Nutzung von Ultraschall geführte Gewebe gerichtet zellulären Implantation für die Einrichtung der biologisch relevanten metastasiertem Tumor Xenografts

Ziel dieser Methode ist es, biologisch relevante krebsorthotope Xenotransplantate für präklinische Studien zu etablieren. Vom Patienten stammende Neuroblastomzellen werden durch Ultraschallkontrolle in die Nebenniere der Maus injiziert, ohne dass eine offene Operation oder eine längere Genesung erforderlich ist. Diese Methode kann helfen, kritische Fragen in der Krebsbiologie und in der translationalen Forschung zu beantworten, wie z.B. Studien zur Tumorevolution, zu therapeutischen Reaktionen in der nativen Mikroumgebung und zu Metastasen.

Ein solches Wissen würde die Zuverlässigkeit präklinischer Studien erheblich verbessern und die Wirkstoffforschung erleichtern. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie von Patienten stammend, gewebegerichtet, effizient und zuverlässig bei der Herstellung eines orthotopen xenographischen Modells für die Krebstherapieforschung ist. Die kritischen Schritte des Verfahrens werden von Sahiti Chukkapalli, einem leitenden Techniker und unserer Laborleiterin, zusammen mit Tina Thomas, einer wissenschaftlichen Mitarbeiterin in unserem Labor, demonstriert.

Generieren Sie eine einzelne, vom Patienten stammende Krebszellsuspension aus Tumorgewebe mit einem Tumordissoziationskit. Beginnen Sie damit, etwa ein halbes Gramm Tumorgewebe in eine 100-Millimeter-Zellkulturschale zu übertragen, die fünf Milliliter enzymergänzten RPMI-Puffer enthält. Dann zerkleinern Sie den Tumor mit einer Schere und einer Gewebezange in kleine Stücke von zwei bis vier Millimetern.

Pipettieren Sie das Tumorgemisch in ein Dissoziationsröhrchen und verschließen Sie das Röhrchen. Drehen Sie den Schlauch um, befestigen Sie ihn an der Hülse eines Gewebedissoziators und dissoziieren Sie das Gewebe mit dem entsprechenden Programm. Nach der Dissoziation inkubieren Sie die Tumorzellsuspension auf einem rotierenden Gestell bei 37 Grad Celsius für eine Stunde.

Zerreiben Sie die Zellsuspension während der Inkubation alle 15 Minuten. Nach der Inkubation wird die Zellsuspension in ein neues konisches 50-Milliliter-Röhrchen überführt und 10 Milliliter RPMI hinzugefügt. Zentrifugieren Sie dann die Zellsuspension bei 314 g fünf Minuten lang.

Entfernen Sie nach der Zentrifugation den Überstand und suspendieren Sie das Pellet in fünf Millilitern RPMI. Die Zellsuspension wird durch ein 40-Mikron-Zellsieb geleitet und die abgeseihte Lösung in ein frisches 50-Milliliter-Röhrchen gegeben. Nachdem Sie das Sieb mit fünf Millilitern RPMI-Medium gewaschen haben, zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 314 g fünf Minuten lang, um ein Pellet zu sammeln.

Zählen Sie die Zellen mit einem Hämozytometer. Suspendieren Sie dann das Pellet in RPMI, um eine Endkonzentration von viermal 10 auf die fünf Zellen pro 10 Mikroliter Volumen zu erhalten. Übertragen Sie fünf Mikroliter dieser Zellsuspension pro Injektion in ein frisches Röhrchen und das gleiche Volumen der Basalmembranmatrix, um für jede Injektion 10 Mikroliter Zelllösung herzustellen und auf Eis zu legen.

Übertragen Sie die Maus mit der Bauchseite nach unten auf die Bildgebungsplattform. Passen Sie den Nasenkonus an und sichern Sie ihn, um die Isofluran-Anästhesie aufrechtzuerhalten. Beginnen Sie die Implantation mit einer Haarentfernungslotion und einem Rasierer, um den Rücken und die Flanke einer sechs bis acht Wochen alten immundefizienten NSG-Maus zu enthaaren.

Tragen Sie eine optische Salbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Kleben Sie dann die Maus mit Klebeband fest, um versehentliche Bewegungen zu verhindern. Verwenden Sie als Nächstes die Ultraschallvisualisierung, um die Mausleber, die Hohlvene, die Milz, die linke Niere und die angrenzende linke Nebenniere zu identifizieren.

Füllen Sie eine gekühlte Hamilton-Spritze, die mit einer Nadel mit kleiner Bohrung ausgestattet ist, mit 10 Mikrolitern Zelllösung. Dann führte er unter Ultraschallkontrolle vorsichtig einen gekühlten 22-Gauge-Katheter durch die Haut und den Rückenmuskel direkt in die linke Nebenniere ein, um einen Kanal für die Zellinjektion zu schaffen. Entfernen Sie die Nadel und lassen Sie den Katheter an Ort und Stelle.

Die Visualisierung der Nebenniere während des gesamten Einführens des Katheters zusammen mit der Nadel und ihrer Flugbahn ist unerlässlich, um eine minimale Verletzung der umgebenden Strukturen und Organe zu gewährleisten und die Morbidität der Maus zu senken. Führen Sie dann die Spritze durch den Katheter, der in der Mitte der Nebenniere positioniert ist. Während die Spritze durch den Katheter geführt wird, ist es wichtig, die Stabilität des Katheters aufrechtzuerhalten und das Vorschieben der Nadel zu beobachten.

Beachten Sie, dass die Nadel selbst etwa zwei Millimeter über den Abschluss des Katheters hinausragt, ihre Position ist im Ultraschall leicht zu erkennen. Injizieren Sie die Zellen in das Ziel-Nebennierengewebe. Lassen Sie die Nadel ein bis zwei Minuten lang an Ort und Stelle, damit die Basalmembranmatrix aushärten kann.

Nachdem die Basalmembranmatrix ausgehärtet ist, entfernen Sie langsam die Nadel und entfernen Sie anschließend den Katheter. Setzen Sie die Maus schließlich in einen Auffangkäfig, bis sie wieder genügend Bewusstsein erlangt, um die Brustbeinlage aufrechtzuerhalten, bevor Sie in den Heimkäfig zurückkehren. Die Ultraschallbildgebung überwacht in vivo die Tumorprogression.

Dieses Bild zeigt ein Ultraschallbild der Nebenniere, eine Woche nach der Injektion. Hier zeigt die Lumineszenzbildgebung einer Neuroblastom-injizierten Maus eine Woche nach der Injektion Messwerte, die nicht auf eine Tumortransplantation hindeuten. Nach zwei Wochen zeigt die Ultraschallbildgebung eine Tumortransplantation und ein Fortschreiten auf eine Fläche von etwa 40 Quadratmillimetern.

Die Biolumineszenz zwei Wochen nach der Injektion zeigte eine Ausstrahlung von 10 bis zur siebten, was auf eine Zellaufnahme und ein Tumorwachstum hindeutet, die mit den Ultraschallbefunden korrelieren. Die Ultraschallbildgebung acht Wochen nach der Injektion zeigte ein anhaltendes Tumorwachstum mit einer Flächenmaße von mehr als 100 Quadratmillimetern. Auch hier bestätigte die Biolumineszenz die Ultraschallbefunde mit einer erhöhten Ausstrahlung von 10 bis neun.

3D-Ultraschallbildgebung des Tumors zeigte ein Volumen von mehr als 100 Kubikmillimetern, die Ausgangslage, die unser Labor für den Beginn präklinischer therapeutischer Studien verwendet. Der exzidierte Tumor war grob größer als einen Zentimeter und korrelierte mit Ultraschallmessungen und Lumineszenzsignalen. Dieses Medium demonstriert, wie orthotope Xenographen der Nebenniere mit patienteneigenen Neuroblastomzellen unter Verwendung von Ultraschallführung erfolgreich etabliert werden können.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als 12 Minuten pro Injektion durchgeführt werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.