Verwendung von Anti-Phospho-girdin Antikörper gegen Darm Büschel Zellen frei schwebenden Maus Jejunum Cryosections visualisieren

Das übergeordnete Ziel dieses Färbeverfahrens ist es, Büschelzellen in Jejunum-Kryosektionen der Maus sichtbar zu machen. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Gastroenterologie zu beantworten, z. B. wie die Proliferation von Büschelzellen im Darm von Säugetieren während einer Parasiteninfektion abläuft. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Forscher mit begrenzter histologischer Erfahrung qualitativ hochwertige Bilder von Büschelzellen erhalten können.

Beginnen Sie damit, die Beckenorgane eines frisch formalinfixierten Mauskadavers freizulegen. Schneiden Sie das Ende des Rektums vom Anus ab und trennen Sie den Darm vom Körper, indem Sie das Mesenterium durchtrennen. Um das Jejunum zu isolieren, schneiden Sie den Darm vier Zentimeter von der Analseite des Magenantrums entfernt und entsorgen Sie die Analhälfte des restlichen Dünndarms.

Schneiden Sie das Jejunum in zwei Hälften, um den Spülvorgang zu erleichtern. Geben Sie 20 Milliliter 10 % gepufferte neutrale Formalinlösung in eine 20-Milliliter-Spritze und befestigen Sie eine 18-Gauge-Nadel, bei der die Fase entfernt ist. Injizieren Sie dann 10% gepufferte neutrale Formalinlösung von einem Ende des abgeschnittenen Jejunums, um den Darminhalt auszuspülen und die Oberfläche des Darmlumens zu fixieren.

Waschen Sie das Darmlumen, indem Sie PBS injizieren. Spülen Sie dann mit flüssiger Gelatinelösung, um das PBS zu ersetzen. Verschließen Sie ein Ende des abgeschnittenen Jejunums durch eine Nahtligatur mit einer 6-0 Nylon-Schnittnaht.

Füllen Sie das Jejunum mit flüssiger Gelatine und verschließen Sie das gegenüberliegende Ende durch Nahtligatur. Als nächstes bindest du vier Nahtknoten über die Länge des Jejunums. Weichen Sie das Gewebe über Nacht bei 4 Grad Celsius in 50 Millilitern 15%iger Saccharose in 10%gepufferter neutraler Formalinlösung ein.

Am nächsten Tag schneiden Sie das Jejunum an den Nahtknoten ab, um drei wurstartige Jejunemstücke zu erhalten, die an beiden Enden ligiert sind. Richten Sie die Stücke in einem Kryomold aus und bedecken Sie sie dann mit Einbettmasse. Frieren Sie den Kryoschimmel in Isopentan ein, das mit flüssigem Stickstoff gekühlt wird.

Um Jejunumabschnitte vorzubereiten, stellen Sie zunächst sowohl die Temperatur der Kryostatkammer als auch die Objekttemperatur auf minus 22 Grad Celsius ein. Legen Sie den gefrorenen Gewebeblock für mindestens 15 Minuten in einem Kryomold in die Kryostatkammer. Schneiden Sie den Block nach 15 Minuten mit einer Rasierklinge in zwei Hälften, um den Querschnitt des Jejunums freizulegen.

Montieren Sie eine Hälfte des Blocks auf einen Kryostat-Adapter. Schneiden Sie das mit Gelatine gefüllte Jejunum in 30 Mikrometer dicke Abschnitte. Verwenden Sie eine gefrorene Pinzette, um die Schnitte vorsichtig in eine 35-Millimeter-Kulturschale mit 3 Millilitern PBS zu überführen.

Nachdem Sie die Schnitte dreimal für jeweils fünf Minuten mit 3 Millilitern PBS-T gewaschen haben, geben Sie 3 Milliliter frisch zubereitete Antigen-Rückgewinnungslösung in die Schale mit den frei schwebenden Abschnitten. Schließen Sie dann den Deckel, verschließen Sie den Spalt zwischen der Schale und dem Deckel mit einem Streifen Vinylband und inkubieren Sie drei Stunden lang bei 50 Grad Celsius in einem Hybridisierungsinkubator ohne Schütteln. Nach der Immunfärbung wird die Schale mit den gefärbten Schnitten in PBS in ein stereoskopisches Mikroskop übertragen.

Geben Sie 200 Mikroliter PBS in einem Tröpfchen auf die Mitte eines MAS-kodierten Objektträgers aus weißem Glas. Übertragen Sie dann mit einer P200-Pipettenspitze einen Jejunumabschnitt aus der Schale in das Tröpfchen. Nachdem Sie die Schnittausrichtung angepasst haben, saugen Sie alle verbleibenden PBS an, die den Schnitt umgeben.

Fügen Sie 20 Mikroliter wässriges Eindeckmedium hinzu und legen Sie einen Deckglas auf das Medium. Versiegeln Sie die Deckglaskanten sofort mit Eindeckmedien auf Xylolbasis und lassen Sie sie zwei bis drei Stunden trocknen, bevor Sie mit der konfokalen Mikroskopie beginnen. Die Gelatinefüllung des Jejunums bewahrt die runde Scheibenform und behält die aufrechte Positionierung der Zotten bei.

In Ermangelung einer Gelatinefüllung neigen Jejunalabschnitte zum Knicken, so dass die Zotten nach hinten schwingen können. pY1798 beschreibt reproduzierbar ganze Büschelzellen, einschließlich der Membran, des Zytoplasmas des spulenförmigen Somas und der stark gefärbten luminalen Spitze, wobei die robuste Signalkondensation dem hervorstehenden Büschel einer Büschelzelle entspricht. Phalloidin hat eine hohe Affinität zu filamentösem Aktin, das in Mikrovilli vorhanden ist, die den Rand der Darmbürste bilden.

Phalloidin markiert reproduzierbar und deutlich den verdickten Bürstenrand, der einer Masse von Wurzelchen entspricht, die sich vom Büschel erstrecken. Die konsistente Co-Lokalisierung von pY1798-Signalen mit dem markant verdickten, phalloidin-positiven Bürstenrand zeigt, dass dieses Protokoll erfolgreich Büschelzellen identifiziert, unabhängig davon, ob sie sich auf einer Zotte oder in einer Krypta befinden. Einmal gemeistert, kann diese Technik in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Die Kombination aus niedrig emittierender Punktgelatine, frei schwebenden Kryoschnitten und Niedertemperatur-Antigengewinnung kann für die Immunfärbung anderer Projektgewebe eingesetzt werden.