Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ein Modell zu präsentieren, das den Eintritt von mikrobiellen Produkten nach einer Verletzung der Darmbarriere nachahmt. Dieses Modell kann verwendet werden, um Immunreaktionen nach Invasion von Mikroorganismen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der entzündlichen Darmerkrankungen zu beantworten, wie z.B. die unkontrollierte Entzündung, die durch eine erhöhte intestinale Epithelpermeabilität gekennzeichnet ist.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht nur eine definierte Pumpe verwendet, sondern auch ein unkomplizierter Ansatz ist, der keine Operation erfordert und in jeder Laborumgebung eingesetzt werden kann. Das Verfahren werden von mir, Rachel Mak'Anyengo, einer Postdoktorandin, und Berna Kaya, einer Doktorandin, demonstriert. Fassen Sie die Maus sanft, aber fest an und halten Sie das Tier in einer Hand fest.

Stellen Sie sicher, dass die Maus fest in der Hand liegt und normal atmen kann. Neigen Sie die Mausnase leicht in Richtung Boden, um den Bauch für die Injektion freizulegen. Lokalisieren Sie die Mittellinie des Abdomens und injizieren Sie das erforderliche LPS-Volumen auf der unteren linken oder rechten Seite.

Es ist sehr wichtig sicherzustellen, dass die Nadel in die Bauchhöhle eintritt, um Fehlinjektionen zu vermeiden. Die Nadel sollte auch nicht zu tief in die Bauchhöhle eindringen, um Verletzungen der inneren Organe zu vermeiden. Bringen Sie das Tier vorsichtig in den Heimkäfig zurück.

Überwachen Sie die Mäuse zum Zeitpunkt der Injektion und danach alle zwei Stunden acht Stunden lang auf das Auftreten und den Schweregrad der Endotoxämie. Notieren Sie die Beobachtungen im beigefügten Bewertungsblatt. Bereiten Sie die Entnahmeröhrchen vor, indem Sie einen Milliliter einstufiges RNA-Isolationsreagenz in zwei Milliliterröhrchen geben, die mit 1,4 Millimeter Keramikkügelchen vorgefüllt sind.

Nachdem Sie die Maus eingeschläfert und blutig gemacht haben, schneiden Sie mit einer Schere die Haut und die Muskelschicht und legen Sie die Bauchhöhle mit den inneren Organen frei. Präpariere vorsichtig die Milz, die Leber und den Dickdarm. Reinigen Sie jedes Organ von dem Fett und geben Sie es dann in PBS auf Eis.

Schneiden Sie anschließend mit einer Schere oder einem Skalpell ein 0,5 Zentimeter langes Stück aus jedem Organ ab. Trocknen Sie das Gewebe kurz auf einem Stück Papiertaschentuch und legen Sie es in das Entnahmeröhrchen, wobei Sie sicherstellen, dass es vollständig in das RNA-Isolationsreagenz eingetaucht ist. Homogenisieren Sie dann das Gewebe in einem Hochgeschwindigkeits-Tischhomogenisator.

Für Weichteile wie Milz, Leber und Dickdarm verwenden Sie einen Homogenisierungszyklus bei hoher Geschwindigkeit für 30 Sekunden. Nach der Homogenisierung werden die Proben fünf Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Tauchen Sie die Röhrchen vorsichtig in flüssigen Stickstoff, um das Gewebelysat einzufrieren.

Lagern Sie das schockgefrorene Lysat bei minus 80 Grad Celsius bis zur RNA-Isolierung. Beginnen Sie mit der RNA-Isolierung, indem Sie das gefrorene Gewebelysat auf Eis auftauen. Nach dem Auftauen zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 1000 mal G, um die verbleibenden Gewebepartikel zu pelletieren, die übrig bleiben könnten.

Nach der Zentrifugation werden die Überstände in ein neues, nukleasefreies 1,5-Milliliter-Röhrchen überführt und 200 Mikroliter eiskaltes Chloroform pro einem Milliliter RNA-Isolationsreagenz hinzugefügt. Schütteln Sie das Knorpel sofort 10 bis 15 Sekunden lang. Nachdem die Proben zwei bis drei Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert wurden, zentrifugieren Sie sie 15 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 12.000 μg.

Die Probe enthält nun drei Phasen, die untere rote Phenolchloroform-Phase, die Interphase und die obere farblose wässrige Phase. Die RNA-haltige obere wässrige Phase auffangen und in ein neues, nukleasefreies 1,5-Milliliter-Röhrchen überführen. Um die RNA auszufällen, fügen Sie 0,5 Milliliter eiskaltes Isopropanol pro Milliliter RNA-Isolationsreagenz hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie das Röhrchen fünf- bis sechsmal umdrehen.

Nach einer Inkubation von 10 bis 15 Minuten bei Raumtemperatur zentrifugieren Sie 10 Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 12.000 mal G. Nach dem Zentrifugieren ist der Überstand, der das Isopropanol enthält, vollständig zu entfernen, ohne das Pellet zu stören. Waschen Sie dann die Pellets mit einem Milliliter eiskaltem 75%igem Ethanol pro Milliliter RNA-Isolationsreagenz, das für die Erstlyse verwendet wurde, und wirbeln Sie die Probe kurz ein.

Nachdem Sie die Probe fünf Minuten lang bei vier Grad Celsius bei 7500 oder 12.000 Mal G zentrifugiert haben, entfernen Sie den Überstand vollständig, ohne das Pellet zu stören. Lassen Sie die geöffneten Röhrchen drei bis fünf Minuten lang unter der Chemikalienhaube, um das RNA-Pellet bei Raumtemperatur an der Luft zu trocknen. Als nächstes lösen Sie das RNA-Pellet in 20 bis 50 Mikrolitern nukleasefreiem Wasser auf, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren.

Inkubieren Sie die Probe dann 10 bis 15 Minuten lang bei 55 Grad Celsius, um die Lösung der RNA weiter zu verbessern. Verdauen Sie kontaminierende DNA, indem Sie zuerst nukleasefreies Wasser zu maximal 10 Mikrogramm RNA hinzufügen, so dass das endgültige Volumen nach Zugabe von Puffer und Enzym 50 Mikroliter beträgt. Fügen Sie dann fünf Mikroliter 10x DNase 1 Puffer und einen Mikroliter rekombinante DNase 1 pro Probe hinzu und mischen Sie vorsichtig, indem Sie auf und ab pipettieren.

Bei 37 Grad Celsius für 20 bis 30 Minuten inkubieren. Nach der Inkubation die DNase in einem Aktivierungsreagenz vortexen, dann fünf Mikroliter zur Probe geben und gut mischen. Fünf Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, gelegentlich von Hand mischen.

Nach eineinhalb Minuten Zentrifugation bei 10.000 G wird der Überstand mit der DNA-freien RNA in ein neues, nukleasefreies Röhrchen überführt. Messen Sie abschließend die RNA-Konzentration und -Qualität mit einem Spektralphotometer. Nach der Injektion von LPS wurde der Krankheits-Score, der das Aussehen und die Aktivität der Tiere, das Öffnen ihrer Augen sowie ihre Atemfrequenz und -qualität umfasst, auf der Y-Achse gegen die Zeit auf der X-Achse aufgetragen.

Die QPCR zur Quantifizierung der Zytokinexpression zeigte, dass Il6 zwei Stunden nach der LPS-Injektion in Milz und Dickdarm und vier Stunden nach der Injektion in die Leber seinen Höhepunkt erreichte. Die Expression von Il1 beta, Tnf alpha und Il10 erreichte vier Stunden nach der Injektion in allen Geweben ihren Höhepunkt. Innerhalb von acht Stunden kehrte die Expression von Il6, Il1 beta, Tnf alpha und Il10 auf das Ausgangsniveau zurück.

Beim Versuch des Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, die Dosis von LPS, den Hygienestatus der Mäuse, den Zeitpunkt des Versuchsabbruchs und vor allem den genetischen Hintergrund des Mausstamms zu berücksichtigen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie das Eindringen von bakteriell abgeleiteten Verbindungen in einen Wirt nach einem Barrieredurchbruch nachahmen können. Die niedrige, subletale Dosis von LPS, die systematisch in Mäuse injiziert wird, induziert eine Hochregulierung von proinflammatorischen Zytokinen, die durch RGQ-PCR-Analyse quantifiziert werden.