Name: Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen: eine Zell-basierte Strategie-Kombination beschleunigt Perfusion mit direkten Parakrine Lieferung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-16T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Co-Transplantation kryokonservierten menschlichen Eierstockgewebes mit modifizierten Endothelzellen zur Beschleunigung der Reperfusion und parakrinen Stimulation. Diese Methode verbessert die Lebensfähigkeit und etabliert ein Modell zur Untersuchung der molekularen Regulation der Follikulogenese.

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Omar Alexander Mann für die Illustrationen. L.M wurde unterstützt durch einen Pilot-Award von der Cornell-klinische und Translationale Science Center und ein ASRM Forschungsstipendium. Die Autoren möchten James Labor für kritische Lektüre des Manuskripts danken.

Alle Verfahren, die tierische Themen wurden von den institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) am Weill Cornell Medical College genehmigt. Alle Xenotransplantation Experimente mit eierstockgewebe wurden im Einklang mit geltenden Richtlinien und Vorschriften durchgeführt. Menschlichen eierstockgewebe wurde von Patienten für Chemo- oder Strahlentherapie zur Behandlung von Krebs oder vorherige Knochenmark-Transplantation geplant gesammelt. Das institutionelle Review Board (IRB) Ausschuss der Weill Cornell Medical College genehmigt die Sammlung des Gewebes für autologe Einsatzmöglichkeiten und nach Einwilligung des Patienten, eine Spende in Höhe von bis zu 10 % ihrer Ovargewebe für Forschungszwecke durchgeführt wurde.
1. Sammlung von menschlichen Eierstockgewebe
Hinweis: Bei einer ovariellen Gewebe von einem remote-Standort-Transit transportiert wird, sollte mal 5 h18,19nicht überschreiten.
<ol><li>Das eierstockgewebe zu sammeln und mit einer sterilen Kochsalzlösung spülen.</li>
	<li>Platzieren Sie den Eierstock in einen sterilen Behälter.</li>
	<li>Gießen Sie Leibovitzs L-15 Medium bis Eierstock komplett in das Medium eingetaucht ist.</li>
	<li>Schließen Sie und verschließen Sie den Behälter.</li>
	<li>Transport des Containers auf dem Eis.</li>
</ol>2. Verarbeitung der beschafften Eierstockgewebe, adaptiert von Schmidt Et al. 18
<ol><li>
Vorbereitungen für die Eierstöcke Verarbeitung und Einfrieren
	<ol>
<li>100 mL des Mediums für die Verarbeitung vorbereitet: Leibovitzs L-15 mittlere 99 mL + 1 mL Antibiotikum antimykotische Lösung. Filtermedien Sie mit 0,2 µm-Filter. Halten Sie das Medium gekühlt.</li>
		<li>Bereiten Sie 100 mL eiskalte Lösung mit DMSO als Cryo-Schutzmittel. Fügen Sie 69,64 mL Leibovitz L-15 Mittel, 17,66 mL fötalen Rinderserum (FBS), 3,42 g Saccharose (erstelle ich eine Endkonzentration von 0,1 Mol/L), 10,65 mL DMSO (erstelle ich eine Endkonzentration von 1,5 Mol/L) und 1 mL Antibiotikum antimykotische Lösung. Filtern Sie das Medium mit einer 150 mL-Filter-Einheit, 0,2 µm. Store das Medium bei 4 ° C.</li>
		<li>Sterilisieren Sie die chirurgische Instrumente mit Autoklav für einen umschlossenen Feststoffe Sterilisationszyklus programmiert.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bei der Ankunft des Gewebes
	<ol>
<li>Inmitten der sterilen chirurgischen Werkzeugen der Biosicherheit Kabinett: Skalpell mit Klinge Nr. 21, gut scharf gebogene Schere und Zange auf unterschiedliche Größen: lange (ca. 150 mm Länge) und 2 mittlerer Größe (ca. 110 mm Länge).</li>
		<li>Tragen Sie sterile Handschuhe, öffnen Sie den Container innerhalb der Biosicherheit Kabinett. Nehmen Sie den Eierstock und legen Sie sie in einem 150 mm Petrischale und Gießen Sie kaltes Medium bereit im Schritt 2.1.1 auf dem Eierstock, Austrocknung der ovariellen Gewebe zu verhindern.</li>
		<li>Isolieren Sie des Eierstocks aus jeder verbleibende Gewebe und spülen Sie ihn mit kaltem Medium, bis es frei von Blut und Gewebe ist.</li>
		<li>Legen der Eierstöcke in einem sauberen 150 mm Petrischale, kalt Mittel, vorbereitet in Schritt 2.1.1 bis der Fruchtknoten halb unter Wasser drin ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Dissektion der ovariellen Gewebe
	<ol>
<li>Halbieren Sie der Eierstöcke und entfernen Sie die Medulla zuerst durch scharfe Dissektion mit gekrümmten feinen Schere. Dann kratzen Sie die Medulla entfernt, mit einem sterilen Skalpell mit einer Klinge Nr. 21. Vorausgehen Sie, bis die kortikale Gewebe 1-1,5 mm dick ist.</li>
		<li>Splitter von 2-3 mm in der Breite der kortikale Gewebe geschnitten, wird die Länge des Streifens die gesamte Länge der Eierstöcke Stück sein, die verarbeitet wurde.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. ovariellen Gewebe langsam Einfrieren, Adapted von Newton Et Al. und Oktay Et al. 6 , 20
<ol><li>
Vorbereitung für das Einfrieren
	<ol>
<li>Label Cryovials (1,8 mL).</li>
		<li>Zugeben Sie 1,5 mL die eiskalte Lösung vorbereitet in Schritt 2.1.2 jedes Fläschchen.</li>
		<li>Transfer einer kortikalen Streifen pro kryogenen Fläschchen mit dem Einfrieren Lösung.</li>
		<li>Equilibrate den kortikalen Strip für 20 min auf einer rotierenden Platte, sanfte Erregung bei 4 ° c anwenden</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Langsames Einfrieren von eierstockgewebe
	<ol>
<li>Laden Sie die Cryovials in einem programmierbaren Hobel Gefrierschrank beginnend bei 0 ° C.</li>
		<li>Bei 2 ° C/min bis-7 ° c abkühlen</li>
		<li>Halten Sie das Gewebe auf diese konstanten Temperatur 10 min. lang.</li>
		<li>Führen Sie die manuelle seeding für Eis Kristall Keimbildung Induktion, indem er jedes Cryoröhrchen mit einem Wattetupfer eingetaucht in flüssigem Stickstoff (LN2).</li>
		<li>Weiterhin bei 0,3 ° C/min abkühlen lassen, bis Probentemperatur-40 ° C.</li>
		<li>Kühlen Sie mit einer schnelleren Rate von 10 ° C/min bis-140 ° C.</li>
		<li>Cryovials auf die Dewar für die Lagerung in LN2 übertragen (-196 ° C).</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitungen für die Operationen (bilateraler Oophorectomy und Co Transplantation)
<ol><li>
Vorbereitung der Platten
	<ol>
<li>Einen Tag vor dem Auftauen der ovariellen Gewebes für Transplantationen<ol>
<li>Legen Sie ein Stück aus einem Kunststoff Paraffin-Film am unteren Rand ein 50 mm Petrischale, besprühen Sie sie mit 70 % Ethanol bis es vollständig verdeckt wird.</li>
			<li>Lassen Sie die Petrischalen über Nacht in der Biosicherheit Kabinett. 2 Petrischalen per Mausklick vorzubereiten.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Am Tag der Operationen<ol>
<li>Aspirieren Sie Ethanol aus der Petrischale mit Kunststoff Paraffin Film innerhalb der Biosicherheit Kabinett.</li>
			<li>Lassen Sie die Petrischale Führung halb offen, bis Ethanol vollständig verdampft.</li>
			<li>Schließen Sie den Deckel der Petrischale, wenn der Kunststoff Paraffin Film vollständig trocken ist. Halten Sie es innerhalb der Biosicherheit Kabinett.</li>
			<li>Label-Brunnen von einem 6 Teller gut entsprechend 0,1 Mol/L Saccharose + 1 Mol/L DMSO, 0,1 Mol/L Saccharose + 0,5 Mol/L DMSO, 0,1 Mol/L Saccharose, grundlegende Auftauen Lösung (BTS), Medium.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Vorbereitung der Lösungen
	<ol>
<li>100 mL BTS vorbereiten: Leibovitzs L-15 mittlere 79 mL + FBS 20 mL + Antibiotikum antimykotische Lösung 1 mL. Filtern Sie mit einem 0,22 µm-Filter-System.</li>
		<li>10 mL BTS mit 0,1 Mol/L Saccharose vorzubereiten. Skalieren Sie 0,342 g Saccharose zu und 10 mL BTS vorbereitet im Schritt 4.2.1, Rühren sanft, bis der Zucker vollständig aufgelöst ist. Die Lösung mit einer Spritze 0,22 µm filter.</li>
		<li>Bereiten Sie die Lösungen gemäß Tabelle 1. Decken Sie Röhrchen mit DMSO mit Alufolie ab. Bis zur Verwendung aufbewahren.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(5) Eierstockgewebe schnelle Auftauen
<ol><li>Entnehmt der LN2 Dewar ein Fläschchen mit Einfrieren von eierstockgewebe und halten Sie sie bei Raumtemperatur für 30 s.</li>
	<li>Wischen Sie das Fläschchen mit einem Papiertuch sauber.</li>
	<li>Tauchen Sie das Fläschchen in einem 30 ° C Wasserbad für ca. 1-2 min. bis seine "Inhalt aufgetaut.</li>
	<li>Öffnen Sie das Fläschchen und des kortikalen Streifens in die erste Vertiefung, die 3 ml die erste Lösung (0,1 Mol/L Saccharose + 1 Mol/L DMSO, zubereitet im Schritt 4.2.3) enthält. Hinweis: Alle Schritte mit Öffnen des Deckels der Platte werden unter Laminar-Flow erfolgen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die 6-well-Platte auf einer rotierenden Platte bei 4 ° C für 5 min. halten die Platte abgedeckt mit Alufolie für diesen Schritt.</li>
	<li>Übertragen des kortikalen Streifens in der zweite gut mit 3 mL des zweiten Lösung (0,1 Mol/L Saccharose + 0,5 Mol/L DMSO, zubereitet im Schritt 4.2.3).</li>
	<li>Inkubieren Sie die 6-well-Platte auf einer rotierenden Platte für sanfte Agitation bei 4 ° C für 5 min. halten die Platte abgedeckt mit Alufolie für diesen Schritt.</li>
	<li>Übertragen Sie die kortikalen Streifen in den dritten Brunnen, mit 4 mL der Lösung (BTS mit 0,1 Mol/L Saccharose, zubereitet im Schritt 4.2.2).</li>
	<li>Auf einer rotierenden Platte für sanfte Agitation bei 4 ° C für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen des kortikalen Streifens in der vierten gut mit 4 mL der Lösung (BTS, zubereitet im Schritt 4.2.1).</li>
	<li>Auf einer rotierenden Platte für sanfte Agitation bei 4 ° C für 5 min inkubieren.</li>
	<li>Übertragen Sie den kortikalen Streifen in den letzten gut mit 4 mL kaltes Medium (vorbereitet in Schritt 2.1.1). Halten Sie aufgetaute Ovargewebe auf Eis, bis die Transplantation durchführen.</li>
</ol>6. Kapselung der ovariellen Gewebe
<ol><li>
Bereiten Sie die folgenden Lösungen
	<ol>
<li>Bereiten Sie 25 mL 20 Mmol/L HEPES-Puffer in 0,9 % Kochsalzlösung. Filtern und Lagerung bei 4 ° C.</li>
		<li>Bereiten Sie 1 mL CaCl2 bei der Konzentration von 1 Mol/L. Filter und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie eine Fibrinogen 50 mg/mL Stammlösung
	<ol>
<li>Fügen Sie 1 g Fibrinogen in 20 mL 20 Mmol/L HEPES-Puffer in 0,9 % Kochsalzlösung durch das Mischen von Fibrinogen langsam in die HEPES gepufferten Kochsalzlösung über mehrere Stunden bei 37 ° C.</li>
		<li>Beschriften Sie 1,7 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Filtern Sie die Lösung durch einen 0,45 µm-Spritze-Filter und dann durch einen 0,2 µm Spritze Filter.</li>
		<li>Aliquoten die Lösung in 200 µL in Mikro-Zentrifugenröhrchen und Store bei-20 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Bereiten Sie eine Stammlösung Thrombin 100 U/mL Hinweis: Thrombin Lösungen adsorbieren, Glas, aliquoten die Lösung in Kunststoff Rohre/Fläschchen.<ol>
<li>2,5 mL sterile Kochsalzlösung 0,9 % bis 250 U Thrombin hinzugeben.</li>
		<li>Sanftes Schütteln bis die Lösung vollständig auflösen.</li>
		<li>Beschriften Sie 1,7 mL Mikro-Zentrifuge Röhren.</li>
		<li>Filtern Sie durch einen 0,2 µm Spritze Filter, aliquoten 50 µL in Mikro-Zentrifuge Tuben und Speicher bei-80 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Machen Sie ein Fibrin-Gerinnsel von 70 µL, erhalten eine Endkonzentration von 10 mg/mL Fibrinogen und 5 U/mL Thrombin Hinweis: Stellen Sie sicher, schnell, die Lösung Klumpen in wenigen Sekunden zu arbeiten. Vermeiden Sie auch die Zugabe von Luftblasen auf die Mischung.<ol>
<li>Bereiten Sie eine Fibrinogen-Lösung in einem Mikro-Zentrifugenröhrchen 1,7 mL.<ol>
<li>Fügen Sie 360 µL 20 Mmol/L HEPES Buffer in 0,9 % Kochsalzlösung, die regelmäñig 200 µL der Fibrinogen-Aktie im Schritt 6.2.4 vorbereitet.</li>
			<li>Durch sanfte pipettieren mischen.</li>
			<li>Halten Sie es auf dem Eis.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie eine Thrombin-Lösung in eine zweite Mikro-Zentrifugenröhrchen.<ol>
<li>Die regelmäñig 50 µL der Thrombin-Aktie 148.7 µL DMEM hinzufügen im Schritt 6.3.4 vorbereitet.</li>
			<li>Durch sanfte pipettieren mischen.</li>
			<li>1.3 µL 1 Mol/L CaCl2hinzufügen.</li>
			<li>Durch sanfte pipettieren mischen.</li>
			<li>Halten Sie es auf dem Eis.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Bereiten Sie eine einzelne Zelle Aufhängung, In einem dritten Mikro-Zentrifugenröhrchen.<ol>
<li>Veränderten Endothelzellen aus der Platte mit einem Enzym Zelle Ablösung Medium zu lösen.</li>
			<li>Spin-down der und zählen Sie die Zellen mit einem Hemocytometer mit einem Deckglas.</li>
			<li>Verwenden Sie 20.000 Zellen pro alle 1 mm2 von eierstockgewebe. Berechnen Sie 20.000 X Fläche von Ovargewebe in mm2.</li>
			<li>Spin-down veränderten Endothelzellen und hängen Sie es erneut im Basismedium (DMEM), ein Gesamtvolumen von 16,8 µL zu erreichen.</li>
			<li>Halten Sie es auf dem Eis.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Legen Sie ein Stück von eierstockgewebe auf eine sterile Gaze Schwamm es für ein paar Sekunden trocknen lassen.</li>
		<li>Legen Sie das Stück von eierstockgewebe auf Kunststoff Paraffin Film innerhalb der 50 mm Petrischale.</li>
		<li>Fügen Sie 39,2 µL der Fibrinogen-Lösung, zubereitet im Schritt 6.4.1.2, in die Zellsuspension in Schritt 6.4.3.4, Mix von sanften pipettieren vorbereitet. Halten Sie es auf dem Eis.</li>
		<li>Fügen Sie 14 µL der Thrombin-Lösung im Schritt 6.4.2.4 vorbereitet. Mischen Sie durch pipettieren einmal vorsichtig. Arbeiten Sie schnelles.</li>
		<li>Legen Sie die Mischung auf das eierstockgewebe pipettieren in Form eines länglichen Tropfens.</li>
		<li>Legen Sie die Petrischale mit den Klumpen im Inkubator bei 37 ° C.</li>
	</ol>
</li>
</ol>7. bilaterale zurückliegend und Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen, NSG Mäuse
Hinweis: Zehn bis vierzehn Wochen alten weiblichen NSG Mäuse21 dienten (Jackson Labs).
<ol><li>Bereiten Sie alle chirurgischen Instrumente, wie in Schritt 2.1.3, stellen Sie sicher, dass Sie alle Nähte, Pads und chirurgische Bänder praktisch.</li>
	<li>
Die Maus mit einem Anästhesiesystem mit Isofluran zu betäuben.
	<ol>
<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in der Kammer Induktion, schließen Sie Deckel und öffnen Sie den entsprechenden Absperrhahn.</li>
		<li>Offenen Durchflussmesser auf 1.000 mL/min schalten Sie den Verdampfer und setzen Sie ihn auf 2-3,5 % liefern.</li>
		<li>Beobachten Sie die Auswirkungen der Narkose; Verlust des Bewusstseins, langsame und regelmäßige Atemzüge.</li>
		<li>Übertragen Sie auf die bugnase, Narkose aufrechtzuerhalten. Drehen Sie den Verdampfer um 1-3 %, je nach Vitalfunktionen zu liefern.</li>
		<li>Abwesenheit von Pedal oder Schweif Reflex zu überprüfen. Wenn der Reflex vorhanden ist, erhöhen Sie Isofluran, bis es nicht vorhanden ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schneiden Sie die Maus wieder Haare, vom Heck bis zu den Schlüsselbeinen Linie, mit einem elektrischen Haarschneider.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in Bauchlage auf die chirurgische Plattform.</li>
	<li>Fixieren Sie die bugnase zur chirurgischen Plattform mit einem chirurgischen Klebeband.</li>
	<li>Die Maus Glieder sanft auf die chirurgische Plattform mit 1,25 cm breiten chirurgischen Papierband mit Klebeband.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Gleitmittel Gelee und setzen Sie einen Thermometer PR Fix das Thermometer durch die chirurgische Plattform mit einem 1,25 cm breit perforiert plastische chirurgische Band abkleben.</li>
	<li>Das Heck auf die chirurgische Plattform mit 2,5 cm Breite chirurgische Papierband mit Klebeband.</li>
	<li>Wärme, mit einem Infrarot- oder ein Heizkissen, Warmwasser und überwachen die Maus Körpertemperatur während des Verfahrens. Halten Sie die Körpertemperatur im Bereich von 35-37 ° C.</li>
	<li>Reinigen Sie Löschbereichs mit einem sterilen Tupfer-Stock Povidon-Jod-Lösung und wischen Sie mit sterilem Alkohol Prep.</li>
	<li>Wiederholen Sie Schritt zwei weitere 6,9.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen der sterilen okuläre Schmierstoff Tierarzt Salbe über die Maus Augen vor Austrocknung zu schützen und Schäden an der Hornhaut.</li>
	<li>Decken Sie die Maus mit einem sterilen op-Tuch ab.</li>
	<li>Buprenorphin (1 mg/Kg) subkutane (S/C) zu injizieren.</li>
	<li>Führen Sie eine längs-mediale dorsale Inzision mit einem Skalpell (Klinge #21).</li>
	<li>
Durchführen Sie einer bilateralen zurückliegend, verwenden Sie einen dorsalen Ansatz.
	<ol>
<li>Befreien Sie das subkutane Bindegewebe durch stumpfe Dissektion mit der Schere.</li>
		<li>Kneifen Sie die Faszie seitlich an der Mittellinie machen einen Schnitt und erreichen Sie die Bauchhöhle mit der scharfen Schere zu.</li>
		<li>Schnappen Sie sich die Eierstöcke fettlappen und Eierstock vorsichtig mit einer Pinzette und aus der Bauchhöhle herausziehen.</li>
		<li>Fassen Sie den Eierstock und Fettpolster mit einer vaskulären Klammer.</li>
		<li>Verbinden Sie den Eierstock und mittels einer 4/0 Monofile resorbierbaren Naht an der Basis des Eierstocks, der Eileiter distal Fettpolster.</li>
		<li>Clip des Eierstocks distal der Krawatte. Stellen Sie sicher, es gibt keine Blutungen aus der Basis des Stumpfes.</li>
		<li>Legen Sie das Gewebe wieder in die Bauchhöhle und Naht der Faszie mit geflochtenen resorbierbaren Naht 6/0.</li>
		<li>Wiederholen Sie die Etappen 7.15.1-7.15.7 auf der kontralateralen Seite.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Das eierstockgewebe Co zu verpflanzen.
	<ol>
<li>Führen Sie einen horizontalen Schnitt in der Faszie über den Gluteus Maximus, in der Länge, die Klumpen Abmessungen passt. Erstellen Sie eine Tasche in diesem virtuellen Raum durch das Öffnen der Schere unterhalb der Faszie.</li>
		<li>Einteiler der gekapselten kortikalen Gewebe, holen Sie ab, wie in Schritt 6.4.8 vorbereitet und legen Sie sie in diesem Fach.</li>
		<li>Naht der Faszie mit 6/0 geflochten resorbierbaren Naht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie die Etappen 7.16.1-7.16.3 auf der kontralateralen Seite sowie.</li>
	<li>Schließen der dorsalen Wand durch einfache unterbrochene Nähte mit einer 4/0 Monofile resorbierbaren Naht.</li>
	<li>Injektion von Lidocain 0,5 % (1,2 mL/Kg) S/C an der Schnitt-Stelle.</li>
	<li>Verwenden Sie eine sterile Alkohol-Prep, um die Haut zu reinigen.</li>
	<li>Schalten Sie die Isofluran während der Maus Temperaturüberwachung.</li>
	<li>Geben Sie 1 – 2 min. O2, ohne Isofluran. Erwärmung zu halten auf der Maus, bis es anfängt zu bewegen und ins Bewusstsein zurück.</li>
	<li>Platzieren Sie den Mauszeiger in eine saubere Wiederherstellung Käfig und später Haus der Maus in einem separaten Käfig, bis die vollständige Heilung der Operationswunde.</li>
	<li>Buprenorphin (1 mg/Kg) S/C bei Bedarf alle 8-12 h 24 Stunden postoperativ zu injizieren.</li>
	<li>Halten Sie die Mäuse in getrennten Käfigen, wenn alle Nahrung, Wasser, Bettwäsche, Käfige autoklaviert, bis zum Ende des Experiments sind. Halten Sie die Käfige in einem unter Druck stehenden belüfteten Raum. Persönliche Schutzausrüstung verwenden wenn die Mäuse zu behandeln.</li>
</ol>

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Michael Ginsberg ist Angestellter des Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, 92130, Vereinigte Staaten, das isoliert, mit E4-ORF-1 transfiziert und beschriftet die Endothelzellen, die wir verwendet.

Hier zeigen wir, dass Co Transplantation von ExECs bietet einen erheblichen Vorteil eierstockgewebe Rentabilität und Funktion nach Xenograft bei Mäusen. Normen für die klinische Anwendung von eierstockgewebe Auto-Transplantation für die Erhaltung der Fruchtbarkeit wurden nicht gesetzt und die optimalen Parameter (Größe, Transplantation Ort, Dauer des Transplantats, usw.) 32 , 33 , 34 für die Erweiterte Wiederherstellung...

Krebs nach wie vor zu den häufigsten Todesursachen in den Industrieländern noch jahrzehntelanger Forschung haben erhebliche Fortschritte bei den meisten Arten von Krebs, und in einigen Fällen fast verdoppelten überleben Preise1geführt. Chemotherapeutika sind leider oft lokalisierten, zum Abbau der Reserve der primordialfollikel in den Eierstöcken und Verringerung der Fruchtbarkeit2. Dieses Bevölkerungswachstum profitieren von verschiedenen Methoden der Fruchtbarkeit Erhaltung einschließlich Kryokonservierung von Eizellen oder Embryonen, Patienten, die eine sofortige Einleitung der Krebstherapie und präpubertären Patienten sind jedoch nicht für eine dieser Optionen. Als Alternative haben einige Patienten eierstockgewebe Tiefgefrieren vor dem Unternehmen ihre therapeutische Therapie und Erholung und Remission, Auto-Transplantation von Gewebe zur Wiederherstellung der Fruchtbarkeit3. Doch bislang bleiben Transplantat-überleben und follikulären Ausgabe nach Auto-Transplantation relativ niedrigen4, vor allem auf Gewebe Ischämie und Hypoxie5,6,7. Trotz zahlreicher Versuche, die Rentabilität der Eierstöcke kortikalen Grafts zu verbessern verwenden Anti-Oxidantien8,9, Pro-angiogenen Zytokine10,11,12,1 3oder mechanische Manipulationen14, Transplantat Ischämie in einem Fenster 5 bis 7 Tage nach der Transplantation untergräbt die Lebensfähigkeit und das Überleben des Transplantats7. Um dieses Problem anzugehen, haben wir eine Zell-basierte Strategie zur Anastomose Host und Transplantat Schiffe erleichtern und somit beschleunigen Reperfusion des ovariellen Gewebe entwickelt.
Neben der ischämische Beleidigung für veredelte eierstockgewebe im Fenster nach der Transplantation kann die Unterbrechung der Inter follikulären Signalisierung zu einer Erschöpfung der Pool15,16beitragen. Da exogene Endothelzellen (Führungskräfte), stabile und funktionierende Gefäße in der Peripherie des Transplantats beitragen, präsentieren sie eine einmalige Gelegenheit, einen definierten Molekulare Eingang transplantierten Gewebes zu vermitteln. Als Beweis des Prinzips waren ExECs, express Super-physiologischen Ebenen des Anti-Müller-Hormon (AMH), ein Mitglied der transformierende Wachstumsfaktor-Beta (TGFβ)-Superfamilie entwickelt, die gezeigt worden, um follicular Wachstum17zu beschränken. Vergleich der follikulären Verteilung in Transplantate gemeinsam mit Steuerung und AMH exprimierenden Zellen transplantiert überprüft die biologische Aktivität und die Potenz der veränderter ExECs.
Zusammenfassend lässt sich sagen kann dieser Ansatz durch die Verbesserung der Transplantat Lebensfähigkeit und unterdrücken vorzeitiger Mobilisierung des follikulären Pools, die Produktivität von Auto verpflanzt eierstockgewebe bei Patienten mit Erhaltung der Fruchtbarkeit erhöhen. Darüber hinaus ermöglicht die ExEC-basierte Plattform experimentelle Befragung der molekularen Regulatoren, die in follikulären Entwicklung verwickelt waren.

<table><tbody><tr><td>Leibovitz' s L-15 medium</td><td>Gibco</td><td>11415064</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotikum-Antimykotikum</td><td>Gibco</td><td>15240062</td><td>Anti-Anti X100</td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Sigma</td><td>S 1888</td><td></td></tr><tr><td>Fibrinogen</td><td>Sigma</td><td>F 8630</td><td>aus Rinderplasma</td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma</td><td>T 1063</td><td>aus humanem Plasma</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>D 2650</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>12491015</td><td></td></tr><tr><td>Enzym Zellablösung Medium</td><td>Invitrogen</td><td>00-4555-56</td><td>Accutase</td></tr><tr><td>Kunststoff Paraffinfolie</td><td>Bemis NA</td><td></td><td>Parafilm M</td></tr><tr><td>Chirurgisches Papierband 2,5 cm</td><td>3M</td><td>1530-1</td><td>Micropore</td></tr><tr><td>Chirurgisches Papierband 1,25 cm</td><td>3M</td><td>1530-0</td><td>Mikroporen</td></tr><tr><td>Perforierter Kunststoff Chirurgisches Klebeband 1,25 cm</td><td>3M</td><td>1527-0</td><td>Transpore</td></tr><tr><td>Monofilament Resorbierbares Nahtmaterial</td><td>Covidien</td><td>UM-203</td><td>Biosyn</td></tr><tr><td>Geflochtenes Resorbierbares Nahtmaterial</td><td>Covidien</td><td>GL-889</td><td>Polysorb</td></tr><tr><td>Povidon-Jod-Lösung USP 10%</td><td>Purdue Products</td><td>67618-153-01</td><td>Betadine Lösung Tupfer</td></tr><tr><td>Stick Cryoviales</td><td></td><td>Nunc 377267</td><td>CryoTube</td></tr><tr><td>steriles Okular Schmiermittel</td><td>Dechra</td><td>17033-211-38</td><td>Puralube</td></tr><tr><td>1,7 ml Mikrozentrifugenröhrchen</td><td>Denville</td><td>C-2172</td><td>Eppendorf</td></tr><tr><td>Anasthesia-System</td><td>VetEquip</td><td>V-1 Tischsystem mit Abfangbecken</td><td></td></tr><tr><td>Endothelzellen</td><td>Angiocrine Biosciences, Inc., San Diego, CA, USA</td><td></td><td>Isoliert, transfiziert mit E4-ORF-1 und markierten Endothelzellen</td></tr><tr><td>Trichrom-Färbung</td><td>Sigma</td><td>HT15-1kt</td><td>Trichrom Stain (Masson) Kit</td></tr><tr><td>Isolectin</td><td>Invitrogen</td><td>I32450</td><td>Isolectin GS-IB4 Von Griffonia simplicifolia, Alexa Fluor&trade; 647 Konjugat</td></tr></tbody></table>

co transplantation von menschlichen eierstockgewebe mit veränderter endothelzellen: eine zell-basierte strategie-kombination beschleunigt perfusion mit direkten parakrine lieferung

Co-transplantation of Human Ovarian Tissue with Engineered Endothelial Cells: A Cell-based Strategy Combining Accelerated Perfusion with Direct Paracrine Delivery

Unfruchtbarkeit ist eine häufige Nebenwirkung der Chemotherapie und/oder Strahlentherapie und bei einigen Patienten, Kryokonservierung von Eizellen oder Embryonen ist keine Option. Als Alternative, eine wachsende Zahl von diesen Patienten entscheiden sich für Autotransplantation eierstockgewebe Tiefgefrieren nach Erholung und Remission. Trotz Verbesserungen in Ergebnisse bei Patienten, die Auto-Transplantation von kryokonservierten ovariellen Gewebe bleibt effiziente Revaskularisation des transplantierten Gewebes ein großes Hindernis. Ischämie zu mildern und somit bessere Ergebnisse bei Patienten mit Auto-Transplantation, entwickelten wir eine vaskuläre Zell-basierte Strategie zur Beschleunigung der Perfusion von eierstockgewebe. Wir beschreiben eine Methode zur Co Transplantation von exogenen Endothelzellen (Führungskräfte) mit kryokonservierten ovariellen Gewebe in einem Mausmodell Xenograft. Wir erweitern diesen Ansatz um ExECs, die entwickelt haben, um Anti-Müller-Hormon (AMH), konstitutiv zum Ausdruck zu bringen, damit nachhaltige Parakrine Signalisierung Eingabe für Eierstockkrebs Transplantate zu beschäftigen. Co Transplantation mit ExECs erhöhte follikuläre Volumen und verbesserte antrale Follikel Entwicklung und AMH exprimierenden ExECs Eigentumsvorbehalt ruhende primordialfollikel gefördert. Diese kombinierte Strategie kann ein nützliches Werkzeug für mildernde Ischämie und modulierende follikulären Aktivierung im Zusammenhang mit der Erhaltung der Fruchtbarkeit bzw. Unfruchtbarkeit bei großen sein.

Um festzustellen, ob Co Transplantation von ExECs einen Vorteil für Patienten Gewebe bietet, waren aufgetaute Eierstock kortikale Streifen in gleich große Stücke geteilt und pfropfte bilateral in Immuno-gefährdet, NOD scid Gamma (NSG), Mäuse. Mit einer Seite eingebettet in ein Fibrin Gerinnsel allein (kein ECs) und die andere mit ExECs (Abbildung 1a) jede Maus diente als seine eigene Kontrolle. ExECs erhielten über Isolierung der primären Endothel von menschl...

Bei einigen Patienten ist die einzige Option für die Erhaltung der Fruchtbarkeit Kryokonservierung von Ovargewebe. Leider untergräbt verzögerte Revaskularisation follikulären Lebensfähigkeit. Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur menschlichen eierstockgewebe mit Endothelzellen für Nutzung als Kombination von Zell-basierte Strategie beschleunigt Perfusion mit einer direkten Parakrine Lieferung von bioaktiven Moleküle Co zu verpflanzen.

Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen: eine Zell-basierte Strategie-Kombination beschleunigt Perfusion mit direkten Parakrine Lieferung

Infertility is a frequent side effect of chemotherapy and/or radiotherapy and for some patients, cryopreservation of oocytes or embryos is not an option. ...

Das übergeordnete Ziel dieses Protokolls ist die Xenotransplantation von kryokonserviertem menschlichem Ovarialgewebe in Kombination mit gentechnisch veränderten Endothelzellen, die die Reperfusion beschleunigen und einen parakrinen Stimulus liefern, der die follikuläre Aktivierung innerhalb des Transplantats moduliert. Diese Methode bietet ein zellbasiertes Mittel zur Verbesserung der Lebensfähigkeit von kryokonserviertem Eierstockgewebe nach der Transplantation und etabliert im weiteren Sinne ein robustes Modellsystem für die Untersuchung der molekularen Regulation der menschlichen Follikulogenese. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie ein einziges Vehikel, nämlich die Endothelzellen, verwendet, um sowohl die Ischämie zu mildern als auch eine nachhaltige Quelle für sezernierte Faktoren zur Transplantation des Gewebes bereitzustellen.Diese Methode bietet also einen globalen Nutzen für die Lebensfähigkeit des Gewebes. Es kann auch Einblicke in molekulare Regulatoren geben, die an der Follikelentwicklung beteiligt sind. Um ein Fibringerinnsel herzustellen, arbeiten Sie schnell und fügen Sie 360 Mikroliter HEPES-Puffer zu 200 Mikrolitern der Fibrinogen-Stammlösung hinzu.Vorsichtig pipettieren, um zu mischen, und das Röhrchen auf Eis halten. Bereiten Sie im zweiten Mikrofugenröhrchen die Thrombin-Arbeitslösung vor, indem Sie 148,7 Mikroliter DMEM zu 50 Mikrolitern Thrombin-Stammlösung hinzufügen. Vorsichtig pipettieren, um zu mischen.Fügen Sie dann 1,3 Mikroliter eines Mols pro Liter Calciumchlorid hinzu. Vorsichtig pipettieren, um die Probe zu mischen, und die Probe auf Eis halten. Mit dem Enzymzellablösemedium Accutase werden zuvor präparierte manipulierte Endothelzellen von der Platte abgelöst und in ein drittes Mikrofuge-Röhrchen überführt.Drehen Sie dann die Zellen nach unten. Zählen Sie anschließend mit einem Hämozytometer und einem abgedeckten Glas die Zellen. Um die Anzahl der Zellen zu berechnen, die für die Transplantation benötigt werden, wandeln Sie eine 20.000-fache Fläche des Eierstockgewebes in ein Quadratmillimeter um, indem Sie die Abmessungen mit einem Lineal messen.Multiplizieren Sie die Fläche mit 20.000, um die Anzahl der Zellen zu bestimmen, die für die Transplantation benötigt werden. Drehen Sie die gewünschten Zellen herunter. Und verwenden Sie DMEM, um das Pellet für ein Gesamtvolumen von 16,8 Mikrolitern wieder zu suspendieren.Bewahren Sie die Zellsuspension auf Eis auf. Legen Sie anschließend ein Stück Eierstockgewebe für einige Sekunden auf einen sterilen Mullschwamm, um es zu trocknen. Anschließend übertragen Sie das Gewebe auf eine zuvor vorbereitete Kunststoffparaffinfolie in einer 50-Millimeter-Petrischale.Geben Sie 39,2 Mikroliter der Fibrinogenlösung in die vorbereitete Zellsuspension. Mischen Sie durch vorsichtiges Pipettieren und halten Sie die Suspension auf Eis. Geben Sie dann schnell 14 Mikroliter der Thrombinlösung in das Röhrchen und pipettieren Sie es einmal vorsichtig, um es zu mischen.Pipettieren Sie die Mischung in Form eines länglichen Tröpfchens auf das Eierstockgewebe. Inkubieren Sie die Petrischale mit dem Gerinnsel bei 37 Grad Celsius. Arbeiten Sie schnell, sobald Sie die Thrombinlösung zur Fibrinogenzellsuspension hinzugefügt haben.Die Synchronisierung der zukünftigen Vorbereitung in der Chirurgie ist eine Herausforderung, und es kann ratsam sein, vor dem Einsatz von wertvollem menschlichem Gewebe einen Übungslauf durchzuführen. Nachdem Sie die 10 bis 14 Wochen alte weibliche NSG-Maus betäubt und gemäß dem Textprotokoll für die Operation vorbereitet haben, erwärmen Sie das Tier und überwachen Sie die Körpertemperatur während des gesamten Eingriffs. Reinigen Sie den getrimmten Bereich mit einem Povidon-Jod-Tupfer und wischen Sie ihn dann mit sterilem Alkohol ab.Geben Sie anschließend einen Tropfen steriles Augengleitmittel Tiersalbe auf jedes Auge der Maus, um sie vor Austrocknung und Schädigung der Hornhaut zu schützen. Nach Durchführung einer bilateralen Oophorektomie gemäß dem Textprotokoll wird Buprenorphin subkutan injiziert. Machen Sie dann einen horizontalen Schnitt in der Faszie oberhalb des Gesäßmuskels in einer Länge, die den Gerinnselabmessungen entspricht.Schaffen Sie eine Tasche in diesem virtuellen Raum, indem Sie die Schere unter der Blende öffnen. Nehmen Sie ein Stück zuvor präpariertes eingekapseltes Kortikalgewebe und legen Sie es in die Tasche. Verwenden Sie dann sechs geflochtene resorbierbare Nähte, um die Faszie zu nähen, bevor Sie die Co-Transplantation auf der kontralateralen Seite wiederholen.Die Rückenwand mit vier monofilen resorbierbaren Nähten in einfachen unterbrochenen Nähten verschließen. Injizieren Sie Lidocain subkutan an der Inzisionsstelle. Verwenden Sie dann ein steriles Alkoholpräparat, um die Haut zu reinigen und die postoperative Pflege gemäß dem Textprotokoll durchzuführen.Wie hier zu sehen ist, wurden zwei Wochen nach der bilateralen Transplantation von E4-ORF1 behandelten menschlichen Nabelvenendothelzellen in weibliche NSG-Mäuse funktionell perfundierte Gefäße gebildet, die aus GFP markierten exogenen ECs oder ExECs an der Grenzfläche von Wirtsgewebe und Transplantat gebildet wurden. ExECs bildeten funktionelle Gefäße, wenn sie mit Ovarialgewebe in kortikalen Stücken transplantiert wurden, die mit den ExECs von Mäusen oder Menschen cotransplantiert wurden, und erhöhen die Anzahl der überlebenden Follikel im Vergleich zu Kontrolltransplantaten. Diese Zunahme der Follikelentwicklung war mit einer verminderten fibrotischen Fläche bei ExEC-assistierten Transplantaten verbunden.Die endgültigen Werte der fibrotischen Fläche wurden für jedes Transplantat als Durchschnitt von drei analysierten Schnitten berechnet. Wichtig ist, dass Transplantate, die mit menschlichen Vorhautfibroblasten transplantiert wurden, eine schlechte Gewebeviabilität und relativ wenige Follikel aufwiesen. 14 Wochen nach der Transplantation wurden die Mäuse mit Menotropinen stimuliert.Und das Fortschreiten des Follikelwachstums wurde mittels MRT überwacht. Die Entwicklung von Follikeln wurde sowohl bei Kontroll- als auch bei ExEC-assistierten Transplantaten festgestellt. Bei den ExEC-assistierten Transplantaten wurden jedoch mehr und größere Follikel festgestellt.Im Vergleich zu Antralfollikeln, die aus dem Gewebe derselben Patientin gewonnen wurden, zeigte die Granulosazellschicht im fortgeschritteneren Follikel eine erhöhte Expression der ovulatorischen Marker CD44 und HABP1 sowie einen erhöhten Zelltod und eine verminderte Proliferation. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, werden Sie verstehen, wie Sie eine Co-Transplantation von kryokonserviertem Eierstockgewebe mit Endothelzellen in einem Fibringerinnsel durchführen. Und wenn Sie es einmal gemeistert haben, sollten Sie in der Lage sein, dieses Protokoll in weniger als einer Stunde abzuschließen.Aufbauend auf diesem Ansatz können Endothelzellen so verändert werden, dass sie eine beliebige Kombination von sezernierten Faktoren exprimieren, wodurch Signalwege untersucht werden können, die für die Fertilitätserhaltung, Follikulogenese und/oder Gewebetransplantation relevant sein können.

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Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen: eine Zell-basierte Strategie-Kombination beschleunigt Perfusion mit direkten Parakrine Lieferung (Video) | JoVE Journal

Co Transplantation von menschlichen Eierstockgewebe mit veränderter Endothelzellen: eine Zell-basierte Strategie-Kombination beschleunigt Perfusion mit direkten Parakrine Lieferung

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