Erzeugung von nativen, unmarkierten Huntingtin Exon1 Monomer und Fibrillen mit einem SUMO-Fusion-Strategie

Diese Methode ermöglicht es uns, ein tag-freies Exon herzustellen, das die native Sequenz des Proteins trägt, und bietet neue Möglichkeiten, die Strukturfunktion dieses Proteins zu untersuchen und so seine Funktion bei Gesundheit und Krankheit zu verstehen. Die Hauptvorteile hierbei sind die Einfachheit, Effizienz und Robustheit der Methode. Durch die Eliminierung der Heterogenität der Sequenz ermöglicht und erleichtert diese Methode den Vergleich und die Reproduzierbarkeit über verschiedene Labore hinweg.

Obwohl diese Methode für die Herstellung von Huntingtin-Exon-Ton entwickelt wurde, kann sie auch auf andere aggregationsanfällige Systeme wie Amyloid-Beta-Peptid und Alpha-Synuclein angewendet werden. Zuerst wird ein zuvor isolierter Überstand, der das His-SUMO-Huntingtin-Exon-on-Fusionsprotein enthält, mit einem 0,45-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter filtriert. Entnehmen Sie eine 20-Mikroliter-Probe des gefilterten Überstands für die SDS-PAGE-Analyse.

Füllen Sie das geklärte Lysat in einen Superloop. Isolierung des His-SUMO-Huntingtin-Exon-Eins-Fusionsproteins aus dem geklärten bakteriellen Lysat durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie auf einem Hochleistungsflüssigkeitschromatographiesystem bei vier Grad Celsius. 10 Säulenvolumina oder 200 Milliliter Puffer A mit 10 Millilitern pro Minute passieren, um die ungebundenen Proteine auszuwaschen.

Eluieren Sie das Fusionsprotein mit 2,5 Säulenvolumina oder 50 Millilitern 100%Puffer B bei zwei Millilitern pro Minute. Entnehmen Sie 20 Mikroliter jeder Fraktion für die SDS-PAGE-Analyse. Geben Sie 20 Mikroliter Ladefarbstoff zu jeder Probe.

Laden Sie zwei Mikroliter des Rohproteins, die ungebundene Fraktion, die Waschfraktion und jede Fraktion des Elutionspeaks auf ein 15%iges Gel. Lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 180 Volt laufen. Wenn der Lauf beendet ist, färben Sie das Gel mit Coomassie-Farbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Die Fraktionen, die das Fusionsprotein enthalten, werden entsprechend dem Peak des Chromatogramms zusammengefasst. Geben Sie dann 100 millimolare DTT und 100 millimolare L-Cystein zu den gepoolten Fraktionen und lösen Sie sie durch vorsichtiges Umdrehen des Röhrchens auf. Um Lösungsmittel A für die HPLC-Reinigung vorzubereiten, geben Sie zwei Milliliter Trifluoressigsäure in eine Zwei-Liter-Flasche Wasser.

Zur Herstellung von Lösungsmittel B geben Sie 2,5 Milliliter Trifluoressigsäure in eine 2,5-Liter-Flasche Acetonitril. Bereiten Sie das HPLC-System wie vom Hersteller empfohlen vor. Führen Sie einen leeren Lauf durch, um eine saubere Spalte zu gewährleisten.

Anschließend werden 100 Mikroliter des Fusionsproteins vor der Zugabe von ULP1 eingenommen, um die Spaltreaktion durch UPLC zu überwachen. Übertragen Sie 20 Milliliter des Fusionsproteins in ein neues 50-Milliliter-Röhrchen und fügen Sie 0,4 Milliliter ULP1-Stammlösung hinzu. Inkubieren Sie die Probe auf Eis und bewahren Sie das verbleibende Fusionsprotein auf Eis auf.

Lagern Sie das Protein nicht während der Zwischenschritte und fahren Sie mit der Reinigung bis zum Abschluss fort. Entfernen Sie alle 10 Minuten 100 Mikroliter der Spaltungsreaktion, um den Fortschritt der UPLC zu überwachen. Nach dem Zentrifugieren der Proben werden zwei Mikroliter jedes Überstands mittels UPLC analysiert.

Vergleichen Sie die Chromatogramme, die für die Probe vor der Zugabe von ULP1 erhalten wurden, mit den Proben, die danach entnommen wurden. Sobald die SUMO-Spaltung abgeschlossen ist, filtrieren Sie die Probe mit einem 22-Mikrometer-Spritzenvorsatzfilter. Als nächstes reinigen Sie die gefilterte Probe durch Umkehrphasen-HPLC.

Analysieren Sie die HPLC-Fraktionen mittels UPLC und ESI-MS. Pools von Fraktionen ähnlicher Reinheit in 50-Milliliter-Kunststoffröhrchen. Frieren Sie die Proben in flüssigem Stickstoff ein und lyophilisieren Sie sie.

Dann wird das lyophilisierte Protein in zwei Milliliter große Plastikröhrchen umgefüllt und bei minus 20 Grad Celsius gelagert. Löse 100 Mikrogramm lyophilisiertes Huntingtin-Exon, einen von acht Mikrolitern reiner Trifluoressigsäure in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen auf. Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Trifluoressigsäure vorsichtig unter einem Abzug mit einem Strom von Stickstoff oder Argon verdampft.

Sobald das Protein trocken ist, lösen Sie es in 100 Mikrolitern Wasser auf. Analysieren Sie dann zwei Mikroliter Probe mit UPLC. Mischen Sie nun 20 Mikroliter Proteinlösung mit 20 Mikrolitern 2X Ladefarbstoff.

Analysieren Sie Proteinproben von einem bis 10 Mikrogramm mit SDS-PAGE. Lassen Sie das Gel 90 Minuten lang bei 180 Volt laufen. Wenn der Lauf beendet ist, färben Sie das Gel mit Coomassie-Farbstoff gemäß den Anweisungen des Herstellers.

Bereiten Sie 10 Milliliter DPBS in einer 50-Milliliter-Tube vor. Filtern Sie die DPBS-Lösung vor jedem Gebrauch durch einen 2-Mikrometer-Filter. Danach löse 150 Mikroliter lyophilisiertes Huntingtin-Exon, einen von 12 Mikrolitern reiner Trifluoressigsäure in einem 1,5-Millimeter-Röhrchen auf.

Nach einer 20-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wird die Trifluoressigsäure in einem Abzug mit einem Strom von Stickstoff oder Argon vorsichtig verdampft. Das disaggregierte Protein wird in einem Milliliter vorgekühltem DPBS aufgelöst und der pH-Wert mit einem molaren Natriumhydroxid zwischen 7,2 und 7,4 eingestellt. Filtrieren Sie dann die Proteinlösung durch einen 100-Kilodalton-Zentrifugalafilter in 1,5-Milliliter-Kunststoffröhrchen.

Bestimmen Sie die Konzentration von Huntingtin Exon One unter Verwendung einer UPLC-Kalibrierungskurve, die auf der Aminosäureanalyse basiert. Berechnen Sie dann die Menge an DPBS, die hinzugefügt werden muss, um eine Konzentration von drei-mikromolarem Huntingtin-Exon eins zu erhalten. Verdünnen Sie das Protein auf drei Mikromolare, indem Sie die berechnete Menge an DPBS in das Reagenzglas geben.

Halten Sie das Röhrchen bis zum Beginn des Aggregationsprotokolls auf Eis. Die Validierung durch Elektromikroskopie und andere Techniken muss durchgeführt werden, um zu bestätigen, dass das Disaggregationsprotokoll erfolgreich bei der Entfernung aller vorgeformten Aggregate war. Die vollständige Aminosäuresequenz des exprimierten Fusionsproteins ist hier dargestellt.

Ein Schema des Plasmids und des exprimierten Fusionsproteins ist hier dargestellt. His-SUMO Huntingtin Exon eins exprimiert auf einem mittleren Niveau, und der größte Teil des Fusionsproteins ist in der löslichen Fraktion nach der Lyse vorhanden, sowohl für die 23-Glutamin- als auch für die 43-Glutamin-Variante. Sowohl das Wildtyp- als auch das mutierte Fusionsprotein können durch immobilisierte Metallaffinitätschromatographie auf eine Reinheit von etwa 80 % angereichert werden.

Hier sind die Spaltung des His-SUMO-Tags und die Reinigung von Huntingtin Exon eins zu sehen. Der ursprüngliche Fusionsprotein-Peak wird verbraucht und es erscheinen zwei neue und gut getrennte Peaks, die dem His-SUMO-Tag und dem Huntingtin-Exon entsprechen. Sowohl das Huntingtin-Exon-eins, 23 Glutamine als auch 43 Glutamine können durch Umkehrphasen-HPLC vom His-SUMO-Tag getrennt werden und wurden in hoher Reinheit erhalten, wie durch UPLC-, MS- und SDS-PAGE-Analysen gezeigt wurde.

Die Aggregationskinetik der m-Huntingtin-Exon-Ein-Fibrillenbildung, die durch einen Sedimentationsassay bestimmt wurde, zeigt eine vollständige Depletion des löslichen Proteins nach 48 Stunden Inkubation. Die CD-Spektroskopie der Sekundärstruktur des Proteins zeigt eine Verschiebung des Huntingtin-Exons 1 43 Glutamins von unstrukturierter zu beta-faltblattreicher Konformation. Diese strukturelle Veränderung geht einher mit der Bildung von langen fibrillären Aggregaten, wie sie von TEM beobachtet werden.

Einmal gemeistert, kann diese Methode zur Expression und Reinigung von Huntingtin Exon One in drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es sehr wichtig, sich daran zu erinnern, dass Huntingtin-Exon-One-Proteine, insbesondere Proteine mit erweiterter Polyglutamin-Dehnung, eine sehr hohe Neigung zur Aggregation haben. Dank dieser Methode sind wir in der Lage, ausreichend Huntingtin Exon one Proteine herzustellen und bisher unzugängliche Studien durchzuführen, um die Struktur, Aggregation und Toxizität des Proteins zu untersuchen und neue Assays zum Nachweis und zur Quantifizierung der krankheitsassoziierten Form von Huntingtin Exon One zu entwickeln.

Die Stabilität und hohe Löslichkeit des SUMO-Fusionsproteins ermöglicht eine größere Flexibilität bei der Manipulation des Proteins und ermöglicht die Einführung von Modifikationen im Zusammenhang mit den Fusionsproteinen, die sonst nach der Spaltung nicht möglich wären. Wir hoffen, dass die Einfachheit und Effizienz dieser Methode die Verwendung nicht-nativer Sequenzen und Modellsysteme überflüssig macht und Forscher aus verschiedenen Disziplinen dazu ermutigen wird, sich unserem Bestreben anzuschließen, die Biologie dieses wichtigen Proteins zu verstehen und wirksame Therapeutika für die Behandlung der Huntington-Krankheit zu entwickeln.