Quantifizierung der intrazellulären Wachstum innen Makrophagen wird eine schnelle und zuverlässige Methode zur Beurteilung der Virulenz des Parasiten Leishmania

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, die Virulenz verschiedener Leishmania-Stämme durch die Infektion von maurischen Knochenmark-Makrophagen in vitro zu bewerten und die anschließende Quantifizierung der intrazellulären Wachstumskinetik von Parasiten durchzuführen. Diese Methode kann uns helfen, wichtige Fragen zu den Faktoren zu beantworten, die sowohl vom Makrophagen des Wirts als auch vom Erreger ausgehen und die Virulenz der infektiösen Leishmanien-Parasiten bestimmen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass es sich um eine schnelle, wirtschaftliche und zuverlässige Methode handelt, die im Vergleich zu In-vivo-Studien deutlich weniger Tiere benötigt.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Leishmaniose, da sie zur Beurteilung der Infektiosität mutierter Leishmaniose-Stämme oder der Wirksamkeit therapeutischer Wirkstoffe verwendet werden kann. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Isolierung von Makrophagen aus dem Knochenmark und die Quantifizierung intrazellulärer Parasiten allein aus schriftlichen Protokollen nur schwer zu erlernen sind. Beginnen Sie damit, eine vier bis sechs Wochen alte weibliche Maus an ein Sezierbrett zu befestigen und das Tier mit 70 % Ethanol zu desinfizieren.

Mache mit einer Schere einen einen Zentimeter großen Schnitt in der Nähe eines Hüftgelenks und schneide die Haut rund um das Gelenk durch. Ziehe die Haut vom Bein in Richtung Knöchel, um die Gliedmaße vorsichtig zu enthandschuhen, und schneide den Fuß am oder unter dem Sprunggelenk ab, um das Schienbein in Takt zu lassen. Um das Hüftgelenk zu lokalisieren, manipulieren Sie den Oberschenkelknochen, um den Drehpunkt zu identifizieren, und trennen Sie mit der Schere das Bein über dem Hüftgelenk ab, wobei der proximale Kopf des Oberschenkelknochens in Takt bleibt.

Entfernen Sie so viel Muskel- und Bindegewebe wie möglich aus dem Bein und legen Sie die gereinigten Knochen in eine Petrischale mit sterilem RPMI, das mit Antibiotika auf Eis ergänzt ist. Nachdem Sie den zweiten Satz Beinknochen entnommen haben, verwenden Sie eine sterilisierte Pinzette und eine Klinge mit der Nummer zehn, um das verbleibende Muskel- und Bindegewebe zu entfernen. Übertragen Sie die gereinigten Knochen auf einen leeren Petrischalendeckel und entfernen Sie mit dem Skalpell beide Enden jedes Schienbeins, um an das Knochenmark zu gelangen.

Legen Sie mit einer Pinzette ein Schienbein über die Öffnung eines konischen 50-Milliliter-Röhrchens auf Eis und führen Sie die Spitze einer 25-Gauge-Nadel, die an einer 10-Milliliter-Spritze befestigt ist, die mit mit Antibiotika versetzten Medien gefüllt ist, in ein Ende der Tibia ein. Spülen Sie etwa fünf bis 10 Milliliter Medium durch den Knochen in die konische Röhre, bis das gesamte rote Knochenmarkgewebe entnommen wurde und der Knochen weiß erscheint. Wenn das gesamte Knochenmark entnommen wurde, zentrifugieren Sie das gepoolte Knochenmark und suspendieren Sie die Knochenmarkzellpalette in fünf Millilitern Makrophagenmedium aus dem Knochenmark.

Übertragen Sie die Knochenmarkzellsuspension in einen 175 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben, der 60 Milliliter steriles Makrophagenmedium aus dem Knochenmark enthält, und spülen Sie das Röhrchen zweimal mit Medium aus dem Kulturkolben, um eine maximale Zellrückgewinnung zu gewährleisten. Nach der zweiten Wäsche wird ein Aliquot von 30 Millilitern Zellen in einen zweiten 175 Quadratzentimeter großen Zellkulturkolben überführt und jeder Kolben mit einer Filterkappe verschlossen. Dann werden beide Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid inkubiert, um die residenten Makrophagen von kontaminierenden Fibroblasten oder anderen adhärenten Zellen trennen zu können.

Am nächsten Morgen werden 10 Milliliter undifferenzierter, knochenmarkzellhaltiger Überstand aus jedem Kolben in einzelne 100 x 15 Millimeter große, nicht gewebekulturbehandelte Polystyrol-Petrischalen überführt und die Zellen für weitere zwei bis drei Tage in den Zellkultur-Inkubator zurückgebracht. Füttern Sie die Kulturen dann mit fünf Millilitern frischem, 37 Grad Celsius heißem Makrophagenmedium pro Schale und stellen Sie die Platten wieder in den Inkubator. Verwenden Sie am siebten oder achten Tag nach der Kultur eine Aspirationsspitze, die an einer Vakuumleitung angebracht ist, um vier im Autoklaven sterilisierte 12-Millimeter-Glasdeckfolien ohne Überlappung auf den Boden jeder Vertiefung einer Kulturplatte mit sechs Vertiefungen zu übertragen.

Bereiten Sie für jeden Zeitpunkt des Experiments identische Platten vor. Waschen Sie anschließend die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagenkulturen zweimal mit frischem 37 Grad Celsius PBS und fünf Millilitern PBS ohne Kalzium und Magnesium, ergänzt mit einem Millimolar EDTA auf jede Platte. Nach fünf Minuten bei 37 Grad Celsius poolen Sie die abgelösten Zellen in einem konischen 50-Milliliter-Röhrchen und spülen jede Platte zweimal mit weiteren fünf Millilitern PBS ohne Kalzium und Magnesium.

Nach der Zentrifugation werden die Makrophagen in fünf bis 10 Millilitern frischem Makrophagenmedium aus dem Knochenmark auf Eis resuspendiert. Nach der Zählung verdünnen Sie die Zellen auf die Konzentration von fünf mal 10 bis 10 pro Milliliter in frischem Makrophagenmedium aus Knochenmark und fügen Sie zwei Milliliter Zellen pro Vertiefung zu der Sechs-Well-Platte hinzu. Inkubieren Sie die Zellen dann über Nacht im Zellkultur-Inkubator.

Um die Zellen mit L. amazonesis zu infizieren, verdünnen Sie die Parasitensuspension auf die entsprechende experimentelle Infektionsvielfalt und fügen Sie 50 bis 100 Mikroliter Parasiten zu jeder Vertiefung aller sechs Vertiefungsplatten hinzu, einschließlich aller Zeitpunkte des Experiments. Inkubieren Sie die aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen für die entsprechende Infektionsdauer und -temperatur. Waschen Sie dann die Vertiefungen dreimal mit zwei Millilitern frischem PBS mit 37 Grad Celsius ohne Kalzium oder Magnesium pro Vertiefung und fixieren Sie die Proben zum ersten Zeitpunkt 10 Minuten lang mit 1,5 bis 2 Millilitern 2%-Paraformaldehyd.

Für die Platten, die den späteren Zeitpunkten entsprechen, geben Sie zwei Milliliter frisches Makrophagenmedium aus dem Knochenmark in jede Vertiefung und geben Sie die Platten wieder in den entsprechenden Inkubator. Fixieren und waschen Sie dann die Zellen für jeden verbleibenden Zeitpunkt, wie gerade gezeigt, und lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius in frischem PBS. Um die Zellen mit DAPI zu färben, ersetzen Sie den Überstand durch 1,5 Milliliter frisches PBS ohne Kalzium und Magnesium, ergänzt mit 0,1 % nichtionischem Reinigungsmittel für 10 Minuten bei Raumtemperatur, gefolgt von drei Zwei-Milliliter-Waschgängen mit PBS ohne Kalzium oder Magnesium.

Anschließend färben Sie die Zellen eine Stunde lang bei Raumtemperatur mit zwei Mikrogramm pro Milliliter DAPI in einem Milliliter PBS. Legen Sie nach drei Wäschen die Eindeckfolien mit der Zellseite nach unten auf einen einzelnen Glasobjektträger, der mit einem handelsüblichen Anti-Fade-Einbettreagenz montiert ist. Um die Anzahl der infizierten Zellen zu quantifizieren, verwenden Sie dann das 100-fache Emersionsölobjektiv eines Fluoreszenzmikroskops und einen manuellen Zähler, um die Anzahl der kleineren Amastigotenkerne zu identifizieren, die um jeden großen DAPI-gefärbten Kern gruppiert sind.

Leishmanien hat zwei infektiöse Formen, metazyklische Promastigoten, die sich in der stationären Phase der Kultur von prozyklischen Promastigoten unterscheiden, und Amastigote, die intrazelluläre infektiöse Form, die im Wirbeltierwirt vorkommt. Hier können axenisch differenzierte Amastigoten innerhalb eines aus dem Knochenmark gewonnenen Makrophagen eine Stunde nach der Erstinfektion und vor der Bildung parasitophorer Vakuolen durch phagolysosomale Fusion sichtbar gemacht werden. Nach 48 Stunden können deutliche große parasitophore Vakuolen beobachtet werden, die mehrere Parasiten beherbergen, charakteristisch für eine virulente Leishmanien-Infektion.

Im Gegensatz dazu sind nicht-virulente Promastigoten in der logarithmischen Phase nicht in der Lage, die Entwicklung parasitophorer Vakuolen zu initiieren, replizieren sich nicht und werden schließlich in Wirtsmakrophagen abgetötet. In diesem Experiment wurde ein stetiger Anstieg der Anzahl intrazellulärer metazyklischer Leishmania-Parasiten vom Wildtyp bis zu 72 Stunden nach der Infektion beobachtet, während bei mutierten Parasiten mit einem beeinträchtigten mitochondrialen Eisenimport wenig bis gar kein intrazelluläres Wachstum gemessen wurde, was darauf hindeutet, dass mitochondriale Aktivität für das Parasitenwachstum in Makrophagen erforderlich ist. Makrophageninfektionen, die mit Wildtyp- und mutierten axenischen Amastigoten durchgeführt wurden, zeigten ein intrazelluläres Wachstumsmuster, das dem bei metazyklischen Promastigoten beobachtet wurde, jedoch mit einer noch höheren Infektiosität von Wildtyp-Parasiten als bei metazyklischen Promastigoten.

Es ist wichtig zu beachten, dass es eine anfängliche Verzögerung von 24 Stunden für metazyklische Promastigoteninfektionen gibt, was der Zeit entspricht, die internalisierte metazyklische Promastigoten benötigen, um sich zunächst in Amastigoten zu differenzieren, bevor sie mit der Replikation beginnen. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 Tagen abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die geeigneten Mausstämme zu verwenden und eine sorgfältige Quantifizierung sowohl der Makrophagen- als auch der Parasitenzellen durchzuführen, um konsistente MOIs in allen Experimenten zu gewährleisten.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man aus dem Knochenmark gewonnene Makrophagen kultiviert und sie mit Leishmanien infiziert, um ihr intrazelluläres Parasitenwachstum nach der Kernfärbung mit DAPI zu quantifizieren. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Leismania äußerst gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen getroffen werden sollten, wie z. B. die Verwendung einer biologischen Sicherheitswerkbank und persönlicher Schutzausrüstung sowie die Vermeidung scharfer Instrumente.