Ganze Mount Immunfluoreszenz und Follikel Quantifizierung der kultivierten Maus Eierstöcke

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens ist es, Bilder von kultivierten ganzen Eierstöcken zu erhalten, die mit der automatisierten Follikelquantifizierung kompatibel sind. Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Reproduktionsbiologie zu beantworten, z. B. wie verschiedene Bedingungen die Fitness der Eierstöcke beeinträchtigen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie weniger arbeitsintensiv ist und die dreidimensionale Architektur des Organs erhalten bleibt.

Obwohl diese Methode für kultivierte Eierstöcke von Mäusen am fünften Tag nach der Geburt optimiert wurde, kann sie auch auf andere Altersgruppen und Gewebe wie embryonale Gonaden oder junge Mäusehoden angewendet werden. Beginnen Sie mit einer sauberen Arbeitsfläche. Wischen Sie mit zehn Prozent Bleichmittel ab und lassen Sie das Bleichmittel mindestens fünf Minuten auf der Arbeitsfläche verbleiben.

Entfernen Sie nach fünf Minuten überschüssiges Bleichmittel mit sauberen Papiertüchern und 70 Prozent Ethanol. Reinigen Sie das Präpariermikroskop gründlich mit 70 Prozent Ethanol und legen Sie ein trockenes Papiertuch auf den Tisch. Wickeln Sie saubere Pinzetten und Scheren mit einem Papiertuch ein, das mit 70 Prozent Ethanol angefeuchtet ist.

Stellen Sie dann 50 Milliliter Eierstockkulturmedien in einem konischen Röhrchen her und erwärmen Sie es in einem 37 Grad Celsius heißen Wasserbad. Nachdem sich das Medium erwärmt hat, bereiten Sie die Platten und Einsätze vor, indem Sie zuerst einen Milliliter Eierstockkulturmedium auf 35-Millimeter-Gewebekulturplatten geben. Geben Sie dann etwa 0,55 Milliliter Medium in die Vertiefungen einer 24-Well-Gewebekulturplatte und setzen Sie einen Einsatz in jede Vertiefung mit dem Medium ein.

Achten Sie darauf, dass die Membranen das Medium berühren. Legen Sie die 35-Millimeter-Platten und die 24-Well-Trägerplatte in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid und Luftsauerstoff. Stellen Sie dann eine Kochplatte neben das Präparierfernrohr und stellen Sie die Temperatur auf 37 Grad Celsius ein.

Wenn sich der Gewebekultur-Inkubator nicht in der Nähe des Präparierbereichs befindet, stellen Sie eine der 35-Millimeter-Gewebekulturschalen mit Eierstockkulturmedien auf die Heizplatte. Beginnen Sie dann mit der Dissektion, indem Sie das frisch eingeschläferte Weibchen mit 70 Prozent Ethanol besprühen und auf das trockene Papiertuch unter das Seziermikroskop legen. Nachdem Sie einen Schnitt in der Bauchhöhle gemacht haben, extrudieren Sie den Darm und lokalisieren Sie die Eierstöcke.

Entnehmen Sie die Eierstöcke und legen Sie sie in das Kulturmedium in der 35-Millimeter-Schale. Sobald die Eierstöcke präpariert wurden, erhöhen Sie die Vergrößerung des Präpariermikroskops, um die Eierstöcke und das anhaftende Gewebe besser sichtbar zu machen. Entfernen Sie mit einer sauberen Pinzette mit feiner Spitze sämtliches nicht-ovarielles Gewebe wie Schleimbeutel und Fettgewebe, ohne die Eierstöcke zu beschädigen.

Legen Sie dann jedes Paar Eierstöcke auf einen vorgetränkten Zellkultureinsatz und passen Sie das Volumen des Mediums an, um sicherzustellen, dass es ausreicht, um das Organ feucht zu halten, ohne es vollständig einzutauchen. Legen Sie die explantierten Organe in einen 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit fünf Prozent Kohlendioxid und Luftsauerstoff. Entfernen Sie zum gewünschten Versuchszeitpunkt das Eierstockkulturmedium von der Platte und fixieren Sie die kultivierten Eierstöcke auf dem Einsatz, indem Sie das Gewebe mit frisch zubereiteter vierprozentiger PFA-Lösung bedecken.

Versiegeln Sie die Ränder der Platte mit Paraffinfolie, um Verdunstung zu vermeiden, und stellen Sie die Proben über Nacht auf vier Grad Celsius ein. Spülen Sie das Tuch dreimal mit 70 Prozent Ethanol aus. Anschließend in Szintillationsfläschchen, die mit 70 Prozent Ethanol gefüllt sind, bei vier Grad Celsius bis zur Weiterverarbeitung lagern.

Beginnen Sie mit der Färbung, indem Sie das 70-prozentige Ethanol aus den Fläschchen entfernen und das fixierte Gewebe mindestens vier Stunden lang bei Raumtemperatur unter Schütteln mit PBS waschen. Fügen Sie nach dem Entfernen des PBS genügend Permeabilisierungslösung hinzu, um die Eierstöcke vollständig einzutauchen. Auf einen Orbitalschüttler legen und vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Ersetzen Sie die Permeabilisierungslösung durch genügend Blocklösung, um die Eierstöcke vollständig einzutauchen. Inkubieren Sie die versiegelten Fläschchen dann mindestens 12 Stunden lang bei Raumtemperatur auf einem Orbitalschüttler. Legen Sie die Einsätze nach dem Blockieren in eine 24-Well-Platte und fügen Sie etwa 750 Mikroliter Primärantikörperlösung hinzu, um sicherzustellen, dass die Eierstöcke vollständig untergetaucht sind.

Stellen Sie dann die versiegelte Platte auf den Orbitalschüttler und inkubieren Sie sie vier Tage lang bei Raumtemperatur. Entfernen Sie nach vier Tagen den primären Antikörper und fügen Sie eine großzügige Menge Waschlösung hinzu. Waschen Sie die Eierstöcke über Nacht.

Am nächsten Tag durch frische Waschlösung ersetzen und zwei Stunden oder länger auf dem Orbitalschüttler inkubieren. Nach den Waschvorgängen eine sekundäre Antikörperlösung hinzufügen. Schützen Sie die Proben vor Licht und inkubieren Sie sie zwei Tage lang auf einem Orbitalschüttler bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie nach zwei Tagen die sekundäre Antikörperlösung aus den Proben und fügen Sie Waschlösung hinzu. Beginnen Sie mit der Vorbereitung der ScaleS0-Clearinglösung. Mischen Sie die Lösung durch Inversion und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 50 Grad Celsius.

Entgasen Sie die ScaleS0-Räumlösung. Entfernen Sie dann die Waschlösung von den immunverfärbten Eierstöcken. Fügen Sie die Clearinglösung hinzu.

Decken Sie die Platte mit Alufolie ab und stellen Sie sie wieder in den Orbitalschüttler. Es ist äußerst wichtig, während der Färbe- und Reinigungsschritte geduldig zu sein. Sobald das Gewebe transparent geworden ist, entfernen Sie mit einem Skalpell mit feiner Spitze vorsichtig die Einlagemembranen, die die kultivierten Eierstöcke enthalten.

Legen Sie die Probe auf einen Objektträger und decken Sie die Probe vorsichtig mit einem Deckglas ab. Fahren Sie dann mit der Abbildung der Proben auf einem Mikroskop fort, das in der Lage ist, optische Schnitte zu machen. Dieses Bild zeigt einen Eierstock am fünften Tag nach der Geburt, der nicht geklärt wurde.

Hier ist der Eierstock eine Stunde nach der Zugabe der Clearing-Lösung zu sehen. Der Eierstock beginnt innerhalb von Minuten nach dem Eintauchen in die Reinigungslösung durchscheinend zu werden. Das optische Schneiden von kultivierten Eierstöcken ohne Klärung ist möglich, aber Zellen tief im Gewebe haben ein Signal, das schwer vom Hintergrund zu unterscheiden ist, was eine korrekte Quantifizierung der Eizellen erschwert.

Im Gegensatz dazu zeigt dieses repräsentative Bild eine geklärte Probe, in der eine Quantifizierung der Eizelle über das gesamte Organ möglich ist. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass Antikörper durch das Gewebe diffundieren müssen. Dickeres Gewebe erfordert daher eine längere Inkubationszeit. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man ganze Eierstöcke kultiviert, färbt und abbildet.

Der Text beschreibt die Verwendung einer freien Software, Fiji ImageJ, die für eine einfache Follikelquantifizierung verwendet werden kann. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Paraformaldehyd und Natriumazid gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Abzügen und persönlicher Schutzausrüstung getroffen werden sollten.