Bewertung von vaskulären Hyperpermeability-induzierende Wirkstoffe in der Haut mit dem Meilen-Assay

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, die vaskuläre Leckage in der Mausdermis zu messen, die durch die intradermale Injektion von permeabilitätsfördernden Mitteln induziert wird. Dieses Verfahren kann dazu beitragen, wichtige Fragen zur Regulation der Gefäßpermeabilität in vivo zu beantworten, z. B. welche Moleküle die Gefäßleckage stimulieren oder hemmen können und welche Signalwege daran beteiligt sind. Der Hauptvorteil dieses Verfahrens besteht darin, dass es schnell und relativ einfach ist und meist gängige Laborreagenzien und -materialien verwendet werden.

Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Krankheiten mit pathologischen Ödemen. Insbesondere können Forscher diesen Assay nutzen, um neuartige molekulare Ziele zu identifizieren und relevante Medikamente relativ schnell und einfach auf ihre Fähigkeit zu testen, die Gefäßpermeabilität zu hemmen. Bereiten Sie separate Lösungen des Histamininhibitors Pyrilaminmaleat und des Evans Blue Farbstoffs in 0,9%iger Kochsalzlösung vor.

Arbeiten Sie dann in einem Laminar-Flow-Schrank und sterilisieren Sie die Lösungen, indem Sie sie durch einen 0,22-Mikrometer-Filter passieren. Laden Sie die beiden Lösungen in separate Ein-Milliliter-Spritzen, die mit 30-Gauge-Nadeln ausgestattet sind. Als nächstes zerlegen Sie die Maus.

Neigen Sie dann die Maus so, dass der Kopf zum Boden und der Bauch nach oben gerichtet ist. Nachdem die Maus positioniert ist, verabreichen Sie 10 Mikroliter pro Gramm Körpergewicht Pyrilaminmaleatlösung durch intraperitoneale Injektion. Um die Vasodilatation zu fördern, legen Sie die Maus anschließend 10 Minuten lang in eine Wärmekammer bei 37 Grad Celsius.

Bewegen Sie dann die Maus zu einer Maussperre. Reiben Sie anschließend den Schwanz mit 70% Ethanol ein, um eine weitere Vasodilatation zu erzielen. Verabreichen Sie 100 Mikroliter Evans Blue Dye Lösung intravenös durch die Schwanzvene.

Um Blutungen zu vermeiden, halten Sie den Schwanz schnell zwischen einem Finger und dem Daumen und üben Sie Druck auf die Injektionsstelle aus. Die intravenöse Injektion von Evans Blue Dye in die Schwanzvene der Maus ist ein schwieriger und kritischer Schritt innerhalb dieses Verfahrens. Dementsprechend ist es wichtig, dass die Forscher in der Lage sind, diese Injektion durchzuführen, bevor sie mit dem Rest des Verfahrens fortfahren.

Die Feststellung der Kompetenz erfordert vorherige Übung. Verwenden Sie sterile Lösungen von phosphatgepufferter Kochsalzlösung, um das VEGF-Reagenz so zu verdünnen, dass das endgültige Volumen der Dosis 20 Mikroliter beträgt. Laden Sie dann das VEGF-Reagenz zur Induktion der Permeabilität und die Fahrzeugsteuerung in zwei separate 300-Mikroliter-Spritzen, die mit 31-Gauge-Nadeln ausgestattet sind.

Halten Sie die Nadel in einem Winkel von 15 Grad zur Haut und injizieren Sie 20 Mikroliter VEGF intradermal in die Mausflanke. Lokalisieren Sie eine erhabene Blase in der Haut, um die erfolgreiche Injektion zu bestätigen. Führen Sie intradermale Injektionen an zwei weiteren Stellen durch, die mindestens einen Zentimeter voneinander entfernt sind.

Drehen Sie dann die Maus, um die zweite Flanke freizulegen, und wiederholen Sie die dreifache Injektion mit der Vehikellösung. Führen Sie ein Protokoll für jede der Injektionsstellen auf Papier und den Zeitpunkt, zu dem das Injektionsverfahren beendet ist. Bringen Sie dann die Maus in den heimischen Käfig.

Überwachen Sie die Maus weiter, bis sie wieder zu Bewusstsein kommt und sich im Käfig zu bewegen beginnt. Lassen Sie die VEGF-Lösung 20 Minuten einwirken, bevor Sie die Maus aufrufen. In diesem Stadium injizieren Sie nacheinander VEGFA und Vehikel in alle Mäuse nach dem gleichen Verfahren.

Positionieren Sie nach 20 Minuten jede eingeschläferte Maus auf dem Rücken und stecken Sie ihre Füße auf eine mit einem sauberen Taschentuch umwickelte Pinnwand. Als nächstes machst du mit Hilfe einer stumpfen Schere einen drei bis vier Zentimeter langen vertikalen Schnitt vom Unterbauch bis zur Brust der toten Maus. Dann mit Pinzette und Skalpell die Haut von beiden Seiten der Flanke toupieren.

Verwenden Sie das Skalpell, um Fett zu entfernen, das sich in den Bereichen um die Leckstelle befindet. Verwenden Sie dann die Pinzette und das Skalpell, um die Hautregionen mit ausgelaufenem Evans Blue Dye zu entfernen. Herausgeschnittene Hautregionen müssen ähnlich groß sein.

Füllen Sie die Hautproben in 1,5-Milliliter-Röhrchen um und beschriften Sie entsprechend. Trocknen Sie die Probe, indem Sie das offene Röhrchen über Nacht in einen Heizblock legen. Nachdem die Trocknung abgeschlossen ist, geben Sie 250 Mikroliter deionisiertes Formamid in einen Abzug zu der Probe.

Schließen Sie den Deckel der Tube und legen Sie sie über Nacht in einen Wärmeblock, um den Evans-Farbstoff zu extrahieren. Zentrifugieren Sie die Proben bei 10.000 g oder mehr für 40 Minuten in einer Tischzentrifuge. Nach der Zentrifugation werden 100 Mikroliter jedes farbstoffhaltigen Überstands aus der zentrifugierten Probe in die Vertiefungen einer 96-Well-Platte überführt, die in einem Abzug betrieben wird.

Lesen Sie die Evans-Blue-Extinktion mit einem Spektralphotometer ab. Um die durch VEGF induzierte Gefäßleckage zu untersuchen, werden der Maus 50 Nanogramm VEGFA in phosphatgepufferte Kochsalzlösung oder nur phosphatgepufferte Kochsalzlösung als Vehikel injiziert. Das Bild zeigt eine Zunahme der Akkumulation von ausgetretenem Evans Blue Farbstoff in den Hautproben, die mit VEGFA injiziert wurden, im Vergleich zur Fahrzeugkontrolle vor Ort.

Dieses 96-Well-Plattenbild zeigt den beladenen Evans Blue Farbstoff, der in Formamid aus der Hautprobe extrahiert wurde. Dieses grafische Diagramm zeigt die normierten Absorptionswerte von gepaarten VEGFA- und reinen Fahrzeug-Kontrollproben. Die Grafik zeigt, dass die Injektion von 50 Nanogramm VEGFA die Leckage von Evans Dye im Vergleich zum reinen Fahrzeug signifikant erhöht.

Diese Grafik erhält die Quantifizierung der Faltenänderungen in der optischen Dichte für die VEGFA im Vergleich zu den Fahrzeugproben. Das Diagramm zeigt eine durchschnittliche dreifache Zunahme der Gefäßleckage nach Verabreichung von VEGFA im Vergleich zu einer reinen Vehikeltherapie. Einmal gemeistert, kann der Hauptteil dieser Technik in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig, die erregerinduzierte Gefäßleckage auf die Vehikel-induzierte Gefäßleckage zu normalisieren, um unspezifische Gefäßleckagen und Variationen zwischen Mäusen zu berücksichtigen. Dieses Verfahren kann mit anderen Methoden, wie z.B. der Medikamentenverabreichung, kombiniert werden, um Fragen zu beantworten, z. B. ob ein Protein gezielt die Gefäßpermeabilität hemmen kann. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Gefäßbiologie, um die molekularen Mechanismen der vaskulären Hyperpermeabilität bei genetisch veränderten Mäusen zu erforschen und Schlüsselsignalkomponenten zu identifizieren, die für die Gefäßleckage erforderlich sind.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Gefäßleckagen in der Mausdermis induziert und misst.