschen Sie die Säule ein- bis zweimal mit 500 Mikrolitern des Puffers pro zehn Millionen Zellen und verwerfen Sie den Durchfluss. Übertragen Sie die Säule in ein 15-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.

Fügen Sie der Spalte einen Milliliter des Puffers pro zehn Millionen Zellen hinzu. Schieben Sie dann sofort den Kolben in die Säule, um die magnetisch markierten Zellen auszuspülen. Wiederholen Sie das oben beschriebene Verfahren mit einer zweiten magnetischen Abscheidersäule, um die Reinheit von CD90-positiven Zellen zu erhöhen, die die eluierte Fraktion anreichern können.

Nachdem die Zellsuspension zehn Minuten lang bei 300-fachem G zentrifugiert wurde, aspirieren Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet mit dem Kulturmedium. Beimpfen Sie die Zellen in 100 Milliliterschalen nach der magnetisch aktivierten Zellsortierung. Inkubieren Sie die Schalen bei 37 Grad Celsius in einem befeuchteten Zellinkubator mit 5 % Kohlendioxid.

Wenn eine Konfluenz von 80 bis 90 % der Primärkultur erreicht ist, verdauen Sie die adhärenten Zellen nach etwa sieben bis zehn Tagen mit 0,25 % Trypsin-EDTA und passieren Sie sie in einer Verdünnung von eins bis zwei, um die zweite Passage zu machen. Verwenden Sie die gleiche Methode, um die Zellen zu Passage drei zu gelangen, die für die In-vitro-Assays verwendet werden kann. Hier ist die Morphologie der monolayer-kultivierten Kaninchen-SF-MSCs vor und nach MACS unter einem inversen Mikroskop zu sehen.

Vor der Sortierung weisen die adhärenten Zellpopulationen der Kaninchen-Synovialflüssigkeit eine Heterogenität auf. Sie enthalten verschiedene Zelltypen und -größen, wie z. B. ovale, langstellerige, kurzspindelige und sternförmige Morphologie. Die Hauptmorphologie von Passage zwei und Passage sechs ist eine Spindelmorphologie.

In Anlehnung an MACS mit CD90 weisen die Zellpopulationen eine homogene Morphologie auf. Mit der Subkultur nimmt die Zellzahl zu. Die durchflusszytometrische Analyse zeigte, dass Kaninchen-SF-MSC-Zellen positiv auf die MSC-Marker CD44 und CD105 waren.

Während negativ für den endothelialen Zellmarker CD34 und für den hämatopoetischen Zellmarker CD45. Die Ergebnisse zeigten, dass die SF-MSC-Population des Kaninchens vor MACS zu etwa 40 % aus MSC-Zellen bestand. Nach MACS enthielt die angereicherte Population mehr als 99 % MSC-Zellen.

Hier ist die durchflusszytometrische Analyse des CD90-positiven Markers vor und nach der MAC-Sortierung zu sehen. Die Alizarinrot-Färbung zeigte, dass sich unter osteogener Induktion drei Wochen lang mineralisierte Knötchen bildeten. Nach dreiwöchiger adipogener Induktion wurde eine Akkumulation lipidreicher Vakuolen durch intrazelluläre Öl-Rot-O-Färbung nachgewiesen.

Nach drei Wochen chondrogener Induktion wurde das Zellpellet histologisch mit Toluidinblau-Färbung untersucht. Das positiv saure Proteoglykan charakterisierte die Chondrozyten-ähnlichen Zellen. Nach dreiwöchiger Induktion wurde die relative mRNA-Expression des Osteoblastenmarkers, des adipogenen Markers und des chondrogenen Markers nachgewiesen.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in zwei bis vier Stunden durchgeführt werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus der Synovialflüssigkeit des neuseeländischen weißen Kaninchens haben. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, die Kolonien auszuwählen, die einen Durchmesser von mehr als zwei Millilitern haben.

Stellen Sie vor der immunmagnetischen Sortierung auch eine Einzelzellsuspension her, da unerwünschte Zellen, die an eine markierte Zelle gebunden sind, auf der magnetischen Kugel verbleiben. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die fluoreszenzaktivierte Zellsortierung durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Sicherheit und Wirksamkeit der Aufreinigung von mesenchymalen Stammzellen zu beantworten. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gelenkknorpelregeneration, um die idealen Zöliakiezellen für die Gelenkknorpelreparatur zu erforschen.

Vergessen Sie nicht, dass die Operationen auf der Fußgewölbekühlbank durchgeführt wurden und die Vorsichtsmaßnahmen wie Handschuhe bei der Durchführung dieses Verfahrens immer getroffen werden sollten. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Gelenkknorpelverletzungen, da aus der Synovialflüssigkeit gewonnene MASC vielversprechende Kandidaten für die Regeneration des Gelenkknorpels sind.