Ein kleines Tier Modell der Ex Vivo Normothermic Leber Perfusion

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Transplantation und Organkonservierung zu beantworten. Zu den Anwendungen dieser Methode gehören das Testen neuartiger Perfusate und Perfusatadditive, das Testen von Software für die Organbewertung und das Durchführen von Experimenten zur Reparatur von Organen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das hier vorgestellte normotherme ex vivo Leberperfusionsmodell einfach, leicht replizierbar, kostengünstig und vielseitig einsetzbar ist.

Beginnen Sie mit der Vorbereitung der 16-Gauge-Portalmanschette. Schneiden Sie einen fünf Millimeter dicken Schlauchabschnitt ab und bestimmen Sie den Mittelpunkt des Abschnitts, indem Sie 2,5 Millimeter messen. In der Mitte einschneiden und die vordere Hälfte des Schlauchs entfernen.

Verwenden Sie ein Blutstillungsmittel, um diesen jetzt flachen Teil zu zerdrücken. Verwende ein Feuerzeug, um das andere Ende des Angiokatheters zu schmelzen, um eine Lippe zu erzeugen. Bereiten Sie als Nächstes die Gallengangskanüle vor, indem Sie die Injektionsöffnung von einem 27-Gauge-Angiokatheter abschneiden, so dass nur der Katheter übrig bleibt.

Verbinden Sie dies mit einem 10 Zentimeter langen Abschnitt eines 27-Gauge-Kanülenschlauchs. Positionieren Sie eine anästhesierte Ratte mit der Nase im Narkose-Nasenkegel und ihren vier Extremitäten ruhiggestellt. Überwachen Sie die Vitalparameter, indem Sie den Monitor an der linken hinteren Extremität befestigen.

Führen Sie eine Zehenkneifung durch, um die angemessene Anästhesietiefe zu bestätigen. Besprühen Sie den Bauch des Tieres mit 70%igem Isopropylalkohol und lassen Sie ihn trocknen. Legen Sie ein steriles Tuch über das Tier.

Nachdem Sie mit einer scharfen Schere einen Schnitt in der Mittellinie vom Xiphoid zum Schambein vorgenommen haben, dringen Sie vorsichtig in das Peritoneum ein und schneiden Sie den Muskel ein. Verlängern Sie den Schnitt seitlich nach links und rechts, so dass ein Kreuz auf Höhe des unteren Leberrandes entsteht. Drehen Sie zu diesem Zeitpunkt die Isofluran-Anästhesie auf 2% herunterZiehen Sie den Xiphoid-Prozess mit einer gebogenen Mückenklemme und die Rippen mit Rippenretraktoren zurück.

Schneiden Sie dann mit einer scharfen Schere die falciformen, phrenen und gastrohepatischen Bänder ab. Lokalisieren und binden Sie die Vena phrenica mit einer 7-0-Naht so nah wie möglich an ihrem Ursprung ab, um ein Auslaufen zu verhindern. Verwenden Sie als Nächstes einen sterilen, angefeuchteten Applikator mit Wattespitze, um die Ratte auszuweiden.

Wickeln Sie den Darm in Gaze, die mit 0,9 % normaler Kochsalzlösung angefeuchtet ist, und achten Sie darauf, dass das Gefäßsystem nicht gedehnt wird. Präparieren Sie dann über die untere Hohlvene, um überschüssiges Gewebe zu entfernen. Präparieren Sie hinter der IVC knapp oberhalb der Bifurkation und führen Sie eine Schlaufe aus einer 4-O-Seidennaht für die spätere Verwendung ein.

Als nächstes ziehen Sie die rechte Niere zurück, um die rechte Nebennierenvene freizulegen, und ziehen Sie den rechten Leberlappen mit Gaze superior zurück. Binden Sie die rechte Nebennierenvene mit einer 7-0-Seidennaht so nah wie möglich an der IVC ab und kauterisieren Sie sie distal der Krawatte. Präpariere dann vorsichtig die Milzvene.

Binden Sie die Nähte mit zwei 7-0 Seidennähten ab und schneiden Sie sie zwischen den beiden Nähten durch. Nachdem Sie die Arteria gastroduodenalis präpariert haben, binden Sie die Arteria gastroduodenalis mit einer 7-0-Seidennaht ab und ligate ligate. Präparieren Sie dann um die Leberarterie herum und legen Sie locker ein 7-0-Seidennahtband um sie herum.

Als nächstes präparierst du den Gallengang. Überprüfen Sie dann die Länge des Gallengangs, binden Sie ihn am distalen Ende ab und legen Sie eine Nahtschlaufe um den Gallengang und so proximal wie möglich. Schneide mit einer kleinen Schere ein Loch, das halb so groß ist wie der Durchmesser des Kanals, und führe einen 27-Gauge-Katheter proximal in den Gallengang ein.

Binden Sie den Katheter mit einer römischen Sandalennaht fest. Verwenden Sie als Nächstes eine 27-Gauge-Nadel, um 0,5 Milliliter Heparin in die Penialvene oder IVC zu injizieren. Klemmen und binden Sie dann die IVC mit der zuvor platzierten 4-0 Seidennaht ab und binden Sie die Leberarterie mit der zuvor platzierten 7-0 Seidennaht ab.

Verwenden Sie nun einen mikrochirurgischen Clip, um die Pfortader abzuklemmen. Kanülieren Sie die Pfortader mit einem 22-Gauge-Angiokatheter und spülen Sie sie mit 60 Millilitern kalter 0,9%iger normaler Kochsalzlösung mit 100 Einheiten Heparin, bis die Leber blanchiert. Nach dem Spülen der Leber legen Sie die suprahepatische IVC frei und schneiden Sie sie so hoch wie möglich in der Brust durch.

Führen Sie die Hepatektomie durch, indem Sie um das Zwerchfell herum schneiden und dann die Leberarterie, die IVC, die Pfortader und alle zusätzlichen Bänder durchtrennen. Heben Sie die Leber heraus und legen Sie eine eiskalte Kochsalzlösung mit 0,9 % auf. Platzieren Sie zuletzt die 16-Gauge-Gefäßmanschette in der Pfortader und verbinden Sie die Leber mit dem normothermen Ex-vivo-Leberperfusionskreislauf

Vor Beginn jeder Perfusion sollte eine Sichtprüfung des Kreislaufs durchgeführt werden, um Schäden oder Ablagerungen an den Schaltungskomponenten oder Schläuchen zu identifizieren und zu identifizieren. Wenn sich Bakterien oder andere Substanzen im Kreislauf ansammeln, sollten Teile ausgetauscht oder gereinigt werden. Beginnen Sie damit, das Perfusat mit zwei Millilitern pro Minute fließen zu lassen.

Achten Sie auf Spitzen des Pfortaderdrucks, da dies darauf hindeuten kann, dass das Gefäß verschlossen ist und eine Neupositionierung der Kanüle erforderlich macht. Führen Sie die Protalvenenkanüle mit einer 7-0-Seidennaht in die Pfortader mit Manschette ein, um den Rückfluss des Perfusats und der Naht zu gewährleisten. Sobald beide Kanülen an Ort und Stelle sind, beginnen Sie, den Perfusatfluss um einen Milliliter pro Minute zu erhöhen, bis der physiologische Druck im Bereich von 10 bis 16 Zentimetern Wasser erreicht ist.

Entnehmen Sie während der Perfusion eine Milliliterprobe aus dem Pre-Port und dem Post-Port. Teilen Sie jede Milliliterprobe in zwei 0,5-Milliliter-Proben auf. Frieren Sie eines der 0,5-Milliliter-Aliquote in Kryoröhrchen in flüssigem Stickstoff ein und führen Sie eine arterielle Blutgasanalyse mit den restlichen 0,5 Millilitern Perfusat durch.

Messen Sie dann den pH-Wert und puffern Sie das Perfusat nach Bedarf, um wieder auf pH 7,4 zu gelangen. Trennen Sie die Leber nach vier Stunden Perfusion vom Perfusionskreislauf. Teilen Sie die Leber in 0,5-Gramm-Segmente, geben Sie sie in Kryoröhrchen und frieren Sie sie in flüssigem Stickstoff ein.

Die ALT wurde bei null, 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210 und 240 Minuten Perfusion gemessen. Es gibt signifikant weniger ALT in der Basenperfusat plus PEG-CAT-Gruppe im Vergleich zu Basenperfusat, das bei 150, 180, 210 und 240 Minuten schwarz dargestellt ist. Das Gewebe-ATP wurde in der Gruppe mit Basenperfusat plus PEG-CAT im Vergleich zur Gruppe mit Basenperfusat allein aufrechterhalten.

Die MDA-Produktion im Gewebe war in der Basenperfusatgruppe signifikant höher als in der Basenperfusat plus PEG-CAT-Gruppe. Gesamt-GSH wurde in der Base-Perfusat plus PEG-CAT im Vergleich zur Base-Perfusat-Gruppe allein beibehalten. Jede vorgeschlagene Anwendung der normothermen ex vivo Leberperfusion muss methodisch in Tiermodellen getestet werden, bevor sie an verworfenen menschlichen Organen und dann an menschlichen Lebern getestet wird.

Das hier vorgestellte Modell ist ideal, da es leicht replizierbar ist, überflüssige Tests eliminiert und kostengünstig ist. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein kostengünstiges, leicht replizierbares, normothermisches ex vivo Leberperfusionsmodell an Ratten durchführen können.