Name: Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-27T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Erfahren Sie eine robuste Methode zur Herstellung nativer, markierungsfreier Huntingtin-Exon-1-Monomere und -Fibrillen mittels SUMO-Fusionsstrategie. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare strukturelle und funktionelle Studien.

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Diese Arbeit wurde vor allem durch Zuschüsse von der CHDI-Stiftung und des Schweizerischen Nationalfonds finanziert. Wir danken Dr. Sophie Vieweg für nützliche Gespräche während der Entwicklung dieses neuen Systems Ausdruck und andere Mitglieder der Lashuel Gruppe für ihre Erfahrungen mit diesem Ausdruck System und für ihre ein- und wertvolles Feedback. Wir danken auch Prof. Oliver Hantschel für die Bereitstellung der ULP1 Plasmid. Die Autoren danken Dr. John B. Warner und Dr. Senthil K. Thangaraj für kritische Durchsicht des Manuskripts

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<li>DiFiglia, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation+of+Huntingtin+in+Neuronal+Intranuclear+Inclusions+and+Dystrophic+Neurites+in+Brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Aggregation of Huntingtin in Neuronal Intranuclear Inclusions and Dystrophic Neurites in Brain.</a> Science. 277 (5334), 1990-1993 (1997).</li>
<li>Atwal, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+has+a+membrane+association+signal+that+can+modulate+huntingtin+aggregation%2C+nuclear+entry+and+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Huntingtin has a membrane association signal that can modulate huntingtin aggregation, nuclear entry and toxicity.</a> Human Molecular Genetics. 16 (21), 2600-2615 (2007).</li>
<li>Sathasivam, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+splicing+of+HTT+generates+the+pathogenic+exon+1+protein+in+Huntington+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Aberrant splicing of HTT generates the pathogenic exon 1 protein in Huntington disease.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 110 (6), 2366-2370 (2013).</li>
<li>Mangiarini, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exon+1+of+the+HD+gene+with+an+expanded+CAG+repeat+is+sufficient+to+cause+a+progressive+neurological+phenotype+in+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Exon 1 of the HD gene with an expanded CAG repeat is sufficient to cause a progressive neurological phenotype in transgenic mice.</a> Cell. 87 (3), 493-506 (1996).</li>
<li>El-Daher, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Huntingtin+proteolysis+releases+non-polyQ+fragments+that+cause+toxicity+through+dynamin+1+dysregulation%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Journal%22%5BJournal%5D)">Huntingtin proteolysis releases non-polyQ fragments that cause toxicity through dynamin 1 dysregulation.</a> EMBO Journal. 34 (17), 2255-2271 (2015).</li>
<li>Lunkes, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteases+acting+on+mutant+Huntingtin+generate+cleaved+products+that+differentially+build+up+cytoplasmic+and+nuclear+inclusions%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Proteases acting on mutant Huntingtin generate cleaved products that differentially build up cytoplasmic and nuclear inclusions.</a> Molecular Cell. 10 (2), 259-269 (2002).</li>
<li>Vieweg, S., Ansaloni, A., Wang, Z. M., Warner, J. B., Lashuel, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Intein-based+Strategy+for+the+Production+of+Tag-free+Huntingtin+Exon+1+Proteins+Enables+New+Insights+into+the+Polyglutamine+Dependence+of+Httex1+Aggregation+and+Fibril+Formation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">An Intein-based Strategy for the Production of Tag-free Huntingtin Exon 1 Proteins Enables New Insights into the Polyglutamine Dependence of Httex1 Aggregation and Fibril Formation.</a> Journal of Biological Chemistry. 291 (23), 12074-12086 (2016).</li>
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<li>Scherzinger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+polyglutamine-containing+huntingtin+fragments+into+amyloid-like+fibrils%3A+implications+for+Huntington%27s+disease+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of polyglutamine-containing huntingtin fragments into amyloid-like fibrils: implications for Huntington's disease pathology.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 96 (8), 4604-4609 (1999).</li>
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<li>Bennett, E. J., Bence, N. F., Jayakumar, R., Kopito, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+impairment+of+the+ubiquitin-proteasome+system+by+nuclear+or+cytoplasmic+protein+aggregates+precedes+inclusion+body+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Cell%22%5BJournal%5D)">Global impairment of the ubiquitin-proteasome system by nuclear or cytoplasmic protein aggregates precedes inclusion body formation.</a> Molecular Cell. 17 (3), 351-365 (2005).</li>
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<li>Nekooki-Machida, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+conformations+of+in+vitro+and+in+vivo+amyloids+of+huntingtin-exon1+show+different+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Distinct conformations of in vitro and in vivo amyloids of huntingtin-exon1 show different cytotoxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U S A. 106 (24), 9679-9684 (2009).</li>
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<li>Legleiter, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monoclonal+antibodies+recognize+distinct+conformational+epitopes+formed+by+polyglutamine+in+a+mutant+huntingtin+fragment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Monoclonal antibodies recognize distinct conformational epitopes formed by polyglutamine in a mutant huntingtin fragment.</a> Journal of Biological Chemistry. 284 (32), 21647-21658 (2009).</li>
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Die Autoren erklären, dass sie keine Interessenkonflikte mit dem Inhalt dieses Artikels.

In diesem Protokoll haben wir ein effizientes Verfahren für herbeiführende Milligramm-Mengen von native, untagged Httex1 skizziert, die 23 oder 43 Glutamin Rückstände enthalten. Dies gelang durch mit dem Ausdruck Httex1 als eine C-terminale Fusion, eine seiner6-SUMO-Tag, das wird verwendet, um die Schmelzverfahren Protein aus der Zelle lysate isolieren von IMAC und vor der HPLC-Reinigung des Httex1 gespalten ist. Während die SUMO-Strategie bei der Herstellung von mehreren anderen Proteinen verwendet worden ist, zeigt unsere Methode, dass die einzigartigen Eigenschaften SUMO könnte auch verwendet werden, um per se zu generieren, Aggregation neigende, Amyloidogenic Protein, das zuvor erwiesen haben ungeordneten äußerst schwierig zu handhaben und zu produzieren43,44. Wir präsentieren Ihnen eine Protokoll, die unkompliziert, einfach zu bedienen und vergleichbar mit einem Protokoll für die Generation der "brav" Protein ist. Die SUMO-Fusion solubilisiert und Httex1 im Ausdruck und der IMAC Reinigungsstufe stabilisiert. Vorzeitiger Spaltung des Tags, als mit der Intein Strategie10 und Aggregation beobachtet wurden nicht mehr ein Problem.
Intrinsisch ungeordneten Proteine sind besonders anfällig für Abbau. Während N-terminale Abbau der N17-Region kein Problem mit diesem Protokoll ist, können Trunkierungen in der PRD Httex1 auftreten. Da die abgeschnittenen Proteine Httex1 in Hydrophobie, Ladung und Größe sehr ähnlich sind, entfernen sie durch chromatographische Mittel ist eine Herausforderung, so ist es am besten zu ihrer Entstehung in erster Linie zu verhindern. Eng an das Protokoll sollte immer arbeiten auf Eis und mit einer ausreichenden Menge an Protease-Hemmer helfen die beobachteten Abschneiden sehr niedrig zu halten. Anwenden eines Fusion-Tags am C-Terminus des Httex1 könnte Trunkierungen in der PRD leicht entfernen wie die abgeschnittene Protein sowie die Affinität Tag verlieren würde. Allerdings, wenn der native Sequenz muss aufrechterhalten werden, dass diese Option angewendet werden kann, wie Httex1 mit Prolin und nach bestem Wissen und gewissen endet gibt es keine C-terminale Fusion-Tags, die bekanntermaßen spurlos und effiziente Spaltung nach Prolin zu induzieren.
Der wichtigste Teil des Protokolls ist der Umgang mit der Httex1 nach der Spaltung des SUMO-Tags von ULP1 befreit. Das Protein sollte sofort mittels RP-HPLC gereinigt werden. Glücklicherweise ist dies eine effiziente und schnelle Reaktion, die in der Regel in 10-20 min bei 4 ° c abgeschlossen ist Im Gegensatz dazu benötigt Intein Strategie mehrere Stunden für komplette Spaltung von Intein, erfordern somit einen Kompromiss zwischen unvollständiger Spaltung und Anfang Aggregation um den Ertrag zu maximieren. Eine schnelle Aufarbeitung ist erforderlich für Mutant Httex1, wie es beginnt bei der vergleichsweise hohe Konzentration im Dekolleté-Reaktion, zu aggregieren, während die 23Q Variante für einen längeren Zeitraum stabil ist. Während der RP-HPLC-Reinigung, ein weiterer Vorteil des SUMO wird deutlich: während die Ssp DnaB Intein hydrophob ist und hält sich stark an der Spalte, SUMO ist mehr hydrophil und elutes komplett aus der Spalte C4 umgekehrt-Phase. Obwohl kommerzielle ULP1 ziemlich teuer ist, kann das Protein in hoher Ausbeute nach zuvor veröffentlichten Protokolle29leicht hergestellt werden.
Die kritische Bedeutung der Anwendung einer Aufschlüsselung Protokoll vor der Verwendung von Httex1 lässt sich nicht oft genug betont. Lyophilisierten PolyQ Proteine wie Httex1 sind stabil und können gespeicherte lange Zeiträume werden, jedoch nicht vollständig löslich in Wasser und Puffer. Das Vorhandensein von vorgeformten Oligomere oder Fibrillen hätte erhebliche Auswirkungen auf die Aggregation Kinetik und biophysikalischen Eigenschaften des Proteins45. Das hier beschriebene Disaggregation-Protokoll ermöglicht die Aufschlüsselung des Proteins, Entfernung des vorgeformten Aggregate und Erzeugung einer Lösung von Monomeren Httex1 aus einem lyophilisierten Sample. Wir beobachteten ähnliche Aggregation Kinetik und Fibrille Morphologie für Httex1 mit der SUMO und Intein Strategie erhalten.
Im Vergleich zu bisherigen Methoden zur Herstellung von Httex1, die hier beschriebene SUMO-Strategie bietet mehrere Vorteile und erweitert die Palette der möglichen Untersuchungen die Struktur und funktionellen Eigenschaften dieses Proteins in Gesundheit und Krankheit. Die SUMO-Httex1-Fusionsprotein ist einfach zu handhaben, es eingefroren und gespeichert oder in Lösung für 24 h bei Raumtemperatur, gehalten, während die freie mHttex1 schnell zusammenfassen würde. Die Stabilität und die hohe Löslichkeit von SUMO-Httex1-Fusionsproteinen bieten größere Flexibilität um das Protein zu manipulieren und/oder enzymatische und chemische Modifikationen in mHttex1, die sonst nicht möglich nach Spaltung einzuführen. Dazu gehören die Einführung des Post-translationalen Modifikationen, Fluorophore, Spin-Etiketten, Biotin-Tags, etc. sollten die Fortschritte hier vorgestellten 1) erleichtern zukünftige Studien zur Aufklärung von Struktur-Funktions-Beziehungen von Httex1; (2) erzeugen Sie neue Werkzeuge, um Htt Aggregation und Pathologie Verbreitung zu untersuchen; (3) ermöglichen Sie die Entwicklung von neuen Assays Moleküle identifizieren, die Mutant Httex1 zu stabilisieren und zu verhindern, dass die Aggregation; und 4) Wissenschaftler aus anderen Bereichen zu arbeiten auf dieses Protein und verbinden unsere Suche nach Kuren für die Huntington-Krankheit zu fördern.

Htt ist ein 348-kDa-Protein und hat in mehreren physiologischen Funktionen1verwickelt worden. Wenn Htt eine erweiterte PolyQ-Region von mehr als 36-Rückständen in der N-Terminus enthält, verursacht es HD2,3. HD-Pathologie ist geprägt von zellulären Einschlüsse im Striatum und Kortex, die zu neuronalen Tod und Atrophie der betroffenen Gewebe4,5führt. Mehrere N-terminale Htt-Fragmente, die den PolyQ wiederholen Trakt enthalten in Post-Mortem Gehirn von Huntington-Patienten erkannt wurden und werden gedacht, um durch proteolytische Verarbeitung von Huntingtin Protein6erzeugt werden. Neuere Studien legen nahe, dass Httex1 auch durch aberrante mRNA Spleißen gebildet werden könnte. Httex1 enthält die pathologische PolyQ-Mutation und seine Überexpression bei Tieren kann viele der wichtigsten Features von HD7, damit eine mögliche zentrale Rolle dieses Fragments in HD Pathologie und Krankheit Fortschreiten6Hervorhebung rekapitulieren, 8,9.
Durch die hohe Aggregation Neigung der Mutant Httex1 (mHttex1) mit erweiterten PolyQ-Darm-Trakt, die Mehrheit der bestehenden Expressionssysteme basieren auf die vorübergehende Verschmelzung von Httex1 Proteinen (z. B. Glutathion-S-Transferase (GST), Thioredoxin (TRX) oder Maltose-Binding-Protein (MBP) und/oder Peptide (Poly-Histidin), das seinen Ausdruck, Stabilität, Reinigung und/oder Löslichkeit10,11,12,13,14 differentiell zu verbessern ,15,16,17,18,19,20,21,22,23 ,24,25,26,27,28. Der Fusion-Partner ist im Zusammenhang mit Httex1 mit einer kurzen Sequenz mit einer spaltstelle für Proteasen wie Trypsin, Tabacco Ätzen Virus (TEV) Protease oder PreScission, um die Spaltung und die Freigabe der Httex1 vor der Einleitung der Aggregation zu ermöglichen oder Reinigung. Mängel dieser Methoden umfassen die Möglichkeit, zusätzliche Rückstände aufgrund nicht spurlos Spaltung und die Schaffung von abgeschnittenen Fragmente durch Miscleavage innerhalb der Sequenz des Httex1, neben der Heterogenität aufgrund unvollständiger Spaltung ( Siehe Vieweg Et Al. für tiefer gehende Diskussion über die Vorzüge und Grenzen dieses Ansatzes)10. Um diese Einschränkungen zu beheben, haben wir vor kurzem eine Ausdruck Strategie entwickelt so dass die Generation der Tag-freie native Httex1 zum ersten Mal durch den Einsatz einer transienten N-terminale Verschmelzung von Synechocystis SP. (Ssp) DnaB Intein bis Httex110. Während die Intein Spaltung spurlos und spezifische ist und mg Menge von Proteinen liefert, es leidet noch zwei Nachteile, die den Ertrag zu reduzieren konnte: nämlich, vorzeitiger Spaltung Intein die auftreten können, während der Ausdruck und die Tatsache, das Dekolleté über Eintritt mehrere Stunden, die zum Verlust des Proteins durch Aggregation, vor allem für Httex1 mit erweiterten PolyQ Wiederholungen führen können.
Um diese Einschränkungen zu beheben und unsere Strategie für die Herstellung von Native zu verfeinern, Tag-freie Httex1, entwickelten wir ein neues System Ausdruck auf die vorübergehende Verschmelzung von SUMO, genauer gesagt die Hefe Homolog Smt3, Httex1. Die Anwendung des SUMO-Systems für die Produktion von rekombinanten Proteinen erschien erstmals im Jahr 200429, wo eine erhöhte Rate von Ausdruck und Löslichkeit von SUMO Schmelzverfahren Protein nachgewiesen wurde. Das SUMO-Tag kann durch Ubiquitin wie Protein-spezifische Protease 1 (ULP1), die erfordert keiner Anerkennung-Website, sondern erkennt die Tertiärstruktur des SUMO und praktisch verhindert, dass Miscleavage30abgespalten werden. Darüber hinaus ULP1-vermittelte Spaltung ist schnell und spurlos und nicht zusätzliche Rückstände hinterlassen. Die vorzeitige Spaltung des Fusion-Tags ist als mit der autokatalytischen Intein10, beobachtet von der Forderung nach einer externen Protease vollständig vermieden. Während die SUMO-Strategie für rekombinantes Protein Produktion31,32,33heute weit verbreitet ist, zeigen wir in diesem Papier, dass es besonders nützlich zur Erzeugung von einer intrinsisch ungeordneten, Zusammenfassung-anfällig, Amyloidogenic Protein wie Httex1. Wir glauben, dass die Einfachheit, Effizienz und Robustheit unserer SUMO-Fusion-basierte Methode native, Tag-free Httex1 besser zugänglich für Forscher aus unterschiedlichen Disziplinen und die Notwendigkeit beseitigen, gebietsfremden Sequenzen von Httex1 in Vitro zu verwenden . Dies ist ein bedeutender Fortschritt, der zukünftige Studien zur Aufklärung der Struktur-Funktions-Beziehung von Httex1 erleichtert.
Das Protokoll beschreibt die Reinigung des Httex1 von 12 L der bakteriellen Kultur, aber das Protokoll könnte leicht für Produktionen von kleineren oder größeren Maßstab angepasst werden. Das Protokoll beschreibt die Herstellung von Wildtyp Httex1 (wtHttex1) mit einem PolyQ Rapportlänge unter (23Q) und Mutant Httex1 (mHttex1) mit einer PolyQ Rapportlänge oben (43Q) die pathogene Schwelle (36Q).

<table><tbody><tr><td>Uranylformiat (UO2(CHO2)2)</td><td>EMS</td><td>22450</td><td></td></tr><tr><td>Formvar/carbon 200 mesh, Cu 50 Gitter</td><td>EMS</td><td>FCF200-Cu-50</td><td></td></tr><tr><td>High Precision Cell made of Quartz SUPRASIL 1 mm Strahlengang von Hellma Analytics</td><td>HellmaAnalytics</td><td>110-1-40</td><td></td></tr><tr><td>Puffersubstanz Dulbecco's (PBS w/o Ca und Mg) ancinne ref 47302 (RT) SERVA</td><td>Witech</td><td>SVA4730203</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>AxonLab</td><td>A0839.0100</td><td></td></tr><tr><td>Luria Bouillon (Miller's LB Brühe)</td><td>&nbsp; Chemie Brunschwig</td><td>1551.05</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta;-D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>AxonLab</td><td>A1008.0025</td><td></td></tr><tr><td>E. coli B ER2566</td><td>NEB</td><td>NEB# E4130</td><td></td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>56750-500G</td><td></td></tr><tr><td>cOmplete&nbsp; Proteaseinhibitor Cocktail</td><td>Roche</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Huntingtin Antikörper, a.a. 1-82</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MAB5492</td><td></td></tr><tr><td>IRDye 680RD Goat Anti-Maus IgG (H + L)</td><td>Licor</td><td>925-68070</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AxonLab</td><td>A0999.0005</td><td></td></tr><tr><td>HisPrep 16/10 Spalte&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>28936551</td><td></td></tr><tr><td>C4 HPLC-Säule</td><td>Phenomenex</td><td>00G-4168. P0</td><td>&nbsp; &nbsp; &nbsp; 10 & Mikro; m C4 300 &Aring;, LC Säule 250 x 21,2 mm, Phenomenex, 19x10 mm Vorsäule, nicht temperaturummantelt</td></tr><tr><td>Acetonitril HPLC</td><td>MachereyNagel</td><td>C2502</td><td></td></tr><tr><td>Filtre seringue Filtropur S 0,45 ul sans prefiltre steril</td><td>Sarstedt AG</td><td>83.1826</td><td></td></tr><tr><td>Spektralphotometer Semi-Mikroküvette</td><td>Reactolab S.A.</td><td>2534</td><td></td></tr><tr><td>Superloop, 1/16" Verschraubungen (&Auml; KTAdesign), 50 ml</td><td>GE Healthcare</td><td>18111382</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoressigsäure</td><td>Sigma</td><td>302031</td><td></td></tr><tr><td>GREINER Tuben für FPLC 16 x 100 mm, Deckel 12,0 ml</td><td>Greiner Bio-One</td><td>7.160 102</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; 100 kD Mikrocontroller Schnelldurchflussfilter</td><td>Merck Millipore Corporation</td><td>MRCF0R100</td><td></td></tr><tr><td>Vibra-cell VCX130 Ultraschall-Flüssigkeitsprozessor</td><td>Sonics</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>& Auml; KTA 900 ausgestattet mit einem Fraktionssammler&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jasco J-815 Zirkulardichroismus</td><td>Jasco</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Waters UPLC-System&nbsp;</td><td>Wasser</td><td></td><td>C8 BEH Gehalt 2,1x100 mm 1,7 Mikron Säule, vorgewärmte Säule (40 &Grad; C), Flussrate von 0,6 mL/min, Injektionsvolumen von 4 μm; L</td></tr><tr><td>Wasser HPLC System</td><td>Waters</td><td></td><td>2489 UV-Detektor und 2535 quaternäres Gradientenmodul, 20 mL Schleife in einem FlexInject Gehäuse</td></tr><tr><td>ESI-MS: Finnigan LTQ</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lyophylizer</td><td>Instrument FreeZone 2.5 Plus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tecnai Spirit BioTWIN</td><td>FEI-Elektronenmikroskop</td><td></td>, <td>ausgestattet mit einer LaB6-Kanone und einer 4K x 4K FEI Eagle CCD-Kamera (FEI) und betrieben bei 80 kV</td></tr><tr><td>37 > C schüttelt&nbsp; Inkubator</td><td>Infors HT multitron Standard</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Biophotometer plus</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

erzeugung von nativen, unmarkierten huntingtin exon1 monomer und fibrillen mit einem sumo-fusion-strategie

Generation of Native, Untagged Huntingtin Exon1 Monomer and Fibrils Using a SUMO Fusion Strategy

Chorea Huntington (HD) ist eine vererbte tödliche Neurodegenerative Erkrankung, die durch eine CAG-Erweiterung (≥36) in der ersten Exon des Huntington-Gens, wodurch des Ausdrucks des Huntingtin-Proteins (Htt) oder N-terminale Fragmente davon mit einer erweiterten Trinukleotiderkrankungen ( PolyQ) Strecke.
Die exon1 des Huntingtin-Proteins (Httex1) ist die kleinste Htt-Fragment, das viele der Funktionen von HD in zellulären rekapituliert und Tier-Modelle und ist eines der am häufigsten untersuchten Fragmente des Htt. Die geringe Größe des Httex1 macht es experimentell zugänglicher, biophysikalische Charakterisierung mittels Standard- und hochauflösenden Techniken im Vergleich zu längeren Fragmente oder Full-Length Htt. Allerdings hat die hohe Aggregation-Neigung der Mutant Httex1 (mHttex1) mit erhöhten PolyQ Inhalt (≥42) machte es schwierig, entwickeln effiziente Ausdruck und Reinigungssysteme, diese Proteine in ausreichender Menge zu produzieren und ihnen zugänglich zu machen Wissenschaftler aus verschiedenen Disziplinen ohne den Einsatz von Fusionsproteinen oder andere Strategien, die die native Sequenz des Proteins verändern. Wir stellen Ihnen hier eine robuste und optimierte Methode zur Herstellung von Milligramm-Mengen von einheimischem, Tag-freie Httex1 basierend auf die vorübergehende Verschmelzung von kleinen Ubiquitin Verwandte Modifikator (SUMO). Einfachheit und Effizienz der Strategie beseitigt die Notwendigkeit nicht-Native Sequenzen des Httex1, so macht dieses Protein leichter zugänglich für Forscher und verbessert die Reproduzierbarkeit der Experimente in verschiedenen Labors verwendet. Wir glauben, dass diese Fortschritte erleichtert auch zukünftige Studien zur Aufklärung der Struktur-Funktions-Beziehung der Htt und entwickeln neuartige Diagnose-Tools sowie Therapien zur Behandlung oder das Fortschreiten der Huntington-Krankheit.

Httex1 drückt sich in E. Coli mit einer N-terminalen seiner6-SUMO-Tag. Die repräsentativen Ergebnisse des Ausdrucks und Reinigung des Fusionsproteins sind in Abbildung 1zusammengefasst. Die Reihenfolge der Httex1 besteht aus Rückständen 2-90 Htt und beginnt mit Ala2, weil Met1 vollständig gespalten in Vivo42ist. Die Nummerierung der Aminosäuren bezieht sich auf die 23Q-Variante, die komplette Sequenz des Fusionsproteins ausgedrückt ist in Abbildung 1Agezeigt. Die Plasmide werden an Addgene in naher Zukunft, mit der Community geteilt werden hinterlegt. Abbildung 1Bzeigt eine schematische Darstellung des Plasmids und ausdrückliche Fusionsproteins. His6-SUMO Httex1 drückt auf einem mittleren Niveau (Abbildung 1C) und die meisten des Fusionsproteins vorliegt in der löslichen Fraktion nach Lyse, sowohl für die 23Q und die 43Q Variante. Das Schmelzverfahren Protein wandert höher als erwartet, basierend auf das Molekulargewicht. Dies ist zum Teil auf die starke Falte des SUMO sondern vor allem durch die ungewöhnliche Reihenfolge Zusammensetzung der Httex1, die vor allem Glutamin und Prolin Rückstände enthalten. Der Wildtyp (23Q) und die Mutante (43Q) Schmelzverfahren Protein kann zu ca. 80 % Reinheit durch IMAC (Abbildung 1D) das Vorhandensein von Co Host Protein Reinigung sich durch die vergleichsweise geringe Expression des Httex1 und der großen Probe lässt angereichert Lautstärke auf die Spalte angewendet.
Die Spaltung seiner6-SUMO-Tag und die Reinigung des Httex1 ist in Abbildung 2Agezeigt. UPLC ist ein effizientes Werkzeug zur Überwachung der Spaltung seiner6-SUMO-Tag (Abbildung 2B). Die ursprüngliche Spitze des Fusionsproteins wird verbraucht und zwei neue und gut getrennt Peaks entspricht seinem6-SUMO-Tag und Httex1 erscheinen. Die Reaktion der Spaltung ist in 10-20 min fertig. Der Western Blot (WB) ist zu langsam, um die Spaltung Reaktion effizient zu überwachen wurde, sondern es in der Abbildung als Referenz und die Vollständigkeit der SUMO-Dekolleté zu zeigen. Beide Httex1 23Q und 43Q können getrennt werden, auch von seinem6-SUMO tag mittels RP-HPLC (Abbildung 2C) und in hoher Reinheit gewonnen wurden, dargestellt durch UPLC, MS und SDS-PAGE-Analyse (Abbildung 2D).
Um zu verdeutlichen, dass die Httex1 Proteine, die von dieser Methode zubereitet behalten die erwarteten Aggregation Eigenschaften der Httex1, wir die Fibrillization Kinetik der Mutant Httex1 bei 37 ° C durch eine Sedimentation Assay bewertet überwacht die Änderungen in der Sekundärstruktur von CD Spektroskopie, und die Morphologie der Aggregate durch TEM charakterisiert. Abbildung 3Azeigt ein repräsentativen Datensatz der Aggregation Kinetik der mHttex1 Fibrille Bildung durch eine Sedimentation-Assay bestimmt. Der Verlust von löslichen Httex1 43Q im Laufe der Zeit durch die Fibrille Bildung durch UPLC quantifiziert wurde. Wir beobachten eine komplette Entleerung des löslichen Proteins nach 48 Stunden Inkubation. Darüber hinaus haben wir die Sekundärstruktur des Proteins durch CD-Spektroskopie (Abbildung 3B) festgestellt. Httex1 43Q Schichten aus unstrukturierten (λmin 205 nm), vor allem β-Sheet reichen Konformation (λmin 215 nm) nach 48 Stunden Inkubation. Dieser Strukturwandel wird durch die Bildung von lange Fibrillären Aggregate als beobachtbare durch TEM 48 Stunden (Abb. 3C) begleitet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig1.jpg"> Abbildung 1 . Ausdruck und Reinigung seiner6-Fusionsprotein SUMO Httex1.  (A) die Aminosäure-Sequenz seiner6-SUMO-Httex1-QN Fusion Konstrukte (seine6-SUMO in grün und Httex1-QN in Orange); (B) schematische Übersicht des Ausdrucks und Reinigung des Fusionsproteins; (C) SDS-PAGE-Analyse des Ausdrucks und die Löslichkeit des Fusionsproteins nach Lyse; (D) Chromatogramm der IMAC-Reinigung des Fusionsproteins und Analyse der Fraktionen durch SDS-PAGE (roter Balken: ungebunden, blaue Bruchstrich: Waschen Bruchteil, schwarz bar: Brüche mit der Elution Gipfel); <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig2.jpg"> Abbildung 2 . Spaltung von seinem6 SUMO Tag und Reinigung des Tag-freie Httex1-QN Proteine. (A) schematische Übersicht; (B) Analyse der Spaltung des SUMO-Tags mit ULP1 von UPLC (blau: vor Zugabe des ULP1; schwarz: 20 min (23Q), bzw. 10 min (43Q) nach Zugabe von ULP1) und WB (MAB5492 1: 2000, sekundäre Ziege anti-Maus-Antikörper 1: 5.000); (C) Chromatogramm der präparativen RP-HPLC-Reinigung von Httex1; D: Analyse des gereinigten Httex1 durch UPLC, SDS-PAGE und ESI-MS; das erwartete Molekulargewicht beträgt 9943 Da (23Q) bzw. 12506 Da (43Q). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57506/57506fig3.jpg"> Abbildung 3 . Aggregation von Httex1-43Q: (A) Sedimentation Assay basierend auf UPLC. (B) CD-Spektren von der Sekundärstruktur bei 0 h und 48 h (C) TEM mikrographen der Aggregate bei 48 h (Maßstabsleisten sind 200 nm). <a href="/files/ftp_upload/57506/57506fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Hier präsentieren wir Ihnen eine robuste und optimierte Protokoll zur Herstellung von Milligramm-Mengen von native, Tag-freie Monomere und Fibrillen von der exon1 des Huntingtin-Proteins (Httex1), basierend auf die vorübergehende Verschmelzung von kleinen Ubiquitin Verwandte Modifikator (SUMO).

Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

Huntington&#39;s Disease (HD) is an inherited fatal neurodegenerative disease caused by a CAG expansion (&#8805;36) in the first exon of the HD gene, ...

Diese Methode ermöglicht es uns, ein tag-freies Exon herzustellen, das die native Sequenz des Proteins trägt, und bietet neue Möglichkeiten, die Strukturfunktion dieses Proteins zu untersuchen und so seine Funktion bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Die Hauptvorteile hierbei sind die Einfachheit, Effizienz und Robustheit der Methode. Durch die Eliminierung der Heterogenität der Sequenz ermöglicht und erleichtert diese Methode den Vergleich und die Reproduzierbarkeit über verschiedene Labore hinweg.Obwohl diese Methode für die Herstellung von Huntingtin-Exon-Ton entwickelt wurde, kann sie auch auf andere aggregationsanfällige Systeme wie Amyloid-Beta-Peptid und Alpha-Synuclein angewendet werden. Zuerst wird ein zuvor isolierter Überstand, der das His-SUMO-Huntingtin-Exon-on-Fusionsprotein enthält, mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter filtriert. Entnehmen Sie eine 20-Mikroliter-Probe des gefilterten Überstands für die SDS-PAGE-Analyse.Füllen Sie das geklärte Lysat in einen Superloop. Isolierung des His-SUMO-Huntingtin-Exon-Eins-Fusionsproteins aus dem geklärten bakteriellen Lysat durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie auf einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem bei vier Grad Celsius. 10 Säulenvolumina oder 200 Milliliter Puffer A mit 10 Millilitern pro Minute passieren, um die ungebundenen Proteine auszuwaschen.Eluieren Sie das Fusionsprotein mit 2,5 Säulenvolumina oder 50 Millilitern 100%Puffer B bei zwei Millilitern pro Minute. Entnehmen Sie 20 Mikroliter jeder Fraktion für die SDS-PAGE-Analyse. Geben Sie 20 Mikroliter Ladefarbstoff zu jeder Probe.Laden Sie zwei Mikroliter des Rohproteins, die ungebundene Fraktion, die Waschfraktion und jede Fraktion des Elutionspeaks auf ein 15%iges Gel. Lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 180 Volt laufen. Wenn der Lauf beendet ist, färben Sie das Gel mit Coomassie-Farbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.Die Fraktionen, die das Fusionsprotein enthalten, werden entsprechend dem Peak des Chromatogramms zusammengefasst. Geben Sie dann 100 millimolare DTT und 100 millimolare L-Cystein zu den gepoolten Fraktionen und lösen Sie sie durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens auf. Um Lösungsmittel A für die HPLC-Reinigung vorzubereiten, geben Sie zwei Milliliter Trifluoressigsäure in eine Zwei-Liter-Flasche Wasser.Zur Herstellung von Lösungsmittel B geben Sie 2,5 Milliliter Trifluoressigsäure in eine 2,5-Liter-Flasche Acetonitril. Bereiten Sie das HPLC-System wie vom Hersteller empfohlen vor. Führen Sie einen leeren Lauf durch, um eine saubere Spalte zu gewährleisten.Anschließend werden 100 Mikroliter des Fusionsproteins vor der Zugabe von ULP1 eingenommen, um die Spaltreaktion durch UPLC zu überwachen. Übertragen Sie 20 Milliliter des Fusionsproteins in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 0,4 Milliliter ULP1-Stammlösung hinzu. Inkubieren Sie die Probe auf Eis und bewahren Sie das verbleibende Fusionsprotein auf Eis auf.Lagern Sie das Protein nicht während der Zwischenschritte und fahren Sie mit der Reinigung bis zum Abschluss fort. Entfernen Sie alle 10 Minuten 100 Mikroliter der Spaltungsreaktion, um den Fortschritt der UPLC zu überwachen. Nach dem Zentrifugieren der Proben werden zwei Mikroliter jedes Überstands mittels UPLC analysiert.Vergleichen Sie die Chromatogramme, die für die Probe vor der Zugabe von ULP1 erhalten wurden, mit den Proben, die danach entnommen wurden. Sobald die SUMO-Spaltung abgeschlossen ist, filtrieren Sie die Probe mit einem 22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter. Als nächstes reinigen Sie die gefilterte Probe durch Umkehrphasen-HPLC.Analysieren Sie die HPLC-Fraktionen mittels UPLC und ESI-MS. Pools von Fraktionen ähnlicher Reinheit in 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein und lyophilisieren Sie sie.Dann wird das lyophilisierte Protein in zwei Milliliter große Plastikröhrchen umgefüllt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Löse 100 Mikrogramm lyophilisiertes Huntingtin-Exon, einen von acht Mikrolitern reiner Trifluoressigsäure in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Trifluoressigsäure vorsichtig unter einem Abzug mit einem Strom von Stickstoff oder Argon verdampft.Sobald das Protein trocken ist, lösen Sie es in 100 Mikrolitern Wasser auf. Analysieren Sie dann zwei Mikroliter Probe mit UPLC. Mischen Sie nun 20 Mikroliter Proteinlösung mit 20 Mikrolitern 2X Ladefarbstoff.Analysieren Sie Proteinproben von einem bis 10 Mikrogramm mit SDS-PAGE. Lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 180 Volt laufen. Wenn der Lauf beendet ist, färben Sie das Gel mit Coomassie-Farbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.Bereiten Sie 10 Milliliter DPBS in einer 50-Milliliter-Tube vor. Filtern Sie die DPBS-Lösung vor jedem Gebrauch durch einen 2-Mikrometer-Filter. Danach löse 150 Mikroliter lyophilisiertes Huntingtin-Exon, einen von 12 Mikrolitern reiner Trifluoressigsäure in einem 1,5-Millimeter-Röhrchen auf.Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Trifluoressigsäure in einem Abzug mit einem Strom von Stickstoff oder Argon vorsichtig verdampft. Das disaggregierte Protein wird in einem Milliliter vorgekühltem DPBS aufgelöst und der pH-Wert mit einem molaren Natriumhydroxid zwischen 7,2 und 7,4 eingestellt. Filtrieren Sie dann die Proteinlösung durch einen 100-Kilodalton-Zentrifugalafilter in 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen.Bestimmen Sie die Konzentration von Huntingtin Exon One unter Verwendung einer UPLC-Kalibrierungskurve, die auf der Aminosäureanalyse basiert. Berechnen Sie dann die Menge an DPBS, die hinzugefügt werden muss, um eine Konzentration von drei-mikromolarem Huntingtin-Exon eins zu erhalten. Verdünnen Sie das Protein auf drei Mikromolare, indem Sie die berechnete Menge an DPBS in das Reagenzglas geben.Halten Sie das Röhrchen bis zum Beginn des Aggregationsprotokolls auf Eis. Die Validierung durch Elektromikroskopie und andere Techniken muss durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass das Disaggregationsprotokoll erfolgreich bei der Entfernung aller vorgeformten Aggregate war. Die vollständige Aminosäuresequenz des exprimierten Fusionsproteins ist hier dargestellt.Ein Schema des Plasmids und des exprimierten Fusionsproteins ist hier dargestellt. His-SUMO Huntingtin Exon eins exprimiert auf einem mittleren Niveau, und der größte Teil des Fusionsproteins ist in der löslichen Fraktion nach der Lyse vorhanden, sowohl für die 23-Glutamin- als auch für die 43-Glutamin-Variante. Sowohl das Wildtyp- als auch das mutierte Fusionsprotein können durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie auf eine Reinheit von etwa 80 % angereichert werden.Hier sind die Spaltung des His-SUMO-Tags und die Reinigung von Huntingtin Exon eins zu sehen. Der ursprüngliche Fusionsprotein-Peak wird verbraucht und es erscheinen zwei neue und gut getrennte Peaks, die dem His-SUMO-Tag und dem Huntingtin-Exon entsprechen. Sowohl das Huntingtin-Exon-eins, 23 Glutamine als auch 43 Glutamine können durch Umkehrphasen-HPLC vom His-SUMO-Tag getrennt werden und wurden in hoher Reinheit erhalten, wie durch UPLC-, MS- und SDS-PAGE-Analysen gezeigt wurde.Die Aggregationskinetik der m-Huntingtin-Exon-Ein-Fibrillenbildung, die durch einen Sedimentationsassay bestimmt wurde, zeigt eine vollständige Depletion des löslichen Proteins nach 48 Stunden Inkubation. Die CD-Spektroskopie der Sekundärstruktur des Proteins zeigt eine Verschiebung des Huntingtin-Exons 1 43 Glutamins von unstrukturierter zu beta-faltblattreicher Konformation. Diese strukturelle Veränderung geht einher mit der Bildung von langen fibrillären Aggregaten, wie sie von TEM beobachtet werden.Einmal gemeistert, kann diese Methode zur Expression und Reinigung von Huntingtin Exon One in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass Huntingtin-Exon-One-Proteine, insbesondere Proteine mit erweiterter Polyglutamin-Dehnung, eine sehr hohe Neigung zur Aggregation haben. Dank dieser Methode sind wir in der Lage, ausreichend Huntingtin Exon one Proteine herzustellen und bisher unzugängliche Studien durchzuführen, um die Struktur, Aggregation und Toxizität des Proteins zu untersuchen und neue Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung der krankheitsassoziierten Form von Huntingtin Exon One zu entwickeln.Die Stabilität und hohe Löslichkeit des SUMO-Fusionsproteins ermöglicht eine größere Flexibilität bei der Manipulation des Proteins und ermöglicht die Einführung von Modifikationen im Zusammenhang mit den Fusionsproteinen, die sonst nach der Spaltung nicht möglich wären. Wir hoffen, dass die Einfachheit und Effizienz dieser Methode die Verwendung nicht-nativer Sequenzen und Modellsysteme überflüssig macht und Forscher aus verschiedenen Disziplinen dazu ermutigen wird, sich unserem Bestreben anzuschließen, die Biologie dieses wichtigen Proteins zu verstehen und wirksame Therapeutika für die Behandlung der Huntington-Krankheit zu entwickeln.

generation-native-untagged-huntingtin-exon1-monomer-fibrils-using

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

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SUMO ist ein essentielles und hoch konserviertes, kleines, ubiquitin-ähnliches Modifikatorprotein. In diesem Protokoll beschreiben wir die Verwendung eines stresstoleranten rekombinanten, rekombinanten SUMO-Fantifen-Proteins (kmUTAG) zur Visualisierung von nativen, nicht markierten SUMO-Konjugaten und deren Lokalisierung in einer Vielzahl von Zelltypen.

Lokalisierung von SUMO-modifizierten Proteinen mit fluoreszierenden Sumo-Fallen Proteinen

Das Ziel dieses Artikels ist es, die Schritte zu skizzieren, die für die Herstellung von Fibrillen aus monomem Alpha-Synuclein, anschließende Qualitätskontrolle und die Verwendung der vorgeformten Fibrillen in vivo erforderlich sind.

Generation von Alpha-Synuclein vorgeformten Fibrillen aus Monomers und Einsatz In Vivo

Dieses Protokoll beschreibt die Umwandlung von Hautfibroblasten in Myoblasten und deren Differenzierung in Myotuben. Die Zelllinien stammen von Patienten mit neuromuskulären Störungen und können zur Untersuchung pathologischer Mechanismen und zur Erprobung therapeutischer Strategien verwendet werden.

Direkte Umprogrammierung menschlicher Fibroblasten in Myoblasten zur Untersuchung von Therapien für neuromuskuläre Störungen

Wir bieten skalierbare Protokolle, die das Konstruktdesign, die transiente Transfektion sowie die Expression und Reinigung von humanen Huntingtin-Proteinvarianten in voller Länge in HEK293-Zellen abdecken.

Effiziente und skalierbare Produktion von humanen Huntingtin-Varianten in voller Länge in Säugetierzellen unter Verwendung eines transienten Expressionssystems

Wir beschreiben hier eine Methode zur Identifizierung von kleinen Molekül-bindenden Proteinen mittels Photoaffinitätsmarkierung. Der Vorteil dieser Technik besteht darin, dass die Bindung und kovalente Markierung der Zielproteine in der lebenden zellulären Umgebung erfolgt, wodurch das Risiko einer Störung der nativen Proteinstruktur und der Bindungsbedingungen bei der Zelllyse ausgeschlossen wird.

Identifizierung von kleinen Molekülen-bindende Proteine ​​in nativer zellulären Umgebung von lebenden Zellen Photoaffinitatsmarkierung

Erfahren Sie eine robuste Methode zur Herstellung nativer, markierungsfreier Huntingtin-Exon-1-Monomere und -Fibrillen mittels SUMO-Fusionsstrategie. Dieses Protokoll ermöglicht reproduzierbare strukturelle und funktionelle Studien.

Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

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