Retroductal Nanopartikel Injektion an der murinen mandibulären Drüse

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Nanomaterialien direkt in die submandibuläre Drüse der Maus zu verabreichen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine direkte Abgabe von Verbindungen an die Unterkieferdrüse unter Umgehung des systemischen Kreislaufs erreicht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie der Speicheldrüsenfunktionsstörung nach einer Strahlenbehandlung bei Malignomen des Kopfes und Halses.

Im Allgemeinen können Individuen, die mit dieser Methode noch nicht vertraut sind, durch die Lokalisierung und Kanülierung des Ductus submandibularis herausgefordert werden, während das Tier sediert wird. Um diesen Vorgang zu beginnen, schneiden Sie drei Zentimeter eines 32-Gauge-Hirnkatheterschlauchs mit eingesetztem Draht ab, um ein abgeschrägtes Ende von etwa 45 Grad zur Längsachse zu bilden. Vergewissern Sie sich, dass der Draht mindestens einen Zentimeter länger ist als der Schlauch.

Das Schaffen einer abgeschrägten Kante am Schlauch erleichtert die Kanülenbildung. Wenn der Schlauch während des Eingriffs verbogen wird, sollte eine frische abgeschrägte Kante geschnitten werden. Laden Sie anschließend 50 Mikroliter PSMA-Nanopartikellösung oder anderes Injektionsmaterial in eine Hamilton-Spritze.

Um die Wahrscheinlichkeit eines Höhlentraumas während der Injektion zu verringern, befestigen Sie den Katheterschlauch an der Spritze und stoßen Sie das Totvolumen aus. Untersuchen Sie die Injektionslösung, um sicherzustellen, dass das Nanopartikel vollständig solvatisiert ist, um eine duktale Obstruktion zu vermeiden. Bereiten Sie dann Atropinlösung mit 0,1 Milligramm pro Milliliter vor.

Um den duktalen Eintrittspunkt zu visualisieren, platzieren Sie eine anästhesierte Maus in Bauchlage auf einer benutzerdefinierten Bühne. Tragen Sie dann Salbe auf die Augen auf, um Trockenheit während des Eingriffs zu vermeiden. Befestigen Sie anschließend die Schneidezähne des Oberkiefers über einem Metallbalken und üben Sie mit einem Gummiband eine Spannung nach unten hinter den Unterkieferschneidezähnen aus.

Richten Sie die Maus unter dem Präpariermikroskop aus, um die Basis des Kiefers sichtbar zu machen. Um das Maul zu erweitern, verwenden Sie einen speziell gebogenen Stahlretraktor, um die Wangenschleimhaut bilateral zu spannen. Um die submandibuläre Papille sichtbar zu machen, greifen Sie die Zunge und heben Sie sie mit einer stumpfen Pinzette vorsichtig vom Mundboden an.

Legen Sie ein Stück Watte zwischen die Zunge und die Wangenschleimhaut, um eine weitere Manipulation in der Mundhöhle zu ermöglichen. Um eine duktale Kanülierung und Leitungsplatzierung durchzuführen, fassen Sie den Katheterschlauch mit einem Drahteinsatz an. Für eine optimale manuelle Kontrolle während der Kanülierung richten Sie den Schlauch an der Krümmung der Pinzette aus.

Bewegen Sie mit dem Präpariermikroskop die Pinzette und den Draht in das Sichtfeld. Üben Sie mit dem Drahteinsatz vorsichtig Druck auf die Basis einer submandibulären Papille aus, um eine kleine oberflächliche Schleimhautpunktion zu erzeugen, die den späteren Eintritt in den Katheterschlauch erleichtert. Wenn Sie auf Widerstand stoßen, schneiden Sie mit einer scharfen Präparierschere frische, abgeschrägte Spitzen sowohl am Schlauch als auch am Drahteinsatz ab.

Nach dem Eintritt ziehen Sie das Mandrin zurück und bestätigen dann mit dem Präpariermikroskop das Vorhandensein von Speichel an der Einstichstelle. Ziehen Sie anschließend das Mandrin weiter in den Schlauch ein. Vermeiden Sie gewaltsame oder plötzliche Bewegungen des Mandrettes, die zu Blutungen führen oder die Integrität der Ductus beeinträchtigen können.

Um sicherzustellen, dass der Injektionsschlauch in die Kanalöffnung des Wharton passt, führen Sie den Schlauch, der das Mandrin als starre Führung enthält, in die zuvor vorgenommene Punktion ein. Um zu verhindern, dass der Gegendruck zu einer duktalen Obstruktion führt, ziehen Sie den Schlauch zurück. Achten Sie unter dem Mikroskop darauf, dass eine Öffnung in der submandibulären Papille zu sehen ist.

Wenn sichtbare Blutungen auftreten, entfernen Sie das Mandrin und wiederholen Sie die Eingriffe an der gegenüberliegenden submandibulären Papille. Verabreichen Sie anschließend ohne Bewegung der Maus intraperitoneal ein Milligramm pro Kilogramm Atropinlösung, um die Erhöhung während des Eingriffs zu reduzieren. Warten Sie dann fünf bis 10 Minuten.

Führen Sie unter dem Präpariermikroskop den Spritzenschlauch in die Öffnung ein. Wenn Sie auf Widerstand stoßen, schneiden Sie ein frisches, abgeschrägtes Ende am Schlauch ab und versuchen Sie es erneut. Sobald der Schlauch in der submandibulären Papille sitzt, schieben Sie ihn langsam drei bis fünf Millimeter in den Kanal vor.

Lösen Sie dann den Schlauch von der Pinzette. Um die Abdichtung zwischen dem Schlauch und der submandibulären Papille zu verbessern, trocknen Sie die Grenzfläche, indem Sie sie eine Minute lang vorsichtig mit Gaze abtupfen. Überprüfen Sie, ob sich die Position des Schlauchs während des Trocknens nicht verschoben hat.

Bei diesem Verfahren injizieren Sie das Material mit einer Geschwindigkeit von 10 Mikrolitern pro Minute. Stellen Sie sicher, dass die Maus sediert bleibt und keine Anzeichen von Stress zeigt. Halten Sie nach der Injektion den Spritzendruck fünf Minuten lang aufrecht, um die Materialretention im Wharton-Kanal und in der Unterkieferdrüse zu verbessern.

Untersuchen Sie die submandibuläre Papille regelmäßig, um sicherzustellen, dass der Schlauch nicht aus der duktalen Öffnung austritt. Die Aufrechterhaltung des Injektionsdrucks erhöht die Wirksamkeit der retroduktalen Verabreichung. Mit einer feinen Pinzette den Schlauch aus der Unterkieferpapille greifen und vorsichtig herausziehen.

Entfernen Sie den Retraktor und die Watte aus der Mundhöhle, bevor Sie die Maus vom Tisch wegbewegen. Um die Verabreichung von Nanopartikeln zu verifizieren, zeigt das In-vivo-Bildgebungssystem eine Stunde nach der Injektion die Lateralisierung des roten Fluoreszenzsignals auf die behandelte Seite der Maus. Und dieses Bild zeigt, dass das Nanopartikelsignal 24 Stunden nach der Injektion deutlich abgenommen hat.

Um die Persistenz der Nanopartikel in den Unterkieferdrüsen 24 Stunden nach der Injektion zu bestätigen, wurden sie geschnitten und durch Fluoreszenzbildgebung betrachtet. Hier sind die nicht injizierten Kontrolldrüsen submandibulärer Drüsen zu sehen, die mit Aquaporin 5 und Keritin fünf gefärbt sind und die sekretorischen Acini- bzw. Ductalzellen markieren. In retroduktalen Nanopartikeln, die submandibuläre Drüsen injiziert werden, zeigen Aquaporin-Fünf- und Keritin-Fünf-Färbungen eine normale Drüsenmorphologie und Nanopartikel, die sowohl in den Acini als auch in den Gängen aufgenommen werden.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in 20 Minuten durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, Fremdbewegungen zu vermeiden, die die Kanüle lösen oder die Abdichtung zwischen dem Schlauch und der submandibulären Papille stören könnten. Im Anschluss an das Verfahren können weitere Methoden wie Immunfärbung, RNA-Extraktion oder Durchflusszytometrie durchgeführt werden, um die Genexpression oder die Lokalisierung von Nanomaterialien in der Unterkieferdrüse zu bewerten.

Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Speicheldrüsenforscher, um Verbindungen zur Xerostomieprävention zu untersuchen und zu testen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Nanomaterialien direkt an die submandibuläre Drüse der Maus durch Kanülierung des Wharton-Kanals verabreicht werden.