Name: Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 24 s
Description: Lernen Sie eine LPS-Injektionsmethode bei Mäusen zur Simulation mikrobieller Produkteingabe nach Darmbarriereverletzung. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung immunologischer Reaktionen bei entzündlichen Darmerkrankungen.

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Mäuse wurden gezüchtet und gehalten unter spezifischen Pathogen-freies (SPF) in der Tierstation Abteilung Biomedizin, Universität Basel (Basel, Schweiz). Alle Maus-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Eidgenössischen und kantonalen Vorschriften (tierische Protokollnummer 2816 [Kanton Basel-Stadt]) durchgeführt.
1. Vorbereitung des LPS-Lösung
<ol><li>Öffnen Sie den Bestand an LPS von Escherichia coli 0111:B4 unter sterilen Bedingungen gereinigt und rekonstruieren Sie es in Wasser, um die Konzentration von 5 mg/mL.</li>
	<li>Verdünnen Sie die LPS-Aktie mit sterilen Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) zur Arbeit Konzentration von 0,2 µg/µL.</li>
</ol>(2) intraperitoneale Injektion von LPS auf Mäuse
<ol><li>Aspirieren Sie der LPS arbeiten Lösung in einer 0,5 mL Spritze mit einer 30 G-Nadel in eine laminare Luftströmung.</li>
	<li>Weibliche C57Bl/6 Mäusen (sechs bis 10 Wochen alt) wiegen und berechnen die Höhe der LPS, die injiziert werden: 10 µL (2 µg) / g Körpergewicht. Hinweis: zum Beispiel, wenn eine Maus 20 g und 20 g x 10 µL wiegt = 200 µL LPS Arbeitsanforderungen Lösung injiziert werden.</li>
	<li>Behandeln Sie die Maus zu, sanft, aber bestimmt und zurückhalten Sie das Tier in der einen Hand. Stellen Sie sicher, dass das Tier in der Lage ist, normal zu atmen, aber nicht zu drehen und wenden, während die Zurückhaltung.</li>
	<li>Kippen Sie die Maus Nase leicht auf den Boden, den Bauch Injektionslösung verfügbar zu machen. Suchen Sie nach der Mittellinie des Bauches und der Ort der Injektion in den niedrigen Bauch nach links oder rechts von der Mittellinie. Injizieren Sie i.p. PBS statt LPS in kontrollmäusen.</li>
	<li>Mit der freien Hand Spritzen das entsprechende Volumen (das Volumen berechnet im Schritt 2.2) der LPS Lösung arbeiten. Stellen Sie sicher, dass die Nadel der Bauchhöhle MIS Injektionen in die Bauchmuskel-Schicht können auftreten, da sonst eingetreten ist. Dennoch gehen Sie nicht zu tief mit der Nadel in die Bauchhöhle, nicht zu verletzen, innere Organe, die in diesem Bereich.</li>
	<li>Das Tier sorgfältig an den Käfig mit bis zu 5 Mäusen pro Käfig zurück.</li>
</ol>3. überwachen Sie die Mäuse
<ol><li>Überwachen Sie die Tiere zum Zeitpunkt der Einspritzung und alle 2 Std. nach der Injektion für 8 h für die Häufigkeit und schwere von endotoxämie. Verwenden Sie daher ein Notenblatt (Tabelle 1), die aus einer zuvor veröffentlichten Manuskript 24angepasst wurde.</li>
	<li>
Punkten Sie die LPS injizierte Mäuse für die folgenden Parameter, die in Tabelle 1 aufgeführten
	<ol>
<li>Überprüfen Sie das Aussehen des Fells, die normalerweise glatt ist. Wenn das Fell zerzauste, stachelig oder aufgedunsen Fell der Beschwerden und/oder Schmerzen angibt erscheint, erzielen sie als 1, 2 oder 3.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Aktivität der Maus. Hinweis: Mäuse normalerweise frei bewegen den ganzen Käfig, Essen, trinken, Klettern könnte, aber unterdrückt oder eingeschränkte Aktivität ein Zeichen für Schmerzen.</li>
		<li>Überprüfen Sie auf der Ebene des Bewusstseins. Hinweis: Mäuse sind sehr neugierig und normal bewegen sie den Käfig untersucht die Umgebung. Fehlende oder reduzierte Bewegung kann vorschlagen, Schmerzen und Beschwerden.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Augen. Hinweis: Vollständig geöffnete Augen dürften bei gesunden Mäusen, aber ganz oder teilweise geschlossene Augen, eventuell mit Sekretion, können ein Hinweis auf Schmerzen sein.</li>
		<li>Überprüfen Sie die Atemfrequenz. Hinweis: Gesunde Mäuse haben in der Regel eine normale und schnelle Atemfrequenz, eine reduzierte Atemfrequenz könnte ein Hinweis auf Beschwerden).</li>
		<li>Überprüfen Sie die Qualität der Atmung. Hinweis: Erschwerte Atmung mit oder ohne nach Luft schnappen ist ein Zeichen des Schmerzes.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(4) Gewebe Sampling für Ribonukleinsäure (RNA) Extraktion und Homogenisierung
<ol><li>Bereiten Sie die Sammlung/Homogenisierung Röhren: Fügen Sie 1 mL Einzelschritt RNA Isolierung Reagenz 2 mL Röhrchen vorausgefüllt mit 1,4 mm Keramik Kugeln.</li>
	<li>Zu den entsprechenden Zeitpunkten (vor (0 h) und 2 h, 4 h und 8 h nach LPS-Injektion) einschläfern die Maus mit Narkose Überdosierung (Isofluran) gefolgt von Entbluten und fahren Sie mit der Dissektion.</li>
	<li>Schneiden Sie die Haut und die Muskelschicht, die Freilegung der Bauchhöhle mit den inneren Organen mit der Schere.</li>
	<li>Sorgfältig sezieren Sie die Milz, Leber und Darm zu, reinigen Sie die Organe aus Fett und halten sie in PBS auf Eis.</li>
	<li>Schneiden Sie ein kleines Stück (ca. 0,5 cm lang) aus jedes Organ mit einer Schere oder Skalpell. Hinweis: Es ist wichtig, immer das Stück aus etwa der gleichen Teil des Organs in jeder Maus (gleiche Lappen der Leber, proximalen oder distalen Teil des Dickdarms).</li>
	<li>Kurz trocknen Sie das Gewebe auf einem Papiertuch und legen Sie sie in die Sammlung/Homogenisierung Rohr dafür sorgen, dass es komplett in RNA Isolierung Reagenz eingetaucht ist.</li>
	<li>Das Gewebe in eine High-Speed-Benchtop-Homogenisator zu homogenisieren. Für Weichteile wie Milz, Leber und Dickdarm 1 Zyklus der Homogenisierung mit Geschwindigkeit 6,00 für 30 s.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben für 5 min bei Raumtemperatur.</li>
	<li>Legen Sie vorsichtig dem Schlauch in flüssigem Stickstoff Einfrieren Snap das Gewebe lysate. Speichern Sie die Snap lysate bei-80 ° C eingefroren, bis die RNA-Isolierung.</li>
</ol>(5) RNA-Extraktion aus Gewebe
Hinweis: RNA Isolierung Reagenzien, Chloroform und Alkohol gelten als Gefahrgut. Durchführen Sie RNA-Extraktion unter einer chemischen Haube. Verwenden Sie zertifizierte RNase-freie Reagenzien und Geräte, um eine RNase-freie Umgebung beizubehalten.
<ol><li>
Phasentrennung
	<ol>
<li>Tauen Sie das gefrorene Gewebe lysate auf Eis.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe auf 1.000 x g für 5 min bei 4 ° C, die übrigen Gewebe Partikel pellet, die gelassen werden könnte.</li>
		<li>Übertragen Sie den überstand auf eine neue Nuklease-freie 1,5 mL Tube.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL eiskalte Chloroform pro 1 mL RNA Isolierung Reagenz und schütteln Sie kräftig von Hand für 10-15 s.</li>
		<li>Ca. 2-3 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Zentrifuge an 12, 000 X g für 15 min bei 4 ° C. Hinweis: Die Probe enthält nun 3 Phasen: untere rote Phenol-Chloroform-Phase, die Interphase und der oberen farblosen wässrigen Phase. Die RNA ist in der oberen wässrigen Phase.</li>
		<li>Sammeln Sie die oberen wässrigen Phase (50 % des Gesamtvolumens) und den Transfer in eine neue Nuklease-freie 1,5 mL Tube.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
RNA-Niederschlag
	<ol>
<li>0,5 mL eiskaltes Isopropanol pro 1 mL RNA Isolierung Reagenz und mischen Sie sanft durch das Rohr 5-6 mal umdrehen.</li>
		<li>10-15 min bei Raumtemperatur inkubieren.</li>
		<li>Zentrifuge bei 12.000 x g für 10 min bei 4 ° C. Hinweis: RNA Pellet sollte zu diesem Zeitpunkt sichtbar sein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Waschen der RNA pellet
	<ol>
<li>Den Überstand mit dem Isopropanol ohne zu stören das Pellet vollständig zu entfernen.</li>
		<li>Waschen Sie die Pellets mit 1 mL eiskaltem 75 % Ethanol pro 1 mL RNA Isolierung Reagenz für die anfängliche Lyse verwendet.</li>
		<li>Wirbel der Probe kurz.</li>
		<li>Zentrifugieren Sie die Probe bei 7.500 (oder 12.000) X g für 5 min bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Auflösen von RNA
	<ol>
<li>Vollständig zu entfernen das Ethanol im überstand ohne zu stören das Pellet.</li>
		<li>Lassen Sie den geöffneten Schlauch unter der chemischen Haube für 3-5 min das RNA-Pellet bei Raumtemperatur an der Luft trocknen (nicht übermäßig trocken wie in diesem Fall es wird schwierig, RNA aufzulösen).</li>
		<li>Lösen Sie die RNA-Pellets in 20-50 µL Nuklease-freies Wasser durch pipettieren vorsichtig rauf und runter.</li>
		<li>Inkubation der Probe bei 55 ° C für 10-15 min, die Lösung der RNA weiter zu verbessern. Hinweis: In diesem Stadium kann RNA bei-80 ° C bis weitere Analysen gespeichert werden.</li>
	</ol>
</li>
</ol>(6) Verdauung der verbleibenden DNA
<ol><li>Die RNA-Konzentration mit einem Spektralphotometer durch pipettieren eine Aliquote (2 µl) in die Spektralphotometer Messen und justieren der empfohlenen Konzentration.</li>
	<li>Starten Sie die Verdauung kontaminierender DNA mit Max. 10 µg RNA in 50 µL Nuklease-freies Wasser.</li>
	<li>Fügen Sie 0,1 Volumen von 10 x DNase I-Puffer und 1 µL rDNase ich pro Sample und Mischung sanft durch pipettieren rauf und runter.</li>
	<li>Inkubation bei 37 ° C für 20-30 Minuten.</li>
	<li>Vortex DNase Inaktivierung Reagenz und 0,1 Volumen der Probe mit der Pipette gut mischen.</li>
	<li>Inkubieren Sie für 5 min bei Raumtemperatur, die gelegentlich von Hand mischen.</li>
	<li>Bei 10.000 x g für 1,5 min zentrifugieren.</li>
	<li>Übertragen Sie den Überstand mit DNA-freie RNA in das neue Nuklease-freie Rohr.</li>
	<li>Messen Sie die RNA-Konzentration und Qualität von Spektralphotometer.</li>
</ol>(7) reverse Transkription
<ol><li>Verwenden Sie eine handelsübliches Desoxyribonukleinsäure cDNA reversen Transkription (RT) Kit für reverse Transkription. Hinweis: Hier können bis zu 2 µg RNA transkribiert rückgängig gemacht werden.</li>
	<li>Berechnen Sie das Volumen, das 2 µg RNA enthält. Pipette 2 µg RNA in einem neuen PCR-Röhrchen.</li>
	<li>Die Probe in der PCR-Röhre, um das endgültige Volumen von 10 µL Nuklease-freies Wasser hinzufügen.</li>
	<li>Bereiten Sie 2 X Master Mix durch Mischen der folgenden Komponenten in Tabelle 2 aufgeführten vor
</li>
	<li>10 µl RNA zu 1 x Master Mix im Gesamtvolumen von 20 µL fügen Sie 10 µL 2 x Master Mix hinzu.</li>
	<li>Schließen Sie kurz die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Rohr und Spin-down der Probe.</li>
	<li>Legen Sie die Proben in einer PCR-Thermocycler und legen Sie die Einstellungen, die in Tabelle 3aufgeführt.</li>
	<li>Speichern Sie die generierten cDNA bei-20 ° C zur weiteren Analyse.</li>
</ol>(8) Quantitative PCR (qPCR)
<ol><li>Führen Sie die qPCR-Reaktion mit einem kommerziell erhältlichen Kit.</li>
	<li>Selbst entwerfen Sie und testen Sie die Intron-spanning Primer vor der Verwendung mit verschiedenen Konzentrationen der Vorlage cDNA. Analysieren Sie die Wirksamkeit des Primers durch die Schaffung einer Standardkurve und verwenden Sie die Primer mit hoher Wirksamkeit und richtigen Schmelzpunkt Kurven. Hinweis: Die Sequenzen von Primern in diesem Experiment verwendet werden in Tabelle 2aufgeführt.</li>
	<li>Bereiten Sie die quantitative Polymerase Kettenreaktion (qPCR) Reaktion in den 384-Well-Platte mit dem Reaktion Setup beschrieben in Tabelle 4.</li>
	<li>Halten Sie alle Lösungen und die Platte auf Eis mit Aluminiumfolie zu verhindern, dass die Platte nass wenn das Reaktionsgemisch vorbereitet ist.</li>
	<li>Führen Sie alle Reaktionen in Triplicates.</li>
	<li>Durchführung der PCR-Reaktion auf ein Thermocycler mit der Einstellung, die in Tabelle 5aufgeführt.</li>
	<li>Berechnen Sie den Mittelwert Ct für alle Reaktionen von der Triplicates. Alle Zielgene, die Expression des Glycerinealdehyde-3-phosphat-Dehydrogenase zu normalisieren (Gapdh) Zimmermädchen gen durch die Berechnung von 2^(-ΔCt). Hinweis: Alle die Zielgene mit der durchschnittlichen Ct > 35 galten unter der Nachweisgrenze liegt.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Dieses Protokoll imitiert immunologische Prozesse, die nach der Invasion durch mikrobielle gewonnenen Erzeugnissen auftreten. Wichtige Schritte im Rahmen des Protokolls sind die Auswahl der mauslinie, den Hygienestatus der Mäuse, die Dosis von LPS, die Überwachung der Tiere für das Auftreten von endotoxämie und der Zeitpunkt der Beendigung des Experiments. Am wichtigsten ist, ist der genetische Hintergrund der Maus Belastung zu berücksichtigen. Verschiedene Mausstämme haben unterschiedliche Anfälligkeit für LPS. Beispiel...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/57610/injections-lipopolysaccharide-into-mice-to-mimic-entrance-microbial">Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach</a>
One of the authors&#39; names was corrected from:
Katarina Raduolovic
to:
Katarina Radulovic

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Erratum: Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

Der menschliche Darm ist mit ein großes Konsortium von Mikroorganismen besiedelt, die die Mikrobiota bildet, die eine für beide Seiten vorteilhafte Beziehung mit dem Host während der Evolution entwickelt hat. In dieser Beziehung stellt der Host eine sichere Nische für die Mikrobiota, während die Mikrobiota liefert Vitamine, Nährstoffe Verdauung und Schutz vor Krankheitserregern, Host, wo die Mikrobiota1befindet. Wenn diese vorteilhafte Beziehung zwischen dem Host und dem Mikrobiota gestört ist, können Krankheiten entstehen, wie chronisch entzündliche Darmerkrankungen (IBD). IBD ist eine multifaktorielle chronisch-entzündliche Erkrankung des Darms verursacht durch genetische Faktoren und Umweltfaktoren, die in zwei Hauptformen, Morbus Crohn (CD) und Colitis ulcerosa (UC) auftreten. Trotz Ähnlichkeiten zwischen den beiden Formen der IBD zeichnen sie sich durch gewisse Unterschiede in der Lage und Art der entzündlichen Veränderungen. CD ist eine rezidivierende Transmural entzündliche Erkrankung, die potenziell zu, zu jedem Teil des Magen-Darm-Trakt, verlängern kann während UC nicht Transmural ist und ist auf den Dickdarm beschränkt. Darüber hinaus ist Mutationen im Nukleotid-Bindung Oligomerisierung Domäne-haltige Protein 2 (NOD2), einen Muster-Anerkennung-Rezeptor (PRR), die einer Dipeptid (MDP), eine Komponente der Zellwand der meisten gram-positiven und -negativen Bakterien, erkennt CD2zugeordnet. Darüber hinaus wurden Listerien und Streptokokken , Escherichia coli (E. Coli)und ihre Produkte Alle innerhalb von Makrophagen in Patienten mit Zervikaler gefunden, die den Host eingegeben haben, nachdem eine Barriere gegen3. Wenn Bakterien oder deren Produkte die Gastgeber bei der Entwicklung der CD eingeben, entwickelt das Immunsystem eine Reaktion führt zu die Produktion von zirkulierenden Antikörper Anti-bakterielle4. Vielleicht rührt der überzeugendste Beweis für die Rolle der Mikrobiota in der Pathogenese der IBD Mausmodellen. Wenn Tiere mit Antibiotika behandelt werden, oder wenn Mäuse in steriler (GF) gehalten werden, wird die Schwere der Erkrankung bei den meisten Modellen der Kolitis, wie IL-10-/-Mäusen reduziert, die nicht Kolitis in GF Einrichtungen5,6 entwickeln. Ulcerosa stört darüber hinaus auch die Zusammensetzung der Mikrobiota, zeichnet sich durch eine unausgewogene Zusammensetzung und reduzierte Reichtum Dysbiose7genannt. Die Folge der IBD kann eine erhöhte intestinale Permeabilität, die bis zum Eingang der Mikroben und mikrobielle gewonnenen Erzeugnisse in die Host-führen können.
Bei Tieren induziert die Anwendung von Dextran Natriumsulfat (DSS) eine intestinale epitheliale Verletzung führt zu einer erhöhten Durchlässigkeit der die epitheliale Barriere-8. Portal-LPS-Konzentrationen sind bei Tieren mit DSS ulcerosa9erhöht. Interessanterweise sind Tiere fehlt die C Typ Lektin-Rezeptor spezifischen intrazellulären Adhäsion Molekül-3 greifen Nonintegrin Homolog-bezogene 1 (Zeichen-R1) von DSS Kolitis und LPS-induzierte endotoxämie10geschützt. Weiter in die Host-zu verbreiten, müssen Bakterien und Bakterienprodukte abgeleitet die vaskuläre Barriere11, der Bauchhöhle, in dem die dünn- und Dickdarm befindet, die mesenterialen Lymphknoten und/oder der Leber12. Um die Komplexität dieses Systems zu verringern, wurde eine definierte bakterielle abgeleitete Verbindung verwendet. LPS, wodurch endotoxämie nach intraperitoneal (i.p.) oder intravenös (i.v.) Injektion13 in Mäuse, der Ausdruck der Interleukine Il6 und Ilb und Zytokin Tnfa als Reaktion auf LPS studieren injiziert wurde.
LPS ist ein Pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMP) ausgedrückt als Zellwand Bestandteil von Gram-negativen Bakterien, die aus Lipid A besteht (die wichtigsten PAMP in der Struktur der LPS), eine Core-Oligosaccharid und ein O Seite Kette14. Abgabe-wie Empfänger 4 (TLR4) zum Ausdruck gebracht durch Dendritische Zellen, Makrophagen und Epithelzellen erkennt LPS15, das Co-Rezeptoren für entsprechende Bindung erfordert. Die akute Phase Protein LPS-bindendes Protein (LBP) bindet LPS zu einem Komplex, der LPS mit dem Cluster der Differenzierung 14 (CD14), eine glycosylphosphatidylinositole verankert Membranprotein überträgt. CD14 weitere shuttles LPS auf Lymphozyten Antigen 96 oder auch bekannt als MD-2, die die extrazelluläre Domäne des TLR4 zugeordnet ist. Die Bindung des LPS an MD-2 erleichtert die Dimerisierung von TLR4/MD-2 induzieren Konformationsänderungen intrazellulären Adapter Moleküle Aktivieren der nachgeschalteten Signal Weg14, umfasst die primäre myeloische Differenzierung zu rekrutieren Antwort gen 88 (MyD88) - abhängigen Signalweg und die TIR-Domain-haltigen Adapter-induzierende Interferon-β (SIMPE) - abhängigen Weg16. Die Anerkennung der LPS von TLR4 dann die NF-κB-Signalweg aktiviert und induziert die Expression von proinflammatorischen Zytokinen, wie TNF, IL-6 und IL-1β17.
Insbesondere wenn LPS in Tiere, die Konzentration von LPS gegeben zu den Tieren injiziert ist der genetische Hintergrund des Tieres und der Ernährung zu berücksichtigen. Hohe Konzentrationen von LPS führt zu einem septischen Schock, Hypotonie und mehrere Orgel Ausfälle geprägt und schließlich zum Tod18. Mäuse sind unempfindlicher gegen LPS im Vergleich zu Menschen, wo LPS Konzentrationen zwischen 2-4 ng/kg Körpergewicht (BW) in der Lage, ein Cytokine Sturm19zu induzieren. Bei Mäusen, die letale Dosis (LD50), die Tod in der Hälfte der Mäuse reicht von 10-25 mg/kg BW20 abhängig von der Maus-Sorte verwendet induziert. Für die gängigen Mausstämme C57Bl/6 und BALB/c, ist die letale Dosis 50 % (LD50) 10 mg/kg kg. Im Gegensatz dazu sind die Stämme C3H/HeJ und C57BL/10ScCr von LPS induzierte endotoxämie, geschützt, die durch Mutationen im Tlr4-21. Infolgedessen sind Tlr4-defizienten Mäusen Hyporesponsive Injektionen mit LPS22. Anderen gentechnisch veränderten Mauslinien, z. B. PARP1/Mäuse23 sind resistent gegen LPS-induzierten toxischen Schock.
Die Maus-Modell beschrieben verwendet hier eine subletale Dosis von LPS systemisch verabreicht, um die Folgen der LPS Verbreitung nach einer Verletzung der Barriere von der Körperoberfläche zu imitieren. Die gewählte LPS-Konzentration (2 mg/kg kg) nicht Mortalität bei C56Bl/6-Mäusen, aber die induzierte Freisetzung von Pro-inflammatorischen Zytokinen induzieren.

<table><tbody><tr><td>DreamTaq Green PCR Master Mix (2x)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>cDNA-Reverse-Transkriptionskit mit hoher Kapazität,</td> <td>Applied Biosystems, Foster City, CA, USA</td><td>4368813</td><td></td></tr><tr><td>RNase-freies DNase-Set,</td> <td>Qiagen, Hilden, Deutschland</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>LPS Escherichia coli O111:B4</td><td>Invivogen, San Diego, CA, USA.</td><td>tlrl-eblps</td><td></td></tr><tr><td>Omnican 50 Einweg-Insulinspritze</td><td>B. Braun Melsungen, Melsungen, Deutschland</td><td>9151125</td><td></td></tr><tr><td>Bioanalyzer 2100</td><td>Agilent Technologie, Santa Clara, USA</td><td>nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5430</td><td>Eppendorf, Hamburg, Deutschland</td><td>nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge Mikro 220R</td><td>Hettich, Kirchlengern, Deutschland</td><td>nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Präparierwerkzeuge</td><td>Aesculap, Tuttlingen, Deutschland</td><td>nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>Fast-Prep-24 5G Probenvorbereitungssystem</td><td>M.P. Biomedicals, Santa Ana, CA, USA</td><td>nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000</td><td>NanoDrop Products, Wilmington, DE, USA</td><td>nicht zutreffend</td><td></td></tr><tr><td>TRI Reagenz</td><td>Zymo Research, Irvine, CA, USA</td><td>R2050-1</td><td></td></tr></tbody></table>

injektionen von lipopolysaccharid in mäuse, eingang des mikrobiellen gewonnenen erzeugnisse nach darmbarriere verletzung zu imitieren

Injections of Lipopolysaccharide into Mice to Mimic Entrance of Microbial-derived Products After Intestinal Barrier Breach

Die intestinale epitheliale Barriere trennt den Host von der Mikrobiota, die normalerweise toleriert oder ignoriert wird. Der Verstoß gegen diese Barriere führt im Eingangsbereich der Bakterien oder Bakterien gewonnenen Erzeugnisse in die Host-Zugriff auf die Host-Zirkulation und inneren Organe führt zu einer unkontrollierten Entzündung wie bei Patienten mit chronisch entzündlichen Darmerkrankungen (IBD) beobachtet, die zeichnen sich durch eine erhöhte intestinale epitheliale Durchlässigkeit.
Um den Eingang des bakteriellen abgeleitete Verbindungen in die Host-zu imitieren, ein endotoxämie Modell in welcher Lipopolysaccharid (LPS), eine Komponente der äußeren Zellwand von gramnegativen Bakterien übernommen wurde, wurden in Mäuse injiziert. In dieser Studie eine subletale Dosis von LPS intraperitoneal injiziert wurde und die Mäuse wurden anschließend für 8 h über eine Krankheit Punktzahl überwacht. Darüber hinaus der Ausdruck, den Ebenen von inflammatorischen Zytokinen Il6, Il1b, und Tnfa qPCR zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der Milz, Leber und Darm analysiert wurden Posten LPS Injektion. Dieses Modell könnte für die Studien, die Untersuchung der Immunantwort nach der Invasion von Mikroorganismen oder Bakterien stammenden Produkte verursacht durch eine Barriere Verletzung von Körperoberfläche nützlich sein.

Um die Folgen für den Host nach dem Eintritt von Bakterien oder bakterielle abgeleitete Produkte zu imitieren, die nach Darmbarriere Verletzung auftritt, LPS in C57Bl/6 Mäusen in subletalen Dosen (2 µg/g Körpergewicht) injiziert wurde. Jeder Mausklick wurde überwacht und erzielte für das Auftreten von endotoxämie mit Parametern im Notenblatt, das enthält, das Erscheinungsbild der Mäuse, die Aktivität der Tiere, den Zustand der Augen, die Atemfrequenz und die Qualität (Tabelle 1</s...

Hier präsentiert sich ein Protokoll zum Eingang des bakteriellen abgeleitete Verbindungen nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren. Eine niedrige subletale Dosis von Lipopolysaccharid injiziert wurde systemisch in Mäuse, die 24 h nach der Injektion beobachtet wurden. Der Ausdruck von Pro-inflammatorischen Zytokinen wurde zu verschiedenen Zeitpunkten in Milz, Leber und Darm bestimmt.

Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren

The intestinal epithelial barrier separates the host from the microbiota that is normally tolerated or ignored. The breach of this barrier results in the ...

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, ein Modell zu präsentieren, das den Eintritt von mikrobiellen Produkten nach einer Verletzung der Darmbarriere nachahmt. Dieses Modell kann verwendet werden, um Immunreaktionen nach Invasion von Mikroorganismen zu untersuchen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der entzündlichen Darmerkrankungen zu beantworten, wie z.B. die unkontrollierte Entzündung, die durch eine erhöhte intestinale Epithelpermeabilität gekennzeichnet ist.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie nicht nur eine definierte Pumpe verwendet, sondern auch ein unkomplizierter Ansatz ist, der keine Operation erfordert und in jeder Laborumgebung eingesetzt werden kann. Das Verfahren werden von mir, Rachel Mak'Anyengo, einer Postdoktorandin, und Berna Kaya, einer Doktorandin, demonstriert. Fassen Sie die Maus sanft, aber fest an und halten Sie das Tier in einer Hand fest.Stellen Sie sicher, dass die Maus fest in der Hand liegt und normal atmen kann. Neigen Sie die Mausnase leicht in Richtung Boden, um den Bauch für die Injektion freizulegen. Lokalisieren Sie die Mittellinie des Abdomens und injizieren Sie das erforderliche LPS-Volumen auf

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Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

Hier beschrieben ist ein Verfahren, bei dem Lipopolysaccharid in der laktierenden Milchdrüse der Maus über den Nippel, um Mastitis zu simulieren, ein Zustand, üblicherweise durch bakterielle Infektion verursacht wird injiziert. Lipopolysaccharide Injektion führt zu einer erhöhten nuclear factor kappa B (NF-kappaB) Signaltechnik, visualisiert durch Biolumineszenz Bildgebung eines NF-kappaB Luciferase-Reporter-Maus.

Intraduktale Injektion von LPS als Maus-Modell der Mastitis: Signaling Visualisierte über einen NF-kappaB Reporter Transgene

Quelle: Radulovic, K., et al. Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, um das Eindringen mikrobieller Produkte nach dem Durchbruch der Darmbarriere nachzuahmen. J. Vis. Exp. (2018)Dieses Video demonstriert ein Schritt-für-Schritt-Verfahren zur intraperitonealen Injektion von Lipopolysaccharid (LPS) in Mäuse, um systemische Entzündungen zu induzieren.

Intraperitoneale Injektion von bakteriellem Lipopolysaccharid bei Mäusen zur Untersuchung systemischer Immunantworten

Dieses Video beschreibt das Verfahren zur Erzeugung eines Luftbeutels im Unterhautgewebe von Mäusen und zum Sammeln von entzündlichen Exsudaten als Reaktion auf die Verabreichung von Lipopolysacchariden in vivo. In diesem Video wird auch die Analyse der neutrophilen Infiltration im Luftbeutel behandelt.

Ein Air-Pouch-Mausmodell für die Lipopolysaccharid-induzierte entzündliche Exsudatsammlung

Das Video zeigt die Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis in einem Mausmodell durch Injektion einer Kombination aus Myelin-Oligodendrozyten-Glykoproteinen und inaktiviertem Mycobacterium tuberculosis. Das Modell ermöglicht es Forschenden, Krankheitsmechanismen zu untersuchen und therapeutische Interventionen zu testen.

Induktion einer experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis im Mausmodell

Dieses Video zeigt den Prozess der Induktion von Störungen der Blut-Hirn-Schranke (BHS) und zerebralen Mikroblutungen in einem Rattenmodell unter Verwendung von Lipopolysaccharid (LPS). Es zeigt die Abfolge von Immunantworten, die zu einer erhöhten BHS-Permeabilität und einer anschließenden Schädigung des Hirngewebes führen.

Induktion von zerebralen Mikroblutungen in einem Rattenmodell mit Lipopolysaccharid

In diesem Video wird ein Mausmodell für Multiple Sklerose mit Hilfe der experimentellen autoimmunen Enzephalomyelitis (EAE) erstellt. Der Maus wird eine Emulsion injiziert, die ein neuronales Peptid und ein Adjuvans enthält, wodurch eine Immunantwort ausgelöst wird, die autoreaktive T-Zellen aktiviert. Darauf folgt eine Injektion von Pertussis-Toxin (PTX), um die Durchlässigkeit der Blut-Hirn-Schranke zu erhöhen, so dass die autoreaktiven T-Zellen das Gehirn infiltrieren können. Diese...

Quelle: Liou, C. et al. Intrazerebroventrikuläre Verabreichung von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm bei frei beweglichen Mäusen. J. Vis. Exp. (2022).Dieses Video zeigt die intrakranielle Injektion von kurzkettigen Fettsäuren (SCFAs) in eine frei bewegliche Maus, um deren Auswirkungen auf das hirnvermittelte Verhalten zu untersuchen. Eine Injektorkanüle wird in eine Führungskanüle eingeführt, die in das Gehirn der Maus implantiert wird. Nach der Genesung akklimatisiert sich die Maus in...

Intrakranielle Injektion von mikrobiellen Metaboliten aus dem Darm in einem Mausmodell

Hier wird ein Schrittweiseverfahren vorgestellt, um akute Lungenverletzungen bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation zu induzieren und FACS-Analysen von Blutproben, Bronchoalveolar-Spülflüssigkeit und Lungengewebe durchzuführen. Minimale Invasivität, einfache Handhabung, gute Reproduzierbarkeit und Titration der Schwere der Erkrankung sind Vorteile dieses Ansatzes.

Induzieren akute Lungenschädigung bei Mäusen durch direkte intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation

In dieser Arbeit schlagen wir ein Protokoll für die intratracheale Lipopolysaccharid-Abgabe (LPS) mittels nicht-invasiver oropharyngealer endotrachealer Intubation vor. Diese Methode minimiert das Trauma des chirurgischen Eingriffs für das Tier und gibt LPS genau in die Luftröhre und dann in die Lunge ab.

Nichtinvasive intratracheale Lipopolysaccharid-Instillation bei Mäusen

Hier beschreiben wir die Konstruktion eines grundlegenden dreidimensionalen (3D) intestinalen Zelllinienmodellsystems und eines Paraffin-Einbettungsprotokolls für die lichtmikroskopische Bewertung von fixierten intestinalen Äquivalenten. Die Färbung ausgewählter Proteine ermöglicht die Analyse mehrerer visueller Parameter aus einem einzigen Experiment für den potenziellen Einsatz in präklinischen Wirkstoff-Screening-Studien.

Grundlegendes dreidimensionales (3D) Darmmodellsystem mit einer Immunkomponente

In dieser Studie wurde eine nicht-invasive endotracheale Instillationstechnik demonstriert, die ALI bei Ratten unter Verwendung eines einfachen Laryngoskops entwickelt, um eine präzise LPS-Abgabe an die Lunge sicherzustellen. Das LPS wird über ein Endotrachealrohr mit einem Laryngoskop eingebaut. Das Ausmaß der Lungenverletzung wird zu mehreren Zeitpunkten bewertet.

Nicht-invasive endotracheale Verabreichung von Lipopolysaccharid zur Auslösung akuter Lungenschäden bei Nagetieren

Lernen Sie eine LPS-Injektionsmethode bei Mäusen zur Simulation mikrobieller Produkteingabe nach Darmbarriereverletzung. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung immunologischer Reaktionen bei entzündlichen Darmerkrankungen.

Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren (Video) | JoVE Journal

Injektionen von Lipopolysaccharid in Mäuse, Eingang des mikrobiellen gewonnenen Erzeugnisse nach Darmbarriere Verletzung zu imitieren

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