Name: Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 20 s
Description: Lernen Sie die magnetische Zellsortierung zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus Synovialflüssigkeit von Kaninchen. Diese einfache Methode ermöglicht effiziente Aufreinigung für regenerative Medizin.

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Diese Studie wurde finanziell unterstützt durch die folgende Zuschüsse: Natural Science Foundation of China (Nr. 81572198; (Nr. 81772394); der Fonds für hohe Niveau medizinische Disziplin Bau von Shenzhen-Universität (Nr. 2016031638); die medizinische Forschung Grundlage der Guangdong Provinz, China (Nr. A2016314); Shenzhen-Wissenschaft und Technologie-Projekte (No. JCYJ20170306092215436; Nein. JCYJ20170412150609690; Nein. JCYJ20170413161800287; Nein. SGLH20161209105517753; Nein. JCYJ20160301111338144).

Alle Tierversuche wurden entsprechend den regionalen Ethik-Kommission Leitlinien durchgeführt, und alle tierische Verfahren von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss von Shenzhen zweite Krankenhaus, Shenzhen-Universität angenommen wurden.
(1) isolieren und Kultur der RbSF-MSCs
<ol><li>
Vorbereitungen für das Tier Verfahren
	<ol>
<li>Bereiten Sie skelettartig Reifen weiblichen Neuseeland weiße Kaninchen für die Sammlung von RbSF-MSCs Perform eine klinische Untersuchung der Kaninchen einen Tag vor Ablauf der Anästhesie und gelenkpunktion. Hinweis: körperliche Untersuchungen gehören Gewicht (2,0-2,5 kg), Geschlecht (weiblich), und Körpertemperatur, Atemfrequenz und Herzfrequenz. Parameter-Intervalle für klinisch gesunde Kaninchen sind 30-50 min für Atmung, Herzfrequenz 220-280 min und 38-39 ° C für die Körpertemperatur.</li>
		<li>Schnell die Tiere für 6 Stunden vor der Narkose.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitungen und das Verfahren für die tierischen Anästhesie
	<ol>
<li>Die Kaninchen mit Käfig zurückhalten (siehe Tabelle der Materialien), und dann 3 % Pentobarbital-Natrium in die Vene marginal Ohr bei einer Dosis von 1 mL/kg für die Vollnarkose zu injizieren.</li>
		<li>Legen Sie die Kaninchen in einer bequemen Position dorsal-Liegerad.</li>
		<li>Überwachen Sie die Atemfrequenz, Herzfrequenz und Körpertemperatur des Kaninchens während der Narkose.</li>
		<li>Verwenden Sie ophthalmologische Salbe auf seine Augen, um Trockenheit während der Narkose zu verhindern.</li>
		<li>Die Tiefe der Narkose nach Guedel Klassifizierung14zu beurteilen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung für MSCs Isolierung und Kultivierung
	<ol>
<li>Um RbSF-MSCs zu kultivieren, 500 mL von kommerziellen Kulturmedium vorzubereiten (siehe Tabelle der Materialien) ergänzt mit 10 % kommerzielle ergänzen (siehe Tabelle der Materialien), 10 % fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % Penicillin-Streptomycin.</li>
		<li>Inkubieren Sie das Nährmedium bei 37 ° C im Wasserbad.</li>
		<li>Zelle Isolation und Zelle waschen 500 mL von Phosphat Puffer Kochsalzlösung (PBS) vorbereiten.</li>
		<li>Das Knie Hohlraum gelenkpunktion Verfahren 100 mL isotonischer Kochsalzlösung vorbereiten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Sammlung von Gelenkknorpel synovialen ﬂ Uid vom Knie des Kaninchens
	<ol>
<li>Wählen Sie einen Bereich ca. 5 x 5 cm in der Größe um das Knie und das Kaninchen Haar aus diesem Bereich mit einem Elektrorasierer Sicherheit.</li>
		<li>Abwechselnd, desinfizieren die Prozedur Website 3 X mit Povidon-Jod-Lösung und 75 % Ethanol. Wenden Sie dann sterile Tüchern, nach Bereich gründlich getrocknet ist.</li>
		<li>Injizieren Sie 3-4 x 1-2 mL Isotonische Kochsalzlösung, eine sterile Injektionsspritzen (2 mL), in die Knie gelenkspalt aus dem lateralen Gelenk Raum, bewegen Sie mit Hilfe des Knies zu, und dann saugen Sie die Gelenkflüssigkeit bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Filtern der synovialen Geruchsbelastung durch ein 40 µm Nylon Zelle Sieb, Ablagerungen innerhalb von 4 Stunden zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur der RbSF-MSCs
	<ol>
<li>Sammeln Sie die gefilterten Geruchsbelastung in 50 mL Zentrifuge Tuben und Zentrifuge bei 1.500 u/min für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Den überstand nach der Zentrifugation zu verwerfen, das Pellet mit PBS waschen Aufschwemmen der Pellets mit dem kompletten Kulturmedium und dann Platte des Mediums in 100 mm Schalen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C in eine feuchte Atmosphäre mit 5 % CO2.</li>
		<li>Ergänzen Sie nach 48 h die Gerichte mit frischen Medium, nicht-adhärenten Zellen zu entfernen. Ersetzen Sie das Medium zweimal pro Woche für 2 Wochen als Durchgang 0 (P0). Hinweis: Sollte ca. 1 x 104 adhärente Zellen. Lebensfähige Zellen/ml in San Francisco sind etwa 2 x 102/mL.</li>
		<li>Nach 14 Tagen nach der ersten Beschichtung sollten viele Kolonien in den Kultur-Gerichten gebildet haben. Wählen Sie aus die Kolonien, die größer als 2 mm Durchmesser. Markieren Sie die ausgewählten Kolonien befinden sich durch ihren Umfang auf der Unterseite der Schüssel nachzeichnen.</li>
		<li>Die Kolonien < 2 mm breit, mit Zelle Schaber zu verwerfen. Verdauen Sie die ausgewählten Kolonien mit etwa 5 µL 0.25 % Trypsin, mit einem Klon Zylinder und übertragen Sie die Kolonien auf ein neues Gericht als Durchgang 1 (P1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Postoperative Pflege der Tiere
	<ol>
<li>Folgen Sie institutionelle operativen Standardverfahren für die postoperative Überwachung und Erholung aus der Narkose.</li>
		<li>Überwachen Sie die Vitalfunktionen des Kaninchens alle 10 Minuten, bis er das Bewusstsein wiedererlangt hat. Schließlich übertragen Sie das bewusste Tier in den Käfig. Ein Kaninchen, die Operation, um die Gesellschaft anderer Tiere durchlaufen hat, bis es vollständig erholt hat nicht zurück.</li>
		<li>Nach der Operation, Desinfizieren Sie die Website mit 0,1 % Povidon-Jod, 2 x pro Tag für 3 Tage.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. CD90-Positive magnetische aktiviert Zelle Sortieren (MACS) des RbSF-MSCs und Primärkultur
<ol><li>
Vorbereitung der Probe
	<ol>
<li>Wenn die Zellen herum erreichen 80 % Konfluenz Aspirieren Sie das Medium, und fügen Sie 1-2 mL von 0,25 % Trypsin-EDTA, jedes Gericht.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Gerichte für 2 – 3 min. zur Ablösung der Zelle zu ermöglichen.</li>
		<li>Sobald die Zellen getrennt sind, fügen Sie eine gleiche Menge des Kulturmediums, die Trypsin zu inaktivieren.</li>
		<li>Die Zellsuspension durch ein 40 µm Zelle Sieb passieren, das Filtrat in einem 15 mL Röhrchen zu sammeln und dann spin-down der Zellen bei 600 × g für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zelle Pellet in MACS mit Puffer (PBS, pH 7,2, 0,5 % Rinderserumalbumin und 2 mM EDTA) und zählen Sie die Anzahl von Zellen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Magnetische Kennzeichnung Hinweis: Sortieren der RbSF-MSCs mit einer magnetischen aktiviert Zelle Sortieren Kit mit Spalten, einem Ständer und Separatoren (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Bestimmen Sie die Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer.</li>
		<li>Zentrifugieren der Zellsuspension bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C. Aspirieren Sie völlig überstand.</li>
		<li>80 µL Wiederfreisetzung Puffer pro 107 total Zellen hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie für 107 total Zellen 20 µL Microbeads mit einem monoklonalen Anti-Kaninchen CD90 Antikörper konjugiert.</li>
		<li>Mischen Sie die magnetische Beads und Zellen gleichmäßig in den Röhren, dann inkubieren sie bei 4 ° C für 15 Minuten im Dunkeln.</li>
		<li>Das Rohr 1 mL Puffer pro 107 Zellen hinzu, und Zentrifugieren Sie es bei 300 × g für 10 min bei 4 ° C, die Zellen zu waschen. Entsorgen Sie den überstand nach der Zentrifugation.</li>
		<li>Das Pellet in 500 µL Puffer pro 107 Zellen aufzuwirbeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Magnetische Trennung
	<ol>
<li>Setzen Sie die Säule mit der Spalte Flügel nach vorne in das Magnetfeld der Magnetabscheider.</li>
		<li>Spülen Sie die Spalte Magnetabscheider (MS) mit 500 µL Puffer pro 107 Zellen.</li>
		<li>Übertragen Sie die einzigen Zellsuspension in der Spalte. Lassen Sie die negativen Zellen durchlaufen das magnetische Feld um diese unbeschrifteten Zellen zu verwerfen.</li>
		<li>Waschen der Spalte 1-2 X mit 500 µL Puffer pro 107 Zellen und entsorgen Sie den Durchfluss.</li>
		<li>Übertragen Sie die Spalte in ein Zentrifugenröhrchen (15 mL).</li>
		<li>Fügen Sie 1 mL des Puffers pro 107 Zellen der Spalte, und schieben Sie dann sofort den Kolben in die Spalte zu spülen, die magnetisch markierten Zellen.</li>
		<li>Wiederholen Sie die vorgenannten Verfahren mit ein zweite MS Column die Reinheit des CD90 erhöhen+ Zellen, die der eluierten Bruchteil bereichern können.</li>
		<li>Die Zellsuspension bei 300 × g für 10 min zentrifugieren, überstand Aspirieren und mit dem Kulturmedium Aufschwemmen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Kultur von der CD90+ RbSF-MSCs
	<ol>
<li>Die Zellen in 100 mm Schalen nach magnetisch aktivierte Zellsortierung zu impfen.</li>
		<li>Inkubieren Sie die Gerichte bei 37 ° C in einem befeuchteten Zelle Inkubator mit 5 % CO2.</li>
		<li>Bei 80-90 % Zusammenfluss von der Primärkultur, bei etwa 7-10 Tage erreicht wird, verdauen die adhärenten Zellen mit 0,25 % Trypsin-EDTA und Passage bei einer Verdünnung von 1:2 zu Abschnitt 2 (P2).</li>
		<li>Verwenden Sie dieselbe Methode, die Zellen, die Passage 3 (P3) übergeben, die für die in-vitro- Tests verwendet werden kann. Hinweis: Nach der Subkultur und Reinigung, werden ca. 1 x 107 RbSF-MSCs gewonnen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Identifizierung von RbSF-MSCs
<ol><li>
Surface Marker Bestätigung der RbSF-MSCs durch Durchflusszytometrie
	<ol>
<li>Wenn die MSCs 80-90 % Zusammenfluss bei P3 sind, die Zellen mit PBS waschen und behandeln sie mit 0,25 % 1 mL Trypsin-EDTA. MSCs bei 37 ° C für ca. 2-3 min inkubieren dann, bis die Zellen gelöst werden.</li>
		<li>Ernte der Zellen mit 10 mL PBS, übertragen Sie sie in einem konischen Rohr (15 mL) und Zentrifugieren sie 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Entsorgen Sie die Überstände. Aufschwemmen der Zelle Pellet in 500 µL PBS und in einem 1,5 mL-Tube zu übertragen.</li>
		<li>Inkubieren Sie eine 1: 100 Verdünnung von FITC konjugiert und PE-konjugierten Antikörpern (Isotype, FITC-CD34/PE-CD45, FITC-CD105/PE-CD44) für 1 h im Dunkeln bei 4 ° c</li>
		<li>Zentrifugieren Sie dieses Gemisch bei 300 × g für 5 min bei Raumtemperatur und waschen Sie die Zellen zweimal mit PBS durch Zentrifugation bei 300 × g für 5 min jedes Mal zu. Entsorgen Sie die Überstände.</li>
		<li>Aufschwemmen der Zellen in 500 µL PBS, übertragen die Zellsuspension in ein Rundboden Röhrchen (5 mL) und es mit einem Durchflusszytometer analysiert. Hinweis: Daten auf eine Cytometer ausgestattet mit zwei Fluoreszenz Kanäle erwerben: 533/30 und 585/40. Verwenden Sie für jedes Isotype Fluoreszenz die Isotype-Steuerelement, um die geeigneten Laser-Spannung einstellen, und stellen Sie die minimale Intensität erforderlich, um ein Fluoreszenz-Histogramm zu erhalten, die linken und rechten Ränder der Spitze zeigt. Ein Minimum von 10.000 Veranstaltungen für die statistischen Analysen zu sammeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Multidifferentiation von der RbSF-MSCs Hinweis: Verwendung P3 RbSF-MSCs für in-vitro- multidifferentiation Assays.<ol>
<li>
Osteogene Differenzierung
		<ol>
<li>Bereiten Sie das osteogene Induktion Medium: DMEM Basic (1 X) mit 50 mM L-Ascorbinsäure-Säure-2-Phosphat, 10 mM von α-glycerophosphat und 100 nM von Dexamethason.</li>
			<li>Samen der Zellen bei 103 Zellen/cm2 in einer Gewebekultur 6-Well-Platte und Kultur sie mittelfristig osteogene Induktion.</li>
			<li>Ändern der Induktion Mittel alle 3 Tage für 3 Wochen.</li>
			<li>Befestigen Sie die Zellen mit 4 % Formaldehyd für 30 min bei Raumtemperatur nach Abschluss der Differenzierung, die Zellen färben mit 1 % Alizarin rot für 5 min und dann waschen Sie 3 X mit PBS15.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Adipogenen Differenzierung
		<ol>
<li>Vorbereiten der adipogenen Induktion Medium: DMEM Basic (1 X) bestehend aus 100 mM von Indometacin, 10 mg/mL rekombinante Humaninsulin und 1 mM von Dexamethason 0,5 mM 3-Isobutyl-1-methylxanthin.</li>
			<li>Die P3-RbSF-MSCs für 3 Wochen in der adipogenen Induktion Medium zu behandeln.</li>
			<li>Färben Sie nach 3 Wochen die neutral Lipid Vakuolen mit Öl Rot O adipogenen Differenzierung zu bestätigen. Die Zellen in einer 4 % Formaldehyd-Lösung für 30 min bei Raumtemperatur zu beheben, und wasche sie dann 3 X mit PBS16.</li>
		</ol>
</li>
		<li>
Chondrogenic Differenzierung
		<ol>
<li>Vorbereiten der Chondrogenic Induktion Medium: DMEM Basic (1 X), bestehend aus 10 ng/mL TGFβ1, 1 % seiner Ergänzung, 0,35 mM L-Prolin, 100 nM von Dexamethason, 50 mM L-Ascorbinsäure Säure-2-Phosphat und 1 mm Natrium Pyruvat.</li>
			<li>Verwenden Sie Pellet Kultivierung für die Chondrogenic Induktion. Zentrifugieren Sie 5 × 10-5 P3-RbSF-MSCs bei 1500 u/min für 10 min in einem Polypropylen Röhrchen (15 mL), eine Kugel zu bilden.</li>
			<li>Die Pellets für 3 Wochen mit dem Chondrogenic-Induktion-Medium-Kultur.</li>
			<li>Ändern Sie das Medium alle 3 Tage für 3 Wochen.</li>
			<li>Nach 3 Wochen Induktion, die Zelle Pellet mit Paraffin einbetten, in 4 mm Scheiben Abschnitt, und Färben sie mit 0,1 % Toluidin blau für 30 min bei Raumtemperatur-17.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Insgesamt RNA-Extraktion und Analyse durch quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR)
	<ol>
<li>Isolieren der gesamte-RNS der Zellen nach 3 Wochen Differenzierung Induktion über die kommerzielle RNA-Extraktion kit (siehe Tabelle der Materialien).<ol>
<li>Entfernen Sie das Kulturmedium in der Kulturschale zu, und fügen Sie 1 mL Reagenz isoliert.</li>
			<li>Lyse der Zellen durch wiederholte pipettieren, bis die Lösung homogen ist. Inkubieren Sie es bei Raumtemperatur 3 min.</li>
			<li>Übertragen Sie die Zelle lysate zu einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
			<li>Fügen Sie 100 µL Chloroform hinzu, schütteln Sie sie von Hand 15 X und inkubieren Sie die Mischung bei Raumtemperatur 3 min.</li>
			<li>Zentrifugieren Sie das Rohr auf 12.000 × g für 15 min bei 4 ° C. Übertragen Sie die Überstände zu einem neuen 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.</li>
			<li>Fügen Sie 500 µL Isopropanol und überstürzen Sie sich die RNA für 10 min bei Raumtemperatur.</li>
			<li>Zentrifuge bei 12.000 × g für 10 Minat 4 ° C. Die RNA-Pellet sollten an der Unterseite des Rohres sichtbar.</li>
			<li>Entfernen Sie den überstand zu, und fügen Sie dann 500 µL 75 % Ethanol. Kurz drehen Sie das Rohr für einige Sekunden die RNA-Pellet zu waschen. Zentrifugieren sie bei 7.500 × g für 5 min bei 4 ° C.</li>
			<li>Entfernen Sie die restliche Ethanol.</li>
			<li>Lösen Sie die RNA-Pellet in 10 µL DEPC-Wasser auf und die Rohre auf Eis.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Reverse Transkription total RNA in cDNA mit einer DNA-Synthese kit (siehe Tabelle der Materialien). Hinweis: Führen Sie die folgenden Verfahren auf Eis.<ol>
<li>Vorbereiten der reversen Transkription-master-Mix.</li>
			<li>Jedes Rohr mit 1 µg RNA 25 µL RNA DNase-behandelten hinzufügen.</li>
			<li>Inkubieren Sie die Mischung bei folgenden Temperaturen mit einer PCR-Thermocycler: 26 ° C für 10 min (um die zufällige Hexamers zu tempern zu ermöglichen), 42 ° C für 45 min. (reverse Transkription) und 75 ° C für 10 min (zu inaktivieren die Reverse Transkriptase).</li>
			<li>Sofort analysieren Sie die resultierende cDNA durch quantitative Echtzeit-PCR oder bei-20 ° c Lagern</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie die Genanalyse Ausdruck mit einem quantitative Echtzeit-PCR-System.<ol>
<li>QRT-PCR Master Mix zu verwenden (siehe Tabelle der Materialien) PCR durchführen. Die PCR-Primer für GAPDH, Runx2, Agg und PPARγ sind in Tabelle 1aufgeführt.</li>
			<li>Gen-Expression mit 2−ΔΔCT Methode zu berechnen.</li>
			<li>Führen Sie eine statistische Analyse mit statistischen Standardsoftware. Verwenden Sie einen unabhängige Stichproben t-Test, um die Gruppe Mittel vergleichen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Das Vorhandensein von MSCs in Gelenkflüssigkeit bietet eine Alternative für zellbasierte Therapien. Frühere Studien haben gezeigt, dass Verletzungen Websites höhere Mengen an mesenchymalen Stammzellen in die Gelenkflüssigkeit enthalten, die mit dem posttraumatischen Periode5positiv korreliert werden kann. Die MSCs in Gelenkflüssigkeit können Gewebe für die Verbesserung der spontanen Heilung nach einer Verletzung18,19hilfreich sein. Die kli...

MSCs sind als wertvolle Quelle für die regenerative Medizin, speziell für Knorpel Läsionen vorgeschlagen worden. MSCs, einschließlich Chondrozyten, Osteoblasten, Adipozyten, Skelett Myozyten und viszeralen Stromazellen Zellen erweitern im großen und ganzen die Bereiche für stammzelltransplantationen wegen ihrer hohen Ausdehnung Rate und Multi-Linie Differenzierung potenzielle1. MSCs können von den skelettartigen Muskel, Synovialis, dem Knochenmark und Fettgewebe2,3,4isoliert werden. Erkenntnisse haben auch bestätigte die Anwesenheit von MSCs in Gelenkflüssigkeit und die bisherige Forschung hat als aussichtsreiche Kandidaten für artikuläre Regeneration5,6synovial Flüssigkeit abgeleitet MSCs (SF-MSCs) identifiziert.
Forschung und präklinischen Erprobung auf humanen Proben unterliegen jedoch viele ethische Fragen. Stattdessen, Kaninchen wurden und auch weiterhin die am häufigsten verwendeten Tierarten nachweisen, dass die Transplantation von MSCs Knorpelschäden zu reparieren. In den letzten Jahren eine wachsende Zahl von Forschern untersuchten Kaninchen mesenchymalen Stammzellen (RbMSCs) beide in Vitro und in Vivo, als diese Zellen sind ähnlich wie menschliche MSCs in ihrer Biologie und Gewebe Zellphysiologie. Ebenso sind die RbMSCs in der Lage, des Festhaltens an Kunststoffoberflächen, Spindel-Fibroblasten Morphologie wie menschliche MSCs anzeigen. Darüber hinaus sind Kaninchen mesenchymalen Proben einfach und leicht zu7zu erhalten. Darüber hinaus sind die wichtigsten Punkte, dass RbMSCs oberflächenmarker wie CD44, CD90 und CD105, express und Multi-Linie Differenzierungspotenzial erhalten ist, ist in Übereinstimmung mit den Kriterien für die Identifizierung des MSC Populationen als durch die internationale Gesellschaft für Zelltherapie8,9definiert. Synovial Flüssigkeit Chondroprogenitors sind insbesondere in der Lage, nicht Hypertrophe werden wenn durch TGF-β1, wodurch sie geeignete Zelle Quellen für phänotypisch Gelenkknorpel Regeneration10,11induziert, 12.
Die Isolation der SF-MSCs ist jedoch sehr unterschiedlich zu anderen Geweben, einschließlich der Nabelschnur, Fettgewebe, peripherem Blut und Knochenmark. Derzeit sind die am häufigsten verwendeten Ansätze für die Reinigung und Sortierung von SF-MSCs Durchflusszytometrie und Immunomagnetic Wulst-basierte Sortierung, obwohl die Flow-zytometrie-Methode eine spezielle Umgebung und sehr teure Instrumente13 erfordert.
Dieser Artikel stellt ein Verfahren für die einfache und minimal-invasive Entnahme von Proben von Gelenkflüssigkeit aus Neuseeland weiße Kaninchen. Während des Verfahrens der RbSF-MSCs sind stabil erweiterten in-vitro- und dann mit CD90 positive magnetische Wulst-basierte Verfahren isoliert. Das Protokoll zeigt schließlich, wie MSCs mit hoher Reinheit und Wirtschaftlichkeit aus den geernteten Zelle Quellen zu erreichen.
In diesem Protokoll zeichnen sich die isolierte RbSF-MSCs anhand ihrer Morphologie, Ausdruck spezifischer Marker und Pluripotenz Stammzellen zu gewinnen. Flow Cytometry-basierte Immunphänotypisierung zeigt einen signifikanten positive Ausdruck CD44 und CD105, während der Ausdruck von CD45 und CD34 negativ ist. Schließlich zeigt ein in-vitro- Test für RbSF-MSCs osteogene adipogenen und Chondrogenic Differenzierung der Zellen.

<table><tbody><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MesenGro</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 1703</td><td>Warm in 37 &de; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>MesenGro Supplement</td><td>StemRD</td><td>MGro-500 M1512</td><td>Bestandteil des MSCs-Kulturmediums</td></tr><tr><td>DMEM basic</td><td>Gibco Inc.</td><td>C11995500BT</td><td>MSCs Differenzierungsmedium</td></tr><tr><td>Isotonische Kochsalzlösung</td><td>Litai, China</td><td>5217080305</td><td>Kavitätenarthrozenteseverfahren Reagenz</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td>HyClone Inc.</td><td>SH30256.01B</td><td>PBS, frei von Ca2+/Mg2+</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum (FBS)</td><td>Gibco Inc.</td><td>10099-141</td><td>Bestandteil des MSCs-Kulturmediums</td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung</td><td>Guangdong, China</td><td>150605</td><td>Sterilisationsmittel</td></tr><tr><td>75 % Ethanol</td><td>Lircon, China</td><td>170917</td><td>Sterilisationsmittel</td></tr><tr><td>0,25 % Trypsin/EDTA</td><td>Gibco Inc.</td><td>25200-056</td><td>Reagenz für Zelldissoziation</td></tr><tr><td>1% Penicillin-Streptomycin</td><td>Gibco Inc.</td><td>15140-122</td><td>Bestandteil des MSC-Mediums</td></tr><tr><td>MACS Laufpuffer</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160112089</td><td>Enthält phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS), 0,5 % Rinderserumalbumin (BSA) und 2 mMEDTA</td></tr><tr><td>CD90 Antikörper konjugierte MicroBeads</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>5160801456</td><td>Für die magnetisch aktivierte Zellsortierung</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2256</td><td>Bestandteil von MSCs chondrogen Differenzierung</td></tr><tr><td>Dexamethason</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D1756</td><td>Bestandteil der osteogenen Differenzierung</td></tr><tr><td>von MSCs ITS</td><td>BD</td><td>354352</td><td>1%, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs</td></tr><tr><td>L-Prolin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5607</td><td>0,35 mM, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs</td></tr><tr><td>L-Ascorbinsäure-2-phosphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 mM, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs</td></tr><tr><td>3-Isobutyl-1-methylxanthin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I5879</td><td>0,5 mM, Bestandteil der adipogenen Differenzierung</td></tr><tr><td>Indomethacin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I7378</td><td>100 mM, Bestandteil der adipogenen Differenzierung</td></tr><tr><td>TGF&beta; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/ml, Bestandteil der chondrogenen Differenzierung von MSCs</td></tr><tr><td>&alpha;-Glycerophsphat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G6751</td><td>Bestandteil der osteogenen Differenzierung von MSCs</td></tr><tr><td>CD34 Polyklonaler Antikörper, FITC konjugierter</td><td>Bioss</td><td>bs-0646R-FITC</td><td>Marker für hämatopoetische Stammzellen</td></tr><tr><td>Antikaninchen-CD44</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA806GA</td><td>Thy-1-Membran Glykoprotein (MSCs-Marker)</td></tr><tr><td>CD45 (monoklonaler Antikörper)</td><td>Bio-Rad</td><td>MCA808GA</td><td>Marker für hämatopoetische Stammzellen</td></tr><tr><td>CD105 Antikörper</td><td>Genetex</td><td>GTX11415</td><td>MSCs-Marker</td></tr><tr><td>Isopropylalkohol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I9030</td><td>Ausfällungen RNA-Extraktion organische Phasen</td></tr><tr><td>Trichlormethan</td><td>Wenge, China</td><td>61553</td><td>Extrakt Gesamt-RNA</td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td>Isolat Gesamt-RNA</td></tr><tr><td>SYBR grüner Mastermix</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR420A</td><td>PCR-Test</td></tr><tr><td>cDNA-Synthesekit</td><td>Takara Bio, Japan</td><td>RR047A</td><td>Rückwärtstranskribiert auf komplementäre DNA</td></tr><tr><td>Alizarin Rot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5533</td><td>Färbung von Calciumverbindungen</td></tr><tr><td>Toluidinblau</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>89640</td><td>Färbung von Knorpelgewebe</td></tr><tr><td>Öl Rot O Lösung</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>O1391L</td><td>Lipidvakuolenfärbung</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MiniMACS Separator</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-102</td><td>Für magnetisch aktivierte Zellsortierung</td></tr><tr><td>MultiStand</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-303</td><td>Für magnetisch aktivierte Zellsortierung</td></tr><tr><td>MS Säulen</td><td>MiltenyiBiotec</td><td>130-042-201</td><td>Für die magnetisch aktivierte Zellsortierung</td></tr><tr><td>Zellsieb</td><td>FALCON Inc.</td><td>352340</td><td>40 &mu; m Nylon</td></tr><tr><td>Hämozytometer</td><td>ISOLAB Inc.</td><td>075.03.001</td><td>Zellzählung</td></tr><tr><td>Falcon 100 mm Schale</td><td>Corning</td><td>353003</td><td>Zellkulturschale</td></tr><tr><td>Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>RNA Extraktions- und PCR</td></tr><tr><td>Zentrifugenröhrchen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91050</td><td>Gamma-sterilisierte</td></tr><tr><td>Hochgeschwindigkeitszentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td>Zentrifugenzellen</td></tr><tr><td>Kohlendioxid-Zelle Inkubator</td><td>Thermo scientific</td><td>3111</td><td>Zellkultur</td></tr><tr><td>Real-Time PCR Instrument</td><td>Life Tech</td><td>QuantStudio</td><td>Real-Time quantitative Polymerase-Kettenreaktion</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer</td><td>BD Biosciences</td><td>342975</td><td>Zellanalysator</td></tr><tr><td>Pipettierer</td><td>Eppendorf</td><td>O25456F</td><td>Transfer der Flüssigkeit</td></tr><tr><td>Klonierungszylinder</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3983-50EA</td><td>Isolierung und Entnahme einzelner Zellkolonien</td></tr><tr><td>Sterile Injektionsspritze</td><td>Doppeltaube, China</td><td>131010</td><td>Arthrozentese-Verfahren</td></tr><tr><td>Kaninchenkäfig</td><td>Zhike, China</td><td>ZC-TGD</td><td>Fixieren Sie das Kaninchen</td></tr></tbody></table>

magnetische aktiviert zelle sortieren strategien zu isolieren und reinigen synovial flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen stammzellen aus einem kaninchen-modell

Magnetic-Activated Cell Sorting Strategies to Isolate and Purify Synovial Fluid-Derived Mesenchymal Stem Cells from a Rabbit Model

Mesenchymaler Stammzellen (MSCs) sind die wichtigsten Zelle Quelle für zellbasierte Therapien. MSCs von Gelenkflüssigkeit Gelenk Hohlraum könnte für das Tissue Engineering von Knorpelgewebe verwendet werden. MSCs von Gelenkflüssigkeit (SF-MSCs) sind viel versprechende Kandidaten für die artikuläre Regeneration betrachtet worden, und ihre möglichen therapeutische Nutzen hat sie ein wichtiges Forschungsthema des späten. SF-MSCs aus dem Knie Hohlraum der New Zealand white Kaninchen können als eine optimierte translationale Modell eingesetzt werden, menschliche regenerativen Medizin zu beurteilen. Mittels CD90-basierte magnetisch aktivierte Zelle Sortieren (MACS) Technologien dieses Protokoll erfolgreich erhält Kaninchen SF-MSCs (RbSF-MSCs) von diesem Kaninchen-Modell und voll zeigt den MSC-Phänotyp dieser Zellen durch veranlassen, zu unterscheiden Adipozyten Osteoblasten und Chondrozyten. Daher kann dieser Ansatz in Zelle Biologie Forschung und Tissue Engineering mit einfachen Mitteln und Verfahren angewendet werden.

Isolierung, Reinigung und Kultur der RbSF-MSCs: Dieses Protokoll verwendet MACS, um RbSF-MSCs, basierend auf dem Ausdruck des MSC Oberfläche Markers CD90 zu isolieren. Ein Ablaufdiagramm RbSF-MSCs Isolierung, Charakterisierung, Reinigung, und die in-vitro- Kultur-Protokoll ist in Abbildung 1dargestellt.
Zellmorphologie nach magnetisch aktivierte Zelle Sortieren (...

Dieser Artikel stellt eine einfache und kostengünstige Protokoll für die einfache Isolierung und Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus New Zealand white Kaninchen Gelenkflüssigkeit.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

Mesenchymal stem cells (MSCs) are the main cell source for cell-based therapy. MSCs from articular cavity synovial fluid could potentially be used for ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen im Sortierprotokoll im Bereich der Stammzellen zu beantworten, indem sie ein Verfahren zur direkten Reinigung von mesenchymalen Stammzellen aus der Synovialflüssigkeit bereitstellt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir ein einfaches und kostengünstiges Protokoll für die Isolierung und Reinigung von MACS aus der Synovialflüssigkeit des Kaninchens entwickelt haben. Generell betreiben wir in der Forschung aufgrund dieser Methode große Anstrengungen, da die Pluration der Zellpopulation von der Produktion einer einzigen Zellsuspension abhängt.Die Idee zu dieser Methode hatten wir erst, als wir feststellten, dass derzeit nur das magnetisch-aktivierte Zellsortierverfahren von der FDA für klinische Anwendungen zugelassen ist. Beginnen Sie diesen Vorgang mit einer Tieranästhesie, wie im Textprotokoll beschrieben. Um eine Sammlung von Gelenksynovialflüssigkeit aus dem Knie des Kaninchens durchzuführen, wählen Sie einen Bereich von etwa fünf mal fünf Zentimetern Größe um das Knie aus.Rasieren Sie die Kaninchenhaare in diesem Bereich mit einem Sicherheitsrasierer. Alternativ desinfizieren Sie die Eingriffsstelle dreimal mit

magnetic-activated-cell-sorting-strategies-to-isolate-purify-synovial

Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

Rat MSCs wurden aus Oberschenkel-und Unterschenkelknochen isoliert und dann durch magnetische Zellsortierung angereichert. Sortiert Zellen wurden für die Expression der Oberflächenmarker durchflusszytometrisch bestätigt. Diese Zellen wurden auch bei klonaler Dichte kultiviert werden, um einzelne Kolonien bilden, und dann dieser Kolonien wurden durch Klonen Zylinder getrennt.

Isolierung und Anreicherung von Rat mesenchymalen Stammzellen (MSCs) und Separation von Single-Kolonie Derived MSCs

Ein experimentelles Verfahren für die Behandlung von osteochondralen Defekten in das Kaninchen Kniegelenk beschrieben. Die Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in osteochondralen Defekten stellt eine viel versprechende Entwicklung auf dem Gebiet des Tissue Engineering. Die Herstellung von...

Behandlung von osteochondralen Defekten in des Kaninchens Kniegelenk durch Implantation von allogenen mesenchymalen Stammzellen in Fibringerinnseln

Dieses Protokoll beschreibt ein Isolationstechnik für primäre Lungen resident mesenchymalen Stromazellen von Ratten erhalten, durch die Verwendung von enzymatischen Verdauung, Dichtegradiententrennung, Kunststoff Haftung und CD146 + magnetisches Kügelchen Auswahl.

Isolierung von CD146<sup&gt; +</sup&gt; Resident Lung mesenchymalen Stromazellen aus Rattenlungen

Wir stellen die Techniken vor, die zur Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus inguinalen (subkutanen) und perigonadalen (viszeralen) Fettgewebsdepots der Maus erforderlich sind, um ihre Genexpression und kollagenolytische Aktivität zu beurteilen. Diese Methode umfasst die Anreicherung von Sca1-Stammzellen (ASCs) mithohem Fettgehalt durch immunomagnetische Zelltrennung.

Immunomagnetische Trennung von Fett Depot-spezifische Sca1<sup&gt; Hoch</sup&gt; Fettgewebe gewonnene Stammzellen (ASC)

Ein Protokoll zur Etablierung mesenchymaler Stammzellen (MSCs), die aus der Synovialflüssigkeit und dem Knochenmark von Minischweinen isoliert und nicht-invasiv mittels Spritzenaspiration entnommen wurden, wird vorgestellt. Die zelluläre Phänotypisierung wurde mittels Durchflusszytometrie nach Zellisolierung und in vitro Kultivierung von Knochenmark und Synovialflüssigkeiten, die aus MSCs gewonnen wurden, durchgeführt.

Isolation und zelluläre Phänotypisierung von mesenchymalen Stammzellen abgeleitet von Synovialflüssigkeit und Knochenmark von Minipigs

Chondrogenese aus Stammzellen erfordert Feinabstimmung der Kulturbedingungen. Hier präsentieren wir einen magnetischen Ansatz für Zellen Kondensation, ein wesentlicher Schritt Chondrogenese zu initiieren. Darüber hinaus zeigen wir, dass dynamische Reifung in einem Bioreaktor mechanische Stimulation auf die Zellkonstrukte und verbessert knorpelige extrazelluläre Matrixproduktion gilt.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Herstellung einer großen Anzahl von GMP-konformen Exosomen aus mesenchymalen Stammzellen der Synovialflüssigkeit unter Verwendung eines 3D-Bioreaktors.

Großtechnische Herstellung von Exosomen aus der Synovialflüssigkeit mesenchymaler Stammzellen durch 3D-Bioreaktorkultur

Die vorliegende Studie bietet ein modifiziertes Protokoll zur Isolierung von Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem entzündlichem Arthritisgewebe.

Isolierung und Kultivierung von primären Synovialmakrophagen und Fibroblasten aus murinem Arthritisgewebe

Diese Studie hat eine stabile und effiziente Methode zur Isolierung, Kultivierung und funktionellen Bestimmung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen (CD34+ VW-SCs) etabliert. Diese leicht verständliche und zeitsparende Isolationsmethode kann von anderen Forschern genutzt werden, um die möglichen Mechanismen zu untersuchen, die an Herz-Kreislauf-Erkrankungen beteiligt sind.

Immunmagnetische Isolierung von in der Gefäßwand ansässigen CD34+ -Stammzellen aus Mäusen

Mesenchymale Stammzellen aus dem Kieferknochenmark haben wichtige Funktionen bei der vielfältigen Differenzierung, Selbsterneuerung und Immunmodulation. Sie haben sich als wichtiges Reservoir für Vorläuferzellen in der Gentherapie, im Tissue Engineering und in der regenerativen Medizin erwiesen. Hier stellen wir eine einzigartige Methode zur Isolierung von mesenchymalen Stammzellen des Kieferknochenmarks bei Ratten vor.

Technik zur Isolierung und Kultivierung von mesenchymalen Stammzellen aus dem Kieferknochenmark von Ratten

Dieses Protokoll beschreibt eine magnetische perlenbasierte Sortiermethode, bei der phycoerythrin-(PE)-markierte Flusszytometrie-Antikörper und Anti-PE-Mikroperlen verwendet werden, um spezifische mesenchymale Stammzellsubpopulationen mit hoher Postsort-Zielmarker-Positivität und erhaltener CCK-8-basierter Proliferation/Stoffwechselaktivität unter den getesteten Bedingungen zu isolieren, ohne teure Zellsortierer oder zielspezifische individuelle Perlen zu benötigen.

Isolierung und Validierung von Podoplanin-positiven mesenchymalen Stammzellsubpopulationen mit einer indirekten magnetischen Perlenstrategie

Lernen Sie die magnetische Zellsortierung zur Isolierung mesenchymaler Stammzellen aus Synovialflüssigkeit von Kaninchen. Diese einfache Methode ermöglicht effiziente Aufreinigung für regenerative Medizin.

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell (Video) | JoVE Journal

Magnetische aktiviert Zelle Sortieren Strategien zu isolieren und reinigen Synovial Flüssigkeit abgeleitet mesenchymalen Stammzellen aus einem Kaninchen-Modell

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