Name: Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-27T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 42 s
Description: Lernen Sie die Mikroinjektion von Embryonen des westlichen Maiswurzelbohrers Diabrotica virgifera virgifera für CRISPR/Cas9-Genombearbeitung und Keimbahntransformation. Diese Methode ermöglicht funktionale Genomstudien zur Erforschung von Resistenzmechanismen.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem Forschungsprogramm von Monsanto Mais Maiswurzelbohrer wissen, MDL aus NCSU Nummer AG/1005 (, MDL und YC) und Startkapital gewähren. Gewähren Sie FC wurde unterstützt durch Zuschüsse aus Monsantos Mais Maiswurzelbohrer wissen Research Program (AG/1005) und der National Science Foundation, Nummer MCB-1244772 (MDL). Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt. FC und MDL konzipiert und gestaltet die Experimente; FC, PW und SP durchgeführt die Experimente; FC und MDL analysiert die Ergebnisse; und FC, NG und MDL schrieb das Manuskript. Teresa O'Leary, William Klobasa und Stephanie Gorski danken wir für ihre kompetente Unterstützung in screening-WCR. Wir danken Dr. Wade French (USDA-ARS, North Central Agricultural Research Laboratory, Brookings, SD) für Sendungen von Eiern, Lab Kolonien und die Aufzucht Protokolle zu etablieren.

(1) Kolonie-Ebene Aufzucht von WCR Erwachsene
<ol><li>Erhalten Sie eine ausreichende Menge an WCR Erwachsene (500-1.000) von einem zuverlässigen Unternehmen oder Forschung Labor (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) und legen Sie in einem 30 cm3 -Käfig. Hinweis: Eine nicht ruhenden Belastung wird sehr empfohlen.</li>
	<li>WCR künstliche Ernährung nach Protokoll des Herstellers vorbereiten und Gießen Sie eine 1 cm dicken Schicht in eine 38 Unzen-Container (siehe Tabelle der Materialien). Nach dem Mischen speichern Sie ungenutzte Diät bei 4 ° C für bis zu 2 Monate.</li>
	<li>Setzen Sie eine Petrischale (100 x 15 mm) mit Erwachsenen Diät (10-15 g) in einen 30 cm3 -Käfig. Fügen Sie weitere Diät, wenn das Essen trocken oder niedrig ist.</li>
	<li>Setzen Sie eine Flasche (300 mL) mit Wasser, bedeckt mit einem Wattebausch, die verwendet wird, um eine Watterolle (6 "x 3/8"), dienen zu halten als eine Wasserquelle. Wechseln Sie das Wasser, wenn es zur Neige geht.</li>
	<li>WCR bei 26 ° C mit 60 % Luftfeuchtigkeit zu erhalten und eine 14:10 leichte Zyklus in ein Insekt Aufzucht Inkubator.</li>
</ol>(2) Embryo Sammlung und Ausrichtung
<ol><li>Machen Sie ein Ei Sammelkammer mit 1 % Agar in Wasser in einem sterilen 100 x 15 mm2 Petrischale. Nach das Agar erstarrt bei 4 ° C lagern.</li>
	<li>Um neu gelegten Eiern zu sammeln, legen Sie eine einzelne Schicht aus Filterpapier, gefolgt von 4 Schichten von Gaze (jeder Schnitt, Größe) auf der Oberfläche des Nährbodens (Abbildung 1A). Hinweis: Gaze kann wiederverwendet werden, nachdem er gewaschen in Bleichmittel und autoklaviert, aber es ist nicht notwendig, dies bei der ersten Verwendung zu tun. Filterpapier darf nicht wiederverwendet werden und muss nicht sterilisiert werden.</li>
	<li>WCR Käfig so spät in den Tag wie möglich (Ende des Arbeitstages) Ei Sammlung Platte setzen und abdecken mit Alufolie Zelt. Lassen Sie über Nacht. Hinweis: Nachdem die Lichter auf von 10:00 bis 12: 00 Uhr (14 h) Verzögerungen Eiablage, erleichtert die Sammlung von jüngeren Eiern für die Mikroinjektion ohne Laborpersonal Sammelkammer in Käfig spät in der Nacht zu platzieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das Ei Sammelkammer rund 8 oder 09:00</li>
	<li>Verwenden Sie Zange um zu holen 1 Schicht aus Gaze Zeit und Ort in einem Becherglas (500 mL) Wasser. Waschen von Eiern aus Gaze von leichtem rühren (Abbildung 1 b und 1 C).</li>
	<li>Verwenden Sie eine Glühbirne Pipette Eiern in ein weiteres Becherglas (500 mL) Wasser zu übertragen. Wiederholen Sie 2-3 X um die Eizellen zu reinigen.</li>
	<li>Verwenden Sie die Glühbirne Pipette übertragen von Eiern auf Filterpapier (Abbildung 1) bei gleichzeitiger Minimierung der Menge an Wasser Verschleppung.</li>
	<li>Schneiden Sie schwarzes Filterpapier in Streifen so breit wie ein Glas Folie und Klebeband fest an der Folie, um sicherzustellen, liegt das Papier flach (Abbildung 2A). Hinweis: Schwarzes Filterpapier verbessert die Sichtbarkeit unter dem Mikroskop durch Verringerung der Menge des reflektierten Lichts.</li>
	<li>Ungiftigen Kleber auftragen (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel) auf das Filterpapier in feinen Linien (Abb. 2 b). Halten Sie die Klebstoff-Linien dünner ist als der Durchmesser eines Eies zu vermeiden, die Eiern, die im Klebstoff beschichtet.</li>
	<li>Verwenden Sie einen feinen Pinsel, um sanft WCR Eiern eins nach dem anderen aus ihrer Filterpapier in die Klebefuge verschieben. Versuchen Sie, die Eiern auf den Kleber legen, bevor es trocknet aus und halten Sie mindestens ein Ei Abstand zwischen jedem Ei.</li>
	<li>Injektion Effizienz zu maximieren, indem Sie mehrere Zeilen von Eiern auf einem Filterpapier Folie (Abbildung 3).</li>
	<li>Nachdem alle Eizellen auf dem Filterpapier gelegt sind, warten Sie, bis der Leim, bevor Mikroinjektion trocknet. Hinweis: Für Germline Veränderung und CRISPR/Cas9-vermittelten Genom Bearbeitung, Spritzen Sie alle Embryonen bis zum Mittag (12:00), damit der älteste Embryo nicht mehr als 19 h alt ist. Jedoch für RNAi gibt es keine zeitliche Begrenzung, da im WCR, DsRNA zwischen den Zellen bewegen kann. In der Tat könnte bessere Überlebensraten für RNAi, Alterung Embryonen führen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Plasmid-DNA und Injektionsnadeln
<ol><li>Bereiten Sie qualitativ hochwertige supercoiled Plasmid-DNA mit Hilfe einer Endotoxin-freie kommerzielle kit (siehe Tabelle der Materialien für ein Beispiel).</li>
	<li>Um die Injektionslösung vorzubereiten, überprüfen Sie die Konzentration der einzelnen Plasmid und verbinden Sie Helfer Plasmid (250 ng/µL Endkonzentration), Spender Plasmid (750 ng/µL Endkonzentration) und Phenol rot Puffer (20 % Endkonzentration). Wirbel die Lösung kurz und Zentrifuge für 3 min bei maximaler Geschwindigkeit Partikel ausgefällt, die die Nadel verstopfen könnten.</li>
	<li>Ziehen Sie Borosilikatglas Nadeln (O.D. 1 mm, I.D. 0,58 mm, Länge 10 cm) mit einem flammenden/braun Typ Mikropipette Abzieher. Für die Lagerung deaktivieren sichere zog Nadeln auf doppelseitiges Klebeband in einer Petrischale oder andere Container. Hinweis: Für die Mikropipette Puller System, die verwendeten Einstellungen waren: Wärme = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100.</li>
	<li>Abgleich die Injektionsnadel mithilfe einen Mikro-Loader Spitze (siehe Tabelle der Materialien) zu pipettieren 0,5 - 1,0 µL nach unten in die Nadel in der Nähe das spitz zulaufende Ende. Entfernen Sie Luftblasen aus der Spitze der Nadel, wenn auftreten.</li>
	<li>Legen Sie die Injektionsnadel in den Nadelhalter.</li>
	<li>Öffnen Sie die Spitze der Nadel durch sanft brechen mit einer feinen Pinzette oder sanft berühren/ziehen die Spitze auf das Deckglas oder Glas Folie. Hinweis: Das Ziel ist es, die kleinste Öffnung haben, noch die Injektion Mischung zu kommen, erlaubt (kleinere Öffnungen erfordern in der Regel höheren Einspritzdruck). Abgeschrägte Nadeln erforderlich nicht diesen Schritt, da sie bereits geöffnet sind.</li>
</ol>4. Mikroinjektion und nach der Injektion Pflege
<ol><li>Mit einem feinen Pinsel, vorsichtig die Oberfläche von 1 bis 3 Eiern mit sterilem Wasser nass, Stechen Sie die Nadel und die Lösung zu injizieren. Jedes Ei zu injizieren, bevor die Oberfläche trocknet. Suchen Sie das Erscheinungsbild eine kleine Menge der roten Farbe in Eiern während der Einspritzung an die erfolgreiche Mikroinjektion. Zerquetschen Sie, oder entfernen Sie alle Eizellen, die suchen Sie beschädigt, leer, oder sonst können nicht injiziert werden. Hinweis: Obwohl Einspritzdruck je nach Bohrung Nadelstärke variiert, 10-13 Psi ist ein guter Ausgangspunkt.</li>
	<li>Nachdem alle Eizellen injiziert werden, entfernen Sie das Filterpapier aus der Glas-Folie.</li>
	<li>Legen Sie das Filterpapier auf die Oberfläche einer 1 % Agar-Schale (oben beschrieben).</li>
	<li>Verwenden Sie Kunststoff Paraffin Film zu versiegeln die Schüssel, und legen Sie in einem 26 ° C Insekt Aufzucht Inkubator für 12 Tage. Hinweis: Der Paraffin-Film verhindert Kreuzkontamination von Schimmel zwischen den Gerichten. Eine andere Behandlung, Schimmel und Bakterienwachstum zu verhindern könnte jedoch das Überleben der injizierten Embryonen reduzieren.</li>
</ol>(5) kultiviert und schlüpfen der Embryonen
<ol><li>Fangen Sie an Embryonen 12 Tage nach der Injektion für die frisch geschlüpften Larven überprüfen und weiterhin täglich für die nächsten 2 Wochen.</li>
	<li>Larven, mit einem feinen Pinsel um eine Aufzucht Box mit gekeimtes Getreide und Boden zu übertragen. Hinweis: Schimmel in der Agar-Schale wachsen könnte, sondern Larven schlüpfen nach wie vor in den meisten Fällen. Suchen Sie nach Larven sorgfältig in die Form, um sie alle zu fangen. Einige Larven auf den Deckel der Schale bewegen könnte und möglicherweise in der Kondensation stecken.</li>
	<li>Hinten Sie Larven bei 26 ° C standard WCR Aufzucht Methoden25nach.</li>
</ol>

<ol><li>Gray, M. E., Sappington, T. W., Miller, N. J., Moeser, J., Bohn, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+and+Invasiveness+of+Western+Corn+Rootworm%3A+Intensifying+Research+on+a+Worsening+Pest%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Entomology%22%5BJournal%5D)">Adaptation and Invasiveness of Western Corn Rootworm: Intensifying Research on a Worsening Pest.</a> Annual Review of Entomology. 54, 303-321 (2009).</li>
<li>Gassmann, A. J., Petzold-Maxwell, J. L., Keweshan, R. S., Dunbar, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Field-evolved+resistance+to+Bt+maize+by+western+corn+rootworm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Field-evolved resistance to Bt maize by western corn rootworm.</a> PLoS One. 6 (7), e22629(2011).</li>
<li>Gray, M. E., Levine, E., Oloumi-Sadeghi, H. <a target="_blank" href="https://www.cabdirect.org/cabdirect/abstract/19991107592">Adaptation to crop rotation: western and northern corn rootworms respond uniquely to a cultural practice.</a> Recent research developments in entomology. 2, 19-31 (1998).</li>
<li>Meinke, L. J., Siegfried, B. D., Wright, R. J., Chandler, L. D. <a target="_blank" href="https://digitalcommons.unl.edu/entomologyfacpub/87/">Adult Susceptibility of Nebraska Western Corn Rootworm (Coleoptera: Chrysomelidae) Populations to Selected Insecticides.</a> Journal of Economic Entomology. 91 (3), 594-600 (1998).</li>
<li>Roselle, R., Anderson, L., Simpson, R., Webb, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRoselle%2C+R+%22Annual+report+for+1959%2C+cooperative+extension+work+in+entomology%22">Annual report for 1959, cooperative extension work in entomology</a>. , University of Nebraska Extension. Lincoln, NE. (1959).</li>
<li>Wright, R., Meinke, L., Siegfried, B. Corn rootworm management and insecticide resistance management. Proceedings. , 45-53 (1996).</li>
<li>Baum, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+coleopteran+insect+pests+through+RNA+interference%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Control of coleopteran insect pests through RNA interference.</a> Nat Biotechnol. 25 (11), 1322-1326 (2007).</li>
<li>Velez, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parameters+for+Successful+Parental+RNAi+as+An+Insect+Pest+Management+Tool+in+Western+Corn+Rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Parameters for Successful Parental RNAi as An Insect Pest Management Tool in Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Genes (Basel). 8 (1), (2016).</li>
<li>Alves, A. P., Lorenzen, M. D., Beeman, R. W., Foster, J. E., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+as+a+method+for+target-site+screening+in+the+Western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22J+Insect+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA interference as a method for target-site screening in the Western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> J Insect Sci. 10, 162(2010).</li>
<li>Rangasamy, M., Siegfried, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validation+of+RNA+interference+in+western+corn+rootworm+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte+%28Coleoptera%3A+Chrysomelidae%29+adults%5BTitle%5D)+AND+%22Pest+Management+Science%22%5BJournal%5D)">Validation of RNA interference in western corn rootworm Diabrotica virgifera virgifera LeConte (Coleoptera: Chrysomelidae) adults.</a> Pest Management Science. 68 (4), 587-591 (2012).</li>
<li>Khajuria, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parental+RNA+interference+of+genes+involved+in+embryonic+development+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera+LeConte%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parental RNA interference of genes involved in embryonic development of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera LeConte.</a> Insect Biochem Mol Biol. 63, 54-62 (2015).</li>
<li>Cooley, L., Kelley, R., Spradling, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insertional+mutagenesis+of+the+Drosophila+genome+with+single+P+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Insertional mutagenesis of the Drosophila genome with single P elements.</a> Science. 239 (4844), 1121-1128 (1988).</li>
<li>Robertson, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+stable+genomic+source+of+P+element+transposase+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">A stable genomic source of P element transposase in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 118 (3), 461-470 (1988).</li>
<li>Spradling, A. C., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transposition+of+Cloned+P+Elements+into+Drosophila+Germ+Line+Chromosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Transposition of Cloned P Elements into Drosophila Germ Line Chromosomes.</a> Science. 218 (4570), 341-347 (1982).</li>
<li>O'Kane, C. J., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+in+situ+of+genomic+regulatory+elements+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Detection in situ of genomic regulatory elements in Drosophila.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 84 (24), 9123-9127 (1987).</li>
<li>Lukacsovich, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-tagging+gene+trap+of+novel+genes+in+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Dual-tagging gene trap of novel genes in Drosophila melanogaster.</a> Genetics. 157 (2), 727-742 (2001).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+Gene+Expression+as+a+Means+of+Altering+Cell+Fates+and+Generating+Dominant+Phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted Gene Expression as a Means of Altering Cell Fates and Generating Dominant Phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Horn, C., Offen, N., Nystedt, S., Hacker, U., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+and+enhancer+detection+as+a+tool+for+functional+insect+genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis and enhancer detection as a tool for functional insect genomics.</a> Genetics. 163 (2), 647-661 (2003).</li>
<li>Bassett, A. R., Tibbit, C., Ponting, C. P., Liu, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+targeted+mutagenesis+of+Drosophila+with+the+CRISPR%2FCas9+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Highly efficient targeted mutagenesis of Drosophila with the CRISPR/Cas9 system.</a> Cell Rep. 4 (1), 220-228 (2013).</li>
<li>Moscou, M. J., Bogdanove, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+cipher+governs+DNA+recognition+by+TAL+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors.</a> Science. 326 (5959), 1501(2009).</li>
<li>Bibikova, M., Golic, M., Golic, K. G., Carroll, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+chromosomal+cleavage+and+mutagenesis+in+Drosophila+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 161 (3), 1169-1175 (2002).</li>
<li>Jeggo, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+breakage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Genet%22%5BJournal%5D)">DNA breakage and repair.</a> Adv Genet. 38, 185-218 (1998).</li>
<li>Gantz, V. M., Bier, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+editing.+The+mutagenic+chain+reaction%3A+a+method+for+converting+heterozygous+to+homozygous+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome editing. The mutagenic chain reaction: a method for converting heterozygous to homozygous mutations.</a> Science. 348 (6233), 442-444 (2015).</li>
<li>Windbichler, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+homing+endonuclease-based+gene+drive+system+in+the+human+malaria+mosquito%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A synthetic homing endonuclease-based gene drive system in the human malaria mosquito.</a> Nature. 473 (7346), 212-215 (2011).</li>
<li>Branson, T. F., Jackson, J. J., Sutter, G. R. <a target="_blank" href="https://academic.oup.com/jee/article-abstract/81/1/410/935020">Improved Method for Rearing Diabrotica virgifera virgifera (Coleoptera, Chrysomelidae).</a> Journal of Economic Entomology. 81 (1), 410-414 (1988).</li>
<li>Siebert, K. S., Lorenzen, M. D., Brown, S. J., Park, Y., Beeman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tubulin+superfamily+genes+in+Tribolium+castaneum+and+the+use+of+a+Tubulin+promoter+to+drive+transgene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Tubulin superfamily genes in Tribolium castaneum and the use of a Tubulin promoter to drive transgene expression.</a> Insect Biochem Mol Biol. 38 (8), 749-755 (2008).</li>
<li>Chu, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Germline+transformation+of+the+western+corn+rootworm%2C+Diabrotica+virgifera+virgifera%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Germline transformation of the western corn rootworm, Diabrotica virgifera virgifera.</a> Insect Mol Biol. , (2017).</li>
<li>Ingolia, T. D., Craig, E. A., McCarthy, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+of+three+copies+of+the+gene+for+the+major+Drosophila+heat+shock+induced+protein+and+their+flanking+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Sequence of three copies of the gene for the major Drosophila heat shock induced protein and their flanking regions.</a> Cell. 21 (3), 669-679 (1980).</li>
<li>Berghammer, A. J., Klingler, M., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+universal+marker+for+transgenic+insects%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A universal marker for transgenic insects.</a> Nature. 402 (6760), 370-371 (1999).</li>
<li>Branson, T. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1111/j.1570-7458.1976.tb02591.x/abstract">The selection of a non-diapause strain of Diabrotica virgifera (Coleoptera: Chrysomelidae).</a> Entomologia Experimentalis et Applicata. 19 (2), 148-154 (1976).</li>
<li>Handel, K., Grunfelder, C. G., Roth, S., Sander, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tribolium+embryogenesis%3A+a+SEM+study+of+cell+shapes+and+movements+from+blastoderm+to+serosal+closure%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Genes+Evol%22%5BJournal%5D)">Tribolium embryogenesis: a SEM study of cell shapes and movements from blastoderm to serosal closure.</a> Dev Genes Evol. 210 (4), 167-179 (2000).</li>
<li>Handler, A. M., James, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHandler%2C+AM+%22Insect+transgenesis%3A+methods+and+applications%22">Insect transgenesis: methods and applications</a>. , CRC Press. (2000).</li>
<li>Lorenzen, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((piggyBac-based+insertional+mutagenesis+in+Tribolium+castaneum+using+donor%2Fhelper+hybrids%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">piggyBac-based insertional mutagenesis in Tribolium castaneum using donor/helper hybrids.</a> Insect Mol Biol. 16 (3), 265-275 (2007).</li>
<li>Gilles, A. F., Schinko, J. B., Averof, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+CRISPR-mediated+gene+targeting+and+transgene+replacement+in+the+beetle+Tribolium+castaneum%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Efficient CRISPR-mediated gene targeting and transgene replacement in the beetle Tribolium castaneum.</a> Development. 142 (16), 2832-2839 (2015).</li>
<li>Phuc, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Late-acting+dominant+lethal+genetic+systems+and+mosquito+control%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Late-acting dominant lethal genetic systems and mosquito control.</a> BMC Biol. 5, 11(2007).</li>
<li>Horn, C., Wimmer, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgene-based%2C+embryo-specific+lethality+system+for+insect+pest+management%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A transgene-based, embryo-specific lethality system for insect pest management.</a> Nat Biotechnol. 21 (1), 64-70 (2003).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Obwohl Mikroinjektion des WCR mit DsRNAs zum Zwecke der RNAi gemeldeten9wurde, dies ist das erste Protokoll, best Practices für microinjecting precellular WCR Embryonen, ein kritischer Prozess für die Durchführung von Keimbahn Transformation zu etablieren und/oder CRISPR/Cas9 Genom Bearbeitung in dieser Art. Erfolgreiche Mikroinjektion WCR Embryonen ist abhängig von vielen Faktoren ab, wie transformationseffizienz. Nachfolgend sind einige der wichtigsten Fragen das Ergebnis unter Verwendung dieses...

Maiswurzelbohrer (WCR), Diabrotica Virgifera Virgifera, ist ein wichtiger Schädling von Mais1. Interessanterweise scheint WCR Überwindung Kontrolle Maßnahmen schneller als die meisten landwirtschaftlichen Schädlinge, da sie nicht nur physiologisch sondern auch verhaltensorientierte2,3,4,5, anpassen 6. im letzten Jahrzehnt RNA-Interferenz (RNAi), ein leistungsfähiges funktionelle Genomik Werkzeug, wurde als eine mögliche Steuerungsmethode für WCR7,8untersucht, und wurde auch als Mittel verwendet, um gen Funktion9zu studieren. Während RNAi durch Mikroinjektion von doppelsträngige RNA (DsRNA) bei anderen Spezies häufig durchgeführt wird, ist jedoch Injektion basierende RNAi in WCR selten. In der Tat gibt es nur wenige Berichte über RNAi per Mikroinjektion von DsRNA in WCR9. Der Grund ist, dass WCR auch erlaubt das Studium der embryonalen Effekte durch die Fütterung von DsRNA der Mutter11High-Level der Gen Knockdown über Einnahme von DsRNA7,10, erreichen kann. Während diese Methode eine ausgezeichnete Thema für funktionelle Genomanalyse über RNAi WCR macht, hat es Fortschritte bei der Entwicklung von Methoden zur embryonalen Mikroinjektion in dieser Spezies verlangsamt.
Trotz der Macht der RNAi gibt es ein paar Nachteile. Zum Beispiel reagieren nicht alle Gene gleich auf RNAi. Diese Variabilität kann Interpretation der Ergebnisse eines funktionellen Genomik-Assays schwieriger machen. Auch, RNAi ist flüchtig und löst keine vererbbare Mutationen. Auf der anderen Seite erzeugen Keimbahn Transformation, eine weitere funktionelle genomische Tool, vererbbare Mutationen über Einfügung eines markierten Elements übertragbar in das Genom12,13. Dies macht Keimbahn Transformation ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Erstellung von mutierte Stämme für den Einsatz in genetischen Langzeitstudien. Transformation kann auch verwendet werden, um eine Mutation zu retten, durch die Bereitstellung einer funktionsfähige Kopie des Gens für eine mutierte Genom-14. Darüber hinaus ist die Keimbahn Transformation der Grundstein für eine Vielzahl von molekulargenetischer. Neben ausschlagen und/oder Rettung Genfunktion, Germline Veränderung Enhancer Trapping15, Gene Trapping16, Gal4-basierte ektopische Expression17und genomweite Mutagenese18einsetzbar.
Vor kurzem wurden Tools, mit denen anspruchsvolle Genom-Bearbeitung entwickelt. Zu diesen Tools zählen Transkription Activator-Like Effektor Nukleasen (TALEN) und die CRISPR/Cas9-Nuklease System19,20. Der Vorteil dieser neuen Werkzeuge ist, dass sie Forscher die Fähigkeit, eine doppelsträngige DNA Pause an fast jedem Ort in fast jedem Genom zu induzieren. Sobald induziert, diese Pausen können repariert werden, durch nicht-homologe Enden verbinden, die Deletionen oder Insertionen in das gezielte gen einführen kann, oder durch Homologie gerichtete Reparatur, die in der Gegenwart ein veränderter Konstrukt, katalysieren kann die Ersatz des gesamten Gene oder genetische Regionen21,22. Diese Methoden erfordern jedoch Mikroinjektion von DNA, RNA und Protein zu sehr jungen Embryonen.
Wichtig ist, überschreiten nicht anders als die DsRNAs verwendet für RNAi, Nukleinsäuren und Proteine zur Keimbahn Transformation und Genom-Bearbeitung leicht Zellmembranen. Daher muss Mikroinjektion von Plasmid-DNA, mRNAs und/oder Proteine statt in der syncytial Blastoderm Phase (d. h. vor der Insekten Embryo cellularizes). Dadurch wird dem Zeitpunkt der Injektionen einen kritischen Faktor. Zum Beispiel in Drosophila Melanogastermüssen Embryonen injiziert werden, innerhalb von zwei Stunden nach Ei12zu legen. Daher muss Entwicklung eines erfolgreichen embryonalen Mikroinjektion Protokolls für WCR die besten Voraussetzungen für weibliche Eiablage, sowie die beste Methode zum Sammeln von precellular Embryonen in ausreichender Menge berücksichtigen.
Dem Bemühen, eine Vielzahl von molekularen genetischen Werkzeuge auf WCR Biologie zu bringen erfordert Methoden zum Sammeln und microinjecting precellular WCR Embryonen entwickeln. Hier bieten wir Ihnen eine ausführliche Anleitung, zusammen mit Tipps und Tricks, um anderen Transformation-basierte Techniken WCR Forschung verwendet zu helfen. Diese Techniken ermöglichen neben der Verlängerung transgener Technologies, WCR für funktionelle Genomforschung Studien, auch leistungsstarke neue Bekämpfungsstrategien wie gen Fahrt23,24 in diesem wirtschaftlich bedeutenden getestet werden Schädling.

<table><tbody><tr><td>Qualitatives Filterpapier (Schwarz)</td><td>Ahlstrom</td><td>8613-0900</td><td>Für Ei Mikroinjektion</td></tr><tr><td>1 oz Behälter&nbsp;</td><td>Anny's Plastic Tableware</td><td>ASET101</td><td>Egg Container</td></tr><tr><td>Drosophila Agar Typ II</td><td>Apex</td><td>66-103</td><td>Substrat für WCR Eiablageschale</td></tr><tr><td>Federleichte Pinzette</td><td>Bioquip</td><td>4748</td><td>Umgang mit Larven und Puppen&nbsp;</td></tr><tr><td>Clorox Regular-Bleach1</td><td>Clorox</td><td>44600-30770</td><td>Mais und Geschirr waschen</td></tr><tr><td>Trucker's Favorite Yellow</td><td>Coor Farm Supply</td><td>502</td><td>Mais zum Füttern WCR</td></tr><tr><td>Microinjection System (hausgemacht)</td><td>NA</td><td>Teile & Anweisungen auf Anfrage erhältlich</td><td>Steuert den Injektionsdruck (0-20 psi)</td></tr><tr><td>Elmer's ungiftiger Kleber</td><td>Elmer's Products, Inc.</td><td>E304</td><td>Eier auf Filterpapier kleben</td></tr><tr><td>epTIPS Microloader-Spitzen</td><td>Eppendorf</td><td>C2554691</td><td>Verfüllnadeln Ladespitzen</td></tr><tr><td>Falcon Gewebekulturschalen</td><td>Falcon</td><td>25383-103</td><td>Keimen von Mais /150 x 25 mm</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Filterpapier in quantitativer Qualität Kreise</td><td>Fisher Scientific</td><td>S47576C</td><td>Herstellung einer Agarschale für die Eiablage/9 cm</td></tr><tr><td>Sparkleen Fisher</td><td>Scientific</td><td>04-320-4</td><td>Waschgeschirr</td></tr><tr><td>Einfache Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-549-3</td><td>Halten von Filterpapier und Eiern für die Mikroinjektion</td></tr><tr><td>Westlicher Maiswurzelbohrer ohne Pollenersatz</td><td>Frontier Agricultural Sciences&nbsp;</td><td>F9766B</td><td>WCR Künstliche Ernährung für Erwachsene</td></tr><tr><td>Wattebäusche, groß</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td>Schließen Sie den Kolben</td></tr><tr><td>Globe Scientific 3,0 mL Kleine Kugeltransferpipetten</td><td>Globe Scientific</td><td>137035</td><td>Sammeln und übertragen Sie Eier</td></tr><tr><td>Leica M165 FC Fluoreszenz-Stereomikroskop&nbsp;</td><td>Leica</td><td>M165 FC&nbsp;</td><td>WCR-Screening</td></tr><tr><td>DsRed Filterset für Fluoreszenz-Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td>DSR</td><td>Anregungsfilter: 510-560 nm, Emissionsfilter: 590-650 nm</td></tr><tr><td>EGFP Filter</td><td>Leica</td><td>GFP2</td><td>Anregungsfilter: 440&ndash; 520 nm, Emissionsfilter: 510 nm</td></tr><tr><td>BugDorm</td><td>MegaView Science</td><td>DP1000_5P</td><td>Käfig für adulte Kolonie</td></tr><tr><td>Miniatur-Pinsel</td><td>MyArtscape</td><td>MAS-102-MINI</td><td>Liner 2/0&nbsp;</td></tr><tr><td>Joystick Mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MN-151</td><td>Mikromanipulator und Nadelhalter</td></tr><tr><td>Mikroskop XY Tisch</td><td>Olympus</td><td>265515</td><td>Mikroskoptisch (angepasst für die Verwendung mit Stereoskop)</td></tr><tr><td>Grade 90 Cheesecloth</td><td>Online Fabric Store</td><td>CHEE90</td><td>Für Eiablage</td></tr><tr><td>Kunststoff Paraffinfolie&nbsp;</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-996</td><td>Siegel Agarschale nach Mikroinjektion / Rollengröße 4 Zoll x 125 ft</td></tr><tr><td>Percival Inkubator</td><td>Percival&nbsp;</td><td>I41VLH3C8</td><td>WCR-Anzuchtkammer (Inkubator für die Insektenaufzucht)</td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben mit engem Mals</td><td>VWR</td><td>4980-300-PK</td><td>Wasserbehälter für adulte Völker&nbsp;</td></tr><tr><td>Griffin Low Form Becher</td><td>VWR</td><td>1000-600-PK</td><td>Für die Eierwäsche</td></tr><tr><td>Geflochtene Watterollen</td><td>Richmond Dental Cotton Co.</td><td>605-3599</td><td>Verwendung in der Wasserversorgung für adulte Völker&nbsp;</td></tr><tr><td>Petrischalen (35x10mm)</td><td>SIGMA</td><td>CLS430588-500EA</td><td>Für Diätplatten</td></tr><tr><td>Phenolrot</td><td>Sigma</td><td>143-78-8</td><td>Mikroinjektionspuffer</td></tr><tr><td>Laserbasierter Mikropipiettenabzieher</td><td>Sutter Instrument</td><td>P-2000/G</td><td>Nadelabzieher/Hitze = 335, FIL = 4, VEL = 40, DEL = 200, PUL = 100</td></tr><tr><td>Premium Mutterboden</td><td>The Scotts Company</td><td>71130758</td><td>Erde für den Cron-Anbau</td></tr><tr><td>Reloc Zippit 2 Mil Zipper Bags</td><td>United States Plastic Corporation</td><td>48342</td><td>Tasche Agarschale nach Mikroinjektion / 5x7</td></tr><tr><td>Petrischalen (100x15m)</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td>Herstellung von Agarschale für die Eiablage / 100 x 15 mm</td></tr><tr><td>6 oz Behälter</td><td>Webstaurantstore</td><td>128E506</td><td>WCR Einzelpaar Paar-Paarungskammer&nbsp;</td></tr><tr><td>38 oz Behälter</td><td>Webstaurantstore</td><td>128NC888</td><td>Larvenaufzuchtbox/38</td></tr><tr><td>oz ChoiceHD 16 oz. Mikrowellentauglicher durchscheinender Kunststoff Deli Container</td><td>Webstaurantstore</td><td>128HRD16</td><td>Larvenaufzuchtbox/16 oz</td></tr><tr><td>Mikroinjektion Zielfernrohr&nbsp;</td><td>Wild Heerbrugg</td><td>WILD-M8</td><td>Mikroinjektions-Zielfernrohr mit einem XY-Tisch</td></tr><tr><td>Standard-Glaskapillaren</td><td>World Precision Instruments</td><td>1B100F-4</td><td>Mikroinjektionsnadeln</td></tr> Erwachsene <tr><td>Westlicher Maiswurzelbohrer</td> North <td>Centeral Aqricultural research laboratory</td><td>Nicht-Diapase-Stamm</td><td>Anfrage von Dr. Bryan Wade Französisches Labor</td></tr><tr><td>Plasmid DNA Midi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12143</td><td>Aufreinigung von injektionsfertigen Plasmid-DNAs</td></tr></tbody></table>

mikroinjektion der westliche maiswurzelbohrer diabrotica virgifera virgifera, embryonen für die keimbahn transformation oder crispr/cas9 genom-bearbeitung

Microinjection of Western Corn Rootworm, Diabrotica virgifera virgifera, Embryos for Germline Transformation, or CRISPR/Cas9 Genome Editing

Der Maiswurzelbohrer (WCR) ist ein wichtiger Schädling von Mais und ist bekannt für seine Fähigkeit, schnell zu Pest Managementstrategien anzupassen. RNA-Interferenz (RNAi) erwies sich ein leistungsfähiges Werkzeug für WCR Biologie zu studieren, hat aber seine Grenzen. Speziell, RNAi selbst vergänglich ist (d. h. nicht zu langfristigen Mendelian Erbschaft des zugehörigen Phänotyps), und es erfordert eine Kenntnis der DNA-Sequenz des Zielgens. Letzteres kann die Begrenzung wenn der Phänotyp des Interesses von schlecht erhaltenen oder auch neuartigen Genen gesteuert wird weil er einfach nur nützliche Ziele schwierig sein würde, wenn nicht gar unmöglich. Daher sollte die Anzahl der Werkzeuge in WCRs genomische Toolbox durch die Entwicklung von Methoden, die verwendet werden könnte, um stabile mutierte Stämme erstellen und aktivieren Sequenz-unabhängige Umfragen des Genoms WCR erweitert werden. Hier zeigen wir die Methoden zum Erfassen und microinject precellular WCR Embryonen mit Nukleinsäuren verwendet. Während die hier beschriebenen Protokolle auf die Schaffung von transgenen WCR ausgerichtet sind, könnte CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung auch mit durchgeführt werden die gleichen Protokolle mit dem einzigen Unterschied, die Zusammensetzung der Lösung in die Embryonen injiziert.

Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung dieses Protokolls war die Phase der Embryonalentwicklung zum Zeitpunkt der Mikroinjektion. Insbesondere erfordert Keimbahn Transformation Mikroinjektion von DNA vor der embryonalen Cellularization. Und zwar deshalb, weil DNAs Zellmembranen leicht überschreiten können. Versuche, die Phasen des WCR Embryonalentwicklung mit einem nuklearen Fleck visualisieren blieben erfolglos, weil Dechorionation WCR Embryonen im Wesentlichen alle verantwortlich für ...

Hier präsentieren wir Protokolle für sammeln und microinjecting precellular westlichen Mais Maiswurzelbohrer Embryonen zum Zwecke der Ausführung der funktionellen Genomik Assays wie Keimbahn Transformation und CRISPR/Cas9-Genom-Bearbeitung.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

The western corn rootworm (WCR) is an important pest of corn and is well known for its ability to rapidly adapt to pest management strategies. Although ...

Das übergeordnete Ziel dieses Mikroinjektionsprotokolls ist es, das Genom des Westlichen Maiswurzelbohrers zu modifizieren. Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Biologie des Westlichen Maiswurzelbohrers und seiner Fähigkeit, Schädlingsbekämpfungsmethoden wie BT Toxin und RANI schnell zu überwinden, zu beantworten. Neben dem Westlichen Maiswurzelbohrer kann diese Methode auch auf ähnliche Arten wie den Südlichen und Nördlichen Wurzelbohrer angewendet werden.Die Idee zu dieser Methode kam mir, als ich in den 90er Jahren gebeten wurde, bei der injektionsbasierten RANI im Westlichen Maiswurzelbohrer zu helfen. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben. Denn die Aufzucht des Westlichen Maiswurzelbohrers im Labor ist arbeitsintensiv.Und die Überlebensraten bleiben mit der aktuellen Technologie niedrig. Besorgen Sie sich zwischen 500 und 1.000 erwachsene Wurzelbohrer, die nicht pausieren, von einem zuverlässigen Unternehmen oder Forschungslabor. Und halten Sie sie in 30 Kubikzentimeter großen Käfigen.Bewahren Sie die übliche künstliche Ernährung des Wurzelbohrers in etwa einen Zentimeter tiefen Frischhaltebehältern auf. Nicht verwendetes Futter kann bis zu zwei Monate bei vier Grad Celsius gelagert werden. Um den Wurzelbohrer zu füttern, beladen Sie 100 Zentimeter große Petrischalen mit 10 bis 15 Gramm Futter.Laden Sie eine Schüssel Futter in jeden Wurzelbohrerkäfig. Und fülle sie wieder auf, wenn der Vorrat zur Neige geht oder die Nahrung austrocknet. Bewahren Sie außerdem in jedem Käfig ein 300-Milliliter-Wasserreservoir auf, das mit einem Wattebausch bedeckt ist, um als Wasserquelle zu dienen.Wechseln Sie das Wasser, wenn es zur Neige geht. Halten Sie den eingesperrten Wurzelbohrer bei 26 Grad Celsius mit 60 % Luftfeuchtigkeit und einem 14/10-Lichtzyklus in einem Insektenzuchtbrutkasten. Schalten Sie das Licht später am Tag aus, z. B. um Mitternacht, damit die Eier vor der morgendlichen Arbeitszeit gelegt werden.Zuerst werden die Embryonen entnommen. Für eine Eiauffangfläche befüllen Sie eine 100-Millimeter-Petrischale mit 30 Millilitern 1%Agar und Wasser. Legen Sie dann eine einzelne Schicht Filterpapier auf den Agar, gefolgt von vier Schichten Käsetuch.Jede Schicht sollte zugeschnitten werden. Legen Sie dann so spät wie möglich am Tag die Eierauffangplatte in den Wurzelbohrerkäfig und decken Sie ihn mit einem Alufolienzelt ab. Entfernen Sie dann am nächsten Morgen die Eizellentnahmekammer.Nehmen Sie mit einer Pinzette jeweils eine Schicht Käsetuch auf und legen Sie es in ein 500-Milliliter-Becherglas, das mit Wasser gefüllt ist. Die Eier vom Käsetuch abwaschen, indem du sie im Wasser schwenkst. Verwende dann eine Zwiebelpipette, um die Eier als Waschschritt in ein anderes Becherglas mit Wasser zu geben.Führen Sie auf diese Weise zwei oder drei Wäschen durch. Legen Sie dann die geputzten Eier mit so wenig Wasser wie möglich auf Filterpapier ab. Bereiten Sie als Nächstes eine Folie vor, indem Sie ein Stück schwarzes Filterpapier flach auf die Folie kleben, um den Kontrast zu verbessern.Träufeln Sie dann feine Linien ungiftigen Klebers auf das Papier, mit dem die Eier befestigt werden. Halte den Kleber unter dem Umfang eines Eies. Während der Kleber nass ist, legst du die Eier mit einem feinen Pinsel auf die Klebelinie.Halten Sie mindestens ein Ei Abstand zwischen jedem Ei. Bereiten Sie mehrere Reihen Eier pro Folie vor. Die Eizellen sollten nun innerhalb von 30 Minuten injiziert werden.Kombinieren Sie nun das Helferplasmid, das Donorplasmid und den Phenolrotpuffer. Verwenden Sie hochwertige, supergewickelte Plasmide, die mit einem endotoxinfreien kommerziellen Kit hergestellt wurden. Fortex kurz zum Mixen.Und dann die Partikel drei Minuten lang mit maximaler Geschwindigkeit herunterschleudern. Anschließend wurden gezogene Borosilikatglasnadeln mit 0,5 bis 1 Mikroliter Injektionslösung verfüllt. Wenn sich Blasen bilden, entferne sie unbedingt.Befestigen Sie dann die Injektionsnadel am Mikromanipulator. Brechen Sie nun bei Bedarf unter dem Mikroskop die versiegelte Nadelspitze vorsichtig mit einer feinen Pinzette ab oder indem Sie die Spitze vorsichtig in eine Glasbarriere berühren. Versuchen Sie, die kleinstmögliche Öffnung zu machen, die die Injektionslösung freisetzt.Vor dem Injizieren der Wurzelbohrer-Eier die Oberfläche von ein bis drei vorbereiteten Eiern mit einem feinen Pinsel vorsichtig mit sterilem Wasser befeuchten. Injizieren Sie dann die benetzten Embryonen. Führen Sie die Nadel vorsichtig in die Mitte des Embryos ein und injizieren Sie eine kleine Menge der Lösung.Beginnen Sie mit einem Druck von 10 bis 13 psi und passen Sie den Druck nach Bedarf an. Trockene Embryonen haben eine ausgeprägte runde Form, indem jeder Embryo mit Wasser vorbenetzt wird, ändert sich seine Form und die Eischale wird weicher, so dass die Nadel leicht eindringen kann. Ein erfolgreich injizierter Embryo hat eine kleine Menge roter Farbe.Wenn ein Ei beschädigt wurde, seltsam aussieht oder nicht injiziert werden kann, zerdrücken Sie es oder entfernen Sie es aus dem Objektträger. Nachdem alle Eier injiziert sind, legen Sie das Filterpapier mit den Eiern darauf in eine 1%-Agar-Schale. Dann verschließen Sie die Schale mit Paraffinfolie und brüten sie bei 26 Grad Celsius aus, bis die Larven schlüpfen.Beginnen Sie 12 Tage nach der Injektion in den nächsten zwei Wochen täglich mit der Suche nach Larven. Setzen Sie die Larven mit einer feinen Bürste in eine Aufzuchtbox mit gekeimtem Mais und Erde um, um sie unter normalen Bedingungen aufzuziehen. Die Keimbahntransformation des Wurzelbohrers wurde versucht, indem ein Transposase-tragendes Plasmid mit einem Transposon-tragenden Plasmid in präzelluläre Embryonen injiziert wurde.Bei den 26 Überlebenden wurde jeder EFP-Ausdruck verwendet, um nach Insertion von Donorelementen zu suchen. Obwohl thorazente Nachkommen identifiziert wurden, erwies sich das Screening von Wurzelbohrerembryonen mit der intensiven Lichtquelle als tödlich. In der nächsten Runde der Keimbahntransformation wurde ein Gen für rot fluoreszierendes Protein verwendet, das von einem konstitutiv aktiven Promotor aus Drosophila melanogaster gesteuert wird.Die Überlebensraten verbesserten sich, aber es wurde nur eine DS-Rot-positive Larve registriert. Als nächstes wurden die Embryonen mit Puffer allein oder mit Helfer- und thorescent markierten Spender-DNA-Plasmiden mikroinjiziert. Ein ähnliches Verhältnis von Embryonen, die schlüpften, wenn nur Plasmide oder Puffer injiziert wurden.Und interessanterweise schlüpfte nur etwa die Hälfte der nicht injizierten Embryonen. Dadurch wurde die Letalität der Manipulation der Embryonen für die Injektion so hoch wie die Durchführung der Injektion. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Embryonen der Western Corn Rootwall mikroinjiziert.Sobald sie gemeistert sind, können mit dieser Technik zwei- bis dreihundert Embryonen pro Stunde injiziert werden. Diese Methode verdankt sich den Techniken, die für die Keimbahntransformation von Drosophila melanogaster entwickelt wurden und als Vorlagen für viele andere Arten dienen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung durchgeführt werden, um gezielte Mutationen im Genom der Westlichen Maiswurzelwand vorzunehmen.Um spezifische Fragen zur Genomfunktion zu beantworten.

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Dieses Video beschreibt die Mikroinjektion, eine gängige Methode zur Herstellung transgener C. elegans-Stämme. Im Beispiel sehen wir, wie die Mikroinjektion verwendet wird, um einen Ribonukleoprotein (RNP)-Komplex für die Genbearbeitung auf CRISPR-Basen einzuführen.

Gonaden-Mikroinjektion: Eine Methode zur direkten Verabreichung von Verbindungen in die Keimbahn von C. elegans

Die Mittelmeerfruchtfliege Ceratitis capitata (Diptera: Tephritidae) ist ein weltweiter Schädling der Landwirtschaft. Ein tieferes Verständnis ihrer Biologie ist der Schlüssel, um die Populationen der Medfly zu kontrollieren und so die wirtschaftlichen Auswirkungen zu reduzieren. Die Mikroinjektion von Embryonen ist ein grundlegendes Instrument, das sowohl die Transformation der Keimbahn als auch umgekehrte genetische Studien bei dieser Spezies ermöglicht.

Lieferung von Nukleinsäuren durch Embryomikroinjektion in der weltweiten Agrar Pest Insekt,<em&gt; Mittelmeerfruchtfliege</em

Mikroinjektion von Nasonia Vitripennis Embryonen ist eine wesentliche Methode zur Erzeugung von erblichen Genom Modifikationen. Hier beschrieben, ist eine detaillierte Anleitung für die Mikroinjektion und Transplantation von Nasonia Vitripennis Embryonen, die zukünftige Genom Manipulation in diesem Organismus erheblich erleichtern wird.

Embryo Mikroinjektion und Transplantation Technik für Nasonia Vitripennis Genom Manipulation

Dieses Protokoll beschreibt Mikroinjektionsverfahren für Culex quinquefasciatus-Embryonen, die für die Arbeit mit CRISPR/Cas9-Genbearbeitungswerkzeugen optimiert sind. Diese Technik kann effizient ortsspezifische, vererbbare Keimbahnmutationen erzeugen, die für den Aufbau genetischer Technologien in diesem wenig untersuchten Krankheitsvektor verwendet werden können.

Embryo-Mikroinjektionstechniken für eine effiziente ortsspezifische Mutagenese bei Culex quinquefasciatus

Wir bieten ein detailliertes Protokoll für die Aufzucht, Mikroinjektion von Eiern und für eine effiziente Paarung des Feuerbres Thermobia domestica zur Erzeugung und Aufrechterhaltung mutierter Stämme nach der Genombearbeitung.

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Hier beschreiben wir Methoden für effiziente Puppen- und Erwachseneninjektionen in Nasonia vitripennis als zugängliche Alternativen zur Embryo-Mikroinjektion, die eine funktionelle Analyse von Genen von Interesse entweder mit RNA-Silencing über RNA-Interferenz (RNAi) oder Gen-Knockout durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing ermöglichen.

Puppen- und Erwachseneninjektionen zur RNAi- und CRISPR-Genbearbeitung bei Nasonia vitripennis

Dieses Protokoll beschreibt die Schritte der gezielten Mutagenese von CRISPR/Cas9 bei Sandfliegen: Embryoentnahme, Injektion, Insektenzucht und -identifikation sowie Auswahl von Mutationen von Interesse.

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Viele Merkmale der Insekten-Eusozialität beruhen auf der Kommunikation innerhalb der Kolonie und der Arbeitsteilung. Die genetische Manipulation wichtiger regulatorischer Gene in Ameisenembryonen durch Mikroinjektion und CRISPR-vermittelte Mutagenese liefert Einblicke in die Natur altruistischen Verhaltens bei eusozialen Insekten.

Embryo-Injektionen für CRISPR-vermittelte Mutagenese im Ant Harpegnathos saltator

Hier wird ein Protokoll der Helicoverpa armigera (Hübner) Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutantenidentifizierung vorgestellt, das durch CRISPR/Cas9-Genom-Editing erstellt wurde. Mutierte Insekten ermöglichen die weitere Erforschung der Genfunktion und Interaktion zwischen verschiedenen Genen in vivo.

Embryo-Mikroinjektion und Knockout-Mutanten-Identifizierung von CRISPR/Cas9 Genome-Edited Helicoverpa Armigera (Hübner)

Hierin werden Protokolle zur Entnahme und Mikroinjektion von präzellulären Maiszikadenembryonen zum Zwecke der Modifikation ihres Genoms durch CRISPR/Cas9-basierte Genom-Editierung oder zur Zugabe markierter transponierbarer Elemente durch Keimbahntransformation vorgestellt.

Mikroinjektion von Maiszikade, Peregrinus maidis, Embryonen für die CRISPR/Cas9-Genom-Editierung

Dieser Artikel demonstriert die CRISPR-Cas9-vermittelte Genomtechnik im Steinernema hermaphroditum, einem entomopathogenen (EPN: insektenparasitären) Nematoden, und einem entstehenden genetischen Modell. Die beschriebene Technologie ist nützlich zur Erzeugung von Mutanten und ermöglicht die Aufklärung von Genfunktionen in der Nematodenbiologie, die für mutualistische und parasitäre Symbiose relevant sind.

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Lernen Sie die Mikroinjektion von Embryonen des westlichen Maiswurzelbohrers Diabrotica virgifera virgifera für CRISPR/Cas9-Genombearbeitung und Keimbahntransformation. Diese Methode ermöglicht funktionale Genomstudien zur Erforschung von Resistenzmechanismen.

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung (Video) | JoVE Journal

Mikroinjektion der westliche Maiswurzelbohrer Diabrotica Virgifera Virgifera, Embryonen für die Keimbahn Transformation oder CRISPR/Cas9 Genom-Bearbeitung

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