Name: Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 40 s
Description: Erfahren Sie die Analyse und Modulation des intrakardialen autonomen Nervensystems im Ex-vivo-Langendorff-Setup. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Elektrophysiologie, Arrhythmogenese und cAMP-Dynamik in dezentralisierten Herzen.

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Die Autoren möchten Hartwig Wieboldt für seine hervorragenden technischen Betreuung und dem UKE Microscopy Imaging Facility (Umif) der des Universitätsklinikums Hamburg-Eppendorf für die Mikroskope und Unterstützung zu danken. Diese Forschung wurde finanzierte Bythe Förderverein des Universitären Herzzentrums Hamburg e.V. und durch das DZHK (Deutsches Zentrum für Herz-Kreislauf-Forschung) [FKZ 81Z4710141].

Alle Verfahren, die Tiere wurden von den lokalen Behörden das Hamburg, Universität Hamburg Tierbetreuung und Nutzung Ausschüsse genehmigt.
1. Vorbereitung des Apparates Langendorff
Hinweis: Ein handelsübliches Langendorff Perfusion System wird verwendet.
<ol><li>Bereiten Sie eine modifizierte Krebs-Henseleit-Lösung (119 mM von Natrium-Chlorid, 25 mM von Natriumbicarbonat, 4,6 mM Kaliumchlorid, 1,2 mM von Kalium Phosphat monobasic, 1,1 mM von Magnesiumsulfat, 2,5 mM von Kalzium-Chlorid, 8,3 mM von Glukose und 2 mM von Natrium Pyruvat). Fügen Sie ein Gemisch aus 95 % oxygen/5% Kohlendioxid zur Perfusion Lösung zu verhindern, dass Kalzium Niederschlag. Filtern Sie den Puffer mit einer Porengröße von 0,22 µm.</li>
	<li>Fügen Sie einen pharmakologischen Agenten in den Puffer zu untersuchen, ihre Wirkung auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis nach Bedarf hinzu.</li>
	<li>Starten Sie das Wasserbad und platzieren Sie die Perfusion-Lösung mit einer Mischung von 95 % oxygen/5% Kohlendioxid drin. Einstellen Sie die Temperatur des Wasserbades, so, dass die Temperatur der Perfusion Lösung direkt vor die Kanüle ~ 37 ° c ist.</li>
	<li>Starten Sie die Walze Pumpe und füllen Sie das Gerät mit der Perfusion Lösung, sobald die richtige Temperatur erreicht ist.</li>
	<li>Einstellen Sie die Pumprate vor dem Anbringen der Herzen so, dass keine Luftblasen in die Kanüle übrig sind, bei der Montage auf den Apparat.</li>
</ol>2. hard - und Software-Erstellung
<ol><li>Verbinden Sie ein digitales Datenerfassungssystem und die entsprechende Software mit Langendorff Vorrichtung für eine kontinuierliche Aufzeichnung der Perfusionsdruck, Durchfluss und Herzfrequenz.<ol>
<li>Legen Sie die gezielte Perfusionsdruck in den allgemeinen Einstellungen zu 80 MmHg.</li>
		<li>Die Aufnahme starten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Verwenden Sie einen Elektrophysiologie Katheter (Table of Materials) mit Platin-Elektroden, eine Elektrodenoberfläche von 0,5 x 0,5 mm und einer Elektrode Abstand von 0,5 mm für die Datenaufzeichnung und Anregung mit einem ausgewiesenen digitalen Impuls-Generator.<ol>
<li>Platzieren Sie den Katheter in der Nähe der Gegend, wo das Herz nach dem Anbau auf den Apparat positioniert wird.</li>
		<li>Bereiten Sie die Stimulation durch den Katheter 2 Elektroden auswählen und verwenden Sie eine Zykluslänge von 100 ms.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Vorbereitung des Herzens
<ol><li>Fügen Sie die Kälte (~ 2 bis 4 ° c) Perfusion-Puffer (10-20 mL und 40-50 mL, so dass die ganze Schüssel abgedeckt ist) 2 Petrischalen (Durchmesser von 6 cm und 10 cm) und die Schale mit der Kanüle und Stelle sie auf Eis direkt neben und unter dem Mikroskop. Bereiten Sie ein doppelknoten um die Kanüle.</li>
	<li>Verbrauchsteuern Sie schnell das Herz nach zervikale Dislokation durch Öffnen den Thorax mit Mayo Schere und Zange schmal Muster. Dann greifen Sie die Aorta und Vena Cava oberhalb des Zwerchfells mit London-Pinzette und Verbrauchsteuern des Herz-Lungen-Blocks durch Schneiden alle Gefäße und Bindegewebe in der Nähe der Wirbelsäule mit der Schere Strabismus.</li>
	<li>Übertragen Sie die Herz-Lungen-Block in die erste Schüssel (6 cm Durchmesser) mit dem eiskalten Puffer gefüllt und entfernen Sie vorsichtig die Lunge ohne Beschädigung das Herz mithilfe von Strabismus Scheren und Pinzetten London. Dann legen Sie das Herz unter dem Mikroskop und entfernen Sie vorsichtig die Thymusdrüse, die Speiseröhre und Luftröhre mit Frühling Scheren und Pinzetten Dumont SS.</li>
	<li>Verwenden Sie die Feder-Schere, schneiden Sie ein Loch von 1,5-2 mm im oberen Teil der rechten Vorhof für das Einführen des Katheters. Schneiden Sie ein Loch in die Lungenarterie. Dann schneiden Sie die Aorta direkt unter den Supraaortic Ästen und entfernen Sie das Gewebe aus der Aorta, zu, so dass der Knoten leicht angebracht werden kann.</li>
	<li>Halten Sie das Vorhofflimmern Fettpolster, darunter die großen befindet sich atrially ganglionated Plexiglas, um den linken Vorhof intakt oder vollständig zu entfernen durch sorgfältige Präparation.</li>
	<li>Übertragen Sie das Herz in die Schale mit der Kanüle zu, und legen Sie sie unter die Lupe genommen. Ziehen Sie die Aorta über die Kanüle mit der Dumont SS-Zange und binden Sie den vorbereiteten Knoten eng um die Aorta. Stellen Sie sicher, dass die Kanüle nicht zu tief in die Aorta platziert wird, so dass die Aortenklappe und die Herzkranzgefäße frei gelassen werden.</li>
	<li>Befestigen Sie die Kanüle schnell Langendorff-Apparat. Stellen Sie sicher, dass gibt es keine Luftblasen in die Kanüle Links.</li>
	<li>Wechseln Sie den Perfusionsdruck zu 80 MmHg, so dass ein konstanter Druck Perfusion.</li>
	<li>Einführen Sie den Katheter vorsichtig in den rechten Vorhof und Rechte Herzkammer ohne zu berühren oder das Herz schädigen und befestigen Sie den Katheter an der Kanüle mit Klebeband.</li>
	<li>Starten Sie die Stimulation mit den vorbereiteten Zykluslänge von 100 ms für einen anfänglichen 20 min Gleichgewichtherstellung Zeitraum.</li>
	<li>Schließen Sie die Kammer um eine gleichbleibende Temperatur zu ermöglichen.</li>
</ol>4. elektrophysiologische Parameter und Arrhythmogenesis
<ol><li>Wenden Sie eine programmierte Stimulation über die distal oder proximalen Elektroden des Katheters an zweimal das Vorhofflimmern oder ventrikuläre Tempo Schwelle, die elektrophysiologische Parameter zu bewerten, wie in den folgenden Schritten beschrieben.<ol>
<li>Bestimmen der Sinusknoten Erholungszeit als die maximale Rückkehr Zykluslänge nach 10 s festverzinsliche Tempo auf eine S1S1 Zykluslänge von 120 ms, 100 ms und 80 ms.</li>
		<li>Bestimmen Sie den Wenckebach-Punkt als die längste S1S1 Zykluslänge (8 Stimuli; S1S1: 100 ms; 2 ms schrittweise Reduktion) mit einem Verlust von 11 AV-Knoten-Leitung. Bestimmen der ventrikulären Knoten feuerfesten Perioden als die längste S1S2 (12 Stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms und 100 MS; ein kurzer gekoppelt mit 2 ms schrittweise S1S2 Extrastimulus) mit einem Verlust der AV-Knoten-Leitung.</li>
		<li>Vorhofflimmern und ventrikuläre feuerfesten Zeiträume als die längste S1S2 zu bestimmen (12 Stimuli; S1S1: 120 ms, 110 ms und 100 MS; ein kurzer gekoppelt mit 2 ms schrittweise S1S2 Extrastimulus) mit einer abwesenden Vorhofflimmern oder ventrikuläre Antwort10,11.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Führen Sie eine programmierte Extrastimulation (S1S1: 120 ms, 100 ms und 80 ms, gefolgt von bis zu 3 zusätzliche Schläge; 60-20 ms mit einer schrittweisen Reduzierung der 2 ms) oder Burst Stimulation Protokolle (5 s bei S1S1: 50 – 10 ms mit einer schrittweisen Reduzierung der 10 ms) im Einklang mit der Lambeth Konventionen Eva Zentrum der linksventrikulären Arrhythmogenesis10,11,12.</li>
</ol>5. epicardial Wärmeleitung Messungen
Hinweis: Datensatz unipolaren epicardial elektrogrammen mit einem 128-Kanal, EDV-gestützte Erfassung-System mit einer Sampling-Rate von 25 kHz für hochauflösende Kartierung. Verwenden Sie ein 32 Multi-Elektroden-Array (MEA; Inter Elektrodenabstand: 300 µm; 1,8 x 1,8 mm). Beachten Sie, dass die Daten Bandpass gefiltert (50 Hz waren) und mit 12 Bit und einer Reichweite von 20 digitalisiert mV.
<ol><li>Die MEA in dem dafür vorgesehenen Bereich des Herzens geben Sie und die Erdung zu einem anderen Teil der Herzen13,14,15.</li>
	<li>Legen Sie einen epicardial Stimulation Katheter in der Nähe der MEA und beginnen Sie eine ständige Stimulation.</li>
	<li>Aufnahme nach der Bestätigung der guten Kontakt der Elektroden durch Überprüfung der Signalqualität und Amplitude.</li>
	<li>Verwenden Sie eine offline-Analyse zur Bestimmung der Ausbreitungsgeschwindigkeit der Welle und Dispersion in Pfeilrichtung Wärmeleitung.</li>
</ol>6. Förster Resonance Energy Transfer FRET-basierte zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Bildgebung
Hinweis: Für Bund-basierten Messungen, Ernten Sie Herzen von CAG-Epac1-Lager Transgene Mäuse16.
<ol><li>Verwenden Sie eine selbstgebaute imaging-System um ein Stereomikroskop15,17.</li>
	<li>Legen Sie das Stereomikroskop vor das Herz und für Schärfe anpassen.</li>
	<li>Die cAMP-Sensor mit einer Lichtquelle zu begeistern [z. B.mit einem Einzel-Wellenlänge Licht emittierende Diode (440 nm)]. Die helle Emission in Donor und Akzeptor-Kanäle mit einem Strahlteiler (für ein paar Cyan fluoreszierenden Proteinen/gelb fluoreszierenden Proteins, Gebrauch ein 565dcxr dichroitischen Spiegel und D480/30 und D535/40 Emission Filter) aufgeteilt.</li>
	<li>Eine stabile Temperatur zu gewährleisten, indem man eine Plastikfolie um die Kammer.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder mithilfe einer wissenschaftlichen ergänzende Metall-Oxid-Halbleiter (sCMOS) Kamera. Koordinieren Sie die Lichtquelle und Kamera Bildaufnahme mit einer open-Source imaging-Software wie Micro-Manager.</li>
	<li>Um die Bildaufnahme zu starten, drücken Sie die Multi Acq. Taste und richten Sie ein Zeitraffer, die erwirbt ein Bild alle 10 s, mit den entsprechenden Belichtungszeit, die Stärke das Fluoreszenzsignal (ca. 100 ms) abhängt.</li>
	<li>Verwenden Sie die zuvor beschriebenen und verfügbar online Bund und Bund Online-2 Plugins17 teilen das Bild in zwei Kanäle, wählen die Regionen von Interesse, und überwachen die Verhältnis-Ablaufverfolgung.</li>
	<li>Perfundieren Sie bei der Übernahme Herzen mit der modifizierten Krebs-Henseleit-Lösung, die verschiedene Stoffe enthalten, abhängig von der Art des Experiments.</li>
	<li>Am Ende des Experiments die Übernahme durch Drücken der Stop -Taste schalten Sie aus und sparen Sie den Stapel von Bildern.</li>
	<li>Analysieren Sie die Bund-Daten offline auf eine dedizierte Analysesoftware, die kann Bilder in zwei identische Abschnitte für die Spender und Akzeptor-Kanäle aufgeteilt und kann in mehreren Regionen von Interesse Bund-Analyse durchführen. Hinweis: Eine spezielle Plug-in (ÄRGERN Sie sich offline) wird benötigt, hat Sprenger Et Al. , 17.<ol>
<li>Starten Sie die Software. Die Analyse zu öffnen, indem Sie auf das Menü Plugins , dann klicke auf Mittelmanagement, und dann auf Datei öffnen Micro-Manager.</li>
		<li>Führen Sie das ÄRGERN Sie sich offline Plugin um den Zeitraffer in zwei identische Bilder für die CFP und YFP Kanäle aufgeteilt.</li>
		<li>Verwenden Sie das Freihand-Auswahl -Werkzeug des Interessenbereichs im YFP Bild markieren. Drücken Sie die Schaltfläche " Hinzufügen ", um die Auswahl der Fenster " Multi " hinzuzufügen.</li>
		<li>Wählen Sie die Region von Interesse in das Fenster " Multi " und drücken Sie Multi , eine Tabelle mit grauen Mittelwerte für jeden Frame und Region zu erhalten. Kopieren Sie und fügen Sie die Daten in einer Excel-Tabelle.</li>
		<li>Klicken Sie auf den GFP-Bildstapel. Führen Sie die gleichen Aktionen wie in Schritt 6.10.4 für den GFP-Stack und fügen Sie die mittleren Grauwerte in der gleichen Excel-Tabelle ein.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Korrigieren Sie die raw-Daten offline für den Faktor durchscheinen des Spenders in den Akzeptor Kanal17.<ol>
<li>Verwenden Sie die folgende Formel, wo B ist der durchscheinen-Faktor: Ratio = (YFP - B-X CFP) / GFP</li>
		<li>Durchbluten Faktor B von imaging ein Herz mit dem Ausdruck nur GFP bestimmen und messen den Prozentsatz der Spender Fluoreszenz im YFP Kanal (B = YFP / GFP).</li>
	</ol>
</li>
</ol>(7) Neuromorphology
Hinweis: Analysieren Sie die intrakardiale vegetative Nervensystem mithilfe vollständig-hängen Immunostainings intakt murinen Herzen. Beachten Sie, dass die Mehrheit der intrakardialen Ganglien im epicardial Fettgewebe in der Nähe der Lungenvenen lokalisiert sind.
<ol><li>Verwenden Sie unterschiedliche Färbungen für die Darstellung der Neurofilamente (allgemeine neuronalen Strukturen, Huhn Anti-NF-H, 1:3 000), Tyrosin-Hydroxylase (TH, sympathischen neuronalen Strukturen, Kaninchen α TH, 1:1 000) und Cholin-Acetyltransferase (ChAT, parasympathischen neuronalen Strukturen; Ziege α ChAT, 01:50).</li>
	<li>Beheben Sie nach der Durchblutung in den Apparat Langendorff die Mäuseherzen in 10 mL Formalin für 24 h und an Phosphat gepufferte Kochsalzlösung (PBS) bei 4 ° c aufbewahren.</li>
	<li>Die Herzen in Dent Bleichmittel Bleichen (4:1:1 Methanol: Wasserstoffperoxid-Lösung 30 % (w/w) in H2o: Dimethyl Sulfoxid (DMSO)) für 1 Woche bei 4 ° c und rehydrieren sie anschließend auf PBS in einer Reihe von Methanol in PBS absteigend (100 %, 75 %, 50 %, 25 %; 1 h) 18.</li>
	<li>Führen Sie die folgenden Inkubationen in einer 24-Well-Platte-Format mit einer sanften Agitation bei 4 ° c:<ol>
<li>Permeabilize die Herzen in 1 % Triton-X-100/PBS (PBS-T) für 3 x 1 h bei Raumtemperatur vor dem Blockieren sie über Nacht in einem blockierenden Puffer [5 % Rinderserumalbumin (BSA) / PBS-T + 0,2 % Natriumazid].</li>
		<li>Verdünnen Sie die Antikörper wie folgt: Ziege α ChAT (01:50), Kaninchen α TH (1:1 000), Huhn α Neurofilamente (1:3 000); sekundäre Antikörper zur Kennzeichnung von Leuchtstofflampen (1: 500; oder nach den Anweisungen des Herstellers); biotinylierte Sekundärantikörper chromogenen Kennzeichnung (1: 200; oder nach den Anweisungen des Herstellers).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Inkubieren Sie die Exemplare in Primärantikörper verdünnt in einem blockierenden Puffer für 1 Woche bei 4 ° c.</li>
	<li>Waschen Sie die Herzen für 3 x 15 min in PBS-T vor der Sekundärantikörper Inkubation in einem blockierenden Puffer für 4 Tage.</li>
	<li>Waschen Sie die Herzen für 3 x 15 min in PBS-T und an einem Eindeckmittel für fluoreszierende Färbung für 3 h bei Raumtemperatur bewahren Sie auf oder verwenden Sie eine Avidin-Biotin-Komplex Erkennung-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers.</li>
	<li>Pre-inkubieren Sie die Herzen für 1 Stunde in einem kommerziellen Puffer für 3, 3'-Diaminobenzidine (DAB), bevor sie unter Sichtkontrolle in einem DAB-haltigen Puffer entsprechend den Anweisungen des Herstellers zu entwickeln.</li>
	<li>Speichern Sie die Exemplare in doppelt destilliertem Wasser.</li>
	<li>Für Paraffin Abschnitte entwässern und die Herzen in Paraffin einbetten.<ol>
<li>4 µm Dicke Abschnitte schneiden und deparaffinize sie nach Routine Laborverfahren. Ob und wie Antigen-Retrieval durchgeführt werden muss, muss für jedes einzelnen Setup festgelegt werden, da es die Antikörper-Kombination abhängig.</li>
		<li>Die Abschnitte für 10 min in 0,2 % Triton-X-100/Tris-gepufferte Kochsalzlösung (TBS), gefolgt von 3 x 5 min Wäschen in El permeabilize</li>
		<li>Blockieren sie mit 3 % BSA/TBS für 1 h bei Raumtemperatur.</li>
		<li>Brüten sie über Nacht bei 4 ° c [Primärantikörper: Ziege α ChAT (01:50), Kaninchen α TH (1: 500), Huhn α Neurofilamente (1:1 000)] oder 2 h bei Raumtemperatur (Fluoreszenz-markierten Sekundärantikörper, 1: 500) in 1 % BSA/TBS mit 3 x 5 min TBS dazwischen wäscht.</li>
		<li>1 µg/mL Bisbenzimide H33342 Trihydrochloride der Sekundärantikörper Projektmappe hinzufügen oder eine andere nukleare Färbung Methode verwenden.</li>
		<li>Montieren Sie die Folien in einem Eindeckmittel für fluoreszierende Färbung.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Manuskript ist das bekannte Langendorff ex Vivo Herz Perfusion System als Instrument zur Untersuchung der Auswirkungen von intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis mit unterschiedlichen Mapping und stimulationstechniken vorgestellt. einschließlich endokardialen und epicardial Ansätze.
Mehrere Teile des Protokolls sind entscheidend für das Setup. Erstens ist es wichtig, eine Vorbereitung Technik zu verwenden, in der das Vorhofflimmern Fettp...

Langendorff ex Vivo Herz Perfusion System weiter zu einem wichtigen Instrument für die Durchführung eines breiten Spektrums an morphologische, physiologische, Biochemische und pharmakologische Studien in Zentral denervierten Herzen1,2 ,3,4,5 seit ihrer Erfindung in den späten 19th Jahrhundert6. Bis heute ist dieses System noch weit verbreitet zu verschiedenen Themen (zB., Ischämie Reperfusion) oder zum Studium Herz-pharmakologische Effekte7,8, und ist ein grundlegendes Instrument in der Herz-Kreislauf-Forschung. Die Langlebigkeit dieser Methode ergibt sich aus mehrere Vorteile (zB., Messungen ohne den Einfluss des zentralen Nervensystems oder anderer Organe, systemischen Kreislauf oder zirkulierenden Hormone). Bei Bedarf können Arzneimittel kontrolliert Perfusion Puffer hinzugefügt oder direkt an bestimmte Strukturen angewendet werden. Experimente sind reproduzierbar und eine relativ hohe Anzahl von Experimenten kann in kurzer Zeit durchgeführt werden. Die (teilweise) offene Natur des Setups machen Temperaturregulierung schwierig und muss berücksichtigt werden. Obwohl das Langendorff-System auch in größeren Arten9verwendet wird, kleinere Tiere dienen in erster Linie als der experimentelle Aufbau weniger komplex und eine größere biologische Variabilität ist (zB., transgenen Maus Modelle) verwendet werden.
In der Versuchsanordnung dieses Protokolls ist der Einfluss des intrakardialen Nervensystem auf elektrophysiologische Grundparameter, ventrikuläre Arrhythmogenesis, epicardial Wärmeleitung und zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Dynamik ausgewertet. Eine große Anzahl von intrakardialen Ganglien, die befinden sich hauptsächlich in der atrial Fettpolster und sind nun bekannt, kardiale Elektrophysiologie unabhängig von zentralen neuronalen Kontrolle zu kontrollieren, sind entweder intakt oder manuell entfernt mit sorgfältigen mechanischen Links Dissektion. Eine pharmakologische Modulation des autonomen Nervensystems wird weltweit durch Zugabe von Arzneimitteln auf den Puffer, Perfusion oder lokal durch gezielte Modulation von Vorhofflimmern Ganglien durchgeführt. Nach den Experimenten sind die Herzen gut geeignet für eine immunohistologische Bewertung, wie alle Blutzellen durch die kontinuierliche Perfusion entfernt worden sind, die wodurch die Qualität der Färbung erhöht werden kann.
Das übergeordnete Ziel der beschriebenen Techniken ist es, neuartige Perspektiven für detaillierte Studien über die Auswirkungen des autonomen Nervensystems auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis im Herzen Maus bieten. Ein Grund für die Verwendung dieser Technik ist, dass es möglich ist, zu studieren und das vegetative Nervensystem ohne Auswirkungen auf das zentrale Nervensystem zu ändern. Ein großer Vorteil ist die einfache Beschäftigung pharmakologische Experimente, in welche möglichen pro- oder antiarrhythmische Eigenschaften des alten und neuen Agenten können getestet werden. Darüber hinaus stehen transgenen und Knockout Maus-Modellen der verschiedenen Herzerkrankungen untersuchen die Mechanismen, Herzrhythmusstörungen, Herzinsuffizienz oder Stoffwechselerkrankungen. Dieser Ansatz wurde erweitert unser Verständnis der Auswirkungen des autonomen Nervensystems auf das Vorhofflimmern Niveau auf ventrikulären kardialen Elektrophysiologie und die Induktion von Arrhythmien.

<table><tbody><tr><td>Natriumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S3014</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td></tr><tr><td>Natriumhydrogencarbonat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>401676</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5405</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td></tr><tr><td>Kaliumphosphat monobasisch</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5655</td><td>Modifiziertes Krebs-Henleit Lösung</td></tr><tr><td>Magnesiumsulfat-Heptahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td></tr><tr><td>Calciumchlorid-Dihydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G5767</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td></tr><tr><td>Natriumpyruvat bioXtra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8574</td><td>Modifiziertes Krebs-Henleit Lösung</td></tr><tr><td>Carbogen (95% O2 / 5% CO2)</td><td>SOL-Group, TMG Technische und Medizinische Gas GmbH, Krefeld, Gersthofen, Deutschland</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td><td></td></tr><tr><td>Sterilfilter Steritop-GP 0,22</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPT05RE</td><td>Modifizierte Krebs-Henleit-Lösung</td></tr><tr><td>Atropinsulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0257</td><td>Neuromodulation</td></tr><tr><td>Hexamethoniumchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H2138</td><td>Neuromodulation</td></tr><tr><td>Nikotinfreie Base 98-100%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N3876</td><td>Neuromodulation</td></tr><tr><td>Formalinlösung neutral gepuffert 10%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HT501128</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethan</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34860</td><td>Ganzfassungsfärbung</td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxidlösung 30% (w/w) in H2O</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Deutschland</td><td>H1009</td><td>Ganzfassungsfärbung</td></tr><tr><td>Dimethylsulfoxid</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Deutschland</td><td>D8418</td><td>Ganzfassungsfärbung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalztabletten</td><td>Gibco / Invitrogen</td><td>18912-014</td><td>Ganzfassungsfärbung</td></tr><tr><td>Triton-x-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>Albumin Rinderfraktion V</td><td>Biomol, Hamburg, Deutschland</td><td>11924.03</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>Chicken Anti Neurofilament</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>Kaninchen Anti-Tyrosin-Hydroxylase</td><td>EMD Millipore</td><td>AB152</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>Ziege Anti-Cholin Acetyltransferase</td><td>EMD Millipore</td><td>AP144P</td><td>Ganzfassungsfärbung</td></tr><tr><td>Esel & Alpha Kaninchen IgG Alexa 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21206</td><td>Ganzfassung Färbung</td></tr><tr><td>Esel & Alpha Ziege IgG Alexa 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11057</td><td>Ganzfassung Färbung</td></tr><tr><td>Esel & Alphatier IgY Alexa 647</td><td>Merck, KGA, Darmstadt, Deutschland</td><td>AP194SA6</td><td>Ganzes Eintierfärbung</td></tr><tr><td>Biotin-konjugierter Esel & Alpha Kaninchen igG</td><td>R& D Systems</td><td>AP182B</td><td>Ganzfassungsfärbung</td></tr><tr><td>Biotin-konjugierter Esel & Alpha-Ziege igG</td><td>R& D Systems</td><td>AP192P</td><td>Ganzlafetten-Färbung</td></tr><tr><td>Biotin-konjugierte Ziegen & Alpha-Hühner igY</td><td>R& D Systems</td><td>BAD010</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>Vectashield Einbettmedium</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, USA</td><td>H-1000</td><td>Immunhistochemie</td></tr><tr><td>Vectastain ABC kit</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, USA</td><td>PK-4000</td><td>Immunhistochemie</td></tr><tr><td>Steady DAB/Plus</td><td>Abcam plc, Cambridge, UK</td><td>ab103723</td><td>Whole Mount Färbung</td></tr><tr><td>HistoClear</td><td>DiaTec, Bamberg, Deutschland</td><td>HS2002</td><td>Immunhistochemie</td></tr><tr><td>BisBenzimid H33342 Trihydrochlorid (Hoechst)</td><td>Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA</td><td>B2261</td><td>Immunhistochemie</td></tr><tr><td>Vectashield HardSet Eindeckmedium</td><td>Vector laboratories, Burlingame, CA, USA</td><td>VEC-H-1400</td><td>Immunhistochemie</td></tr><tr><td>Perfusionssystem</td><td>HUGO SACHS ELEKTRONIK - HARVARD APPARATUS GmbH, March-Hugstetten, Deutschland</td><td>&nbsp; 73-4343</td><td>Langendorff-Apparatur</td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem und entsprechende Software für Katheter und physiologische Parameter</td><td>Powerlab 8/30 & Labchart, ADInstruments, Dunedin, Neuseeland</td><td>PL3508 PowerLab 8/35</td><td>Langendorff-Einrichtung</td></tr><tr><td>Octapolarer Katheter</td><td>CIB' ER Mouse, NuMed Inc., Hopkinton, NY, USA</td><td>kundenspezifisches</td><td>Langendorff-Setup</td></tr><tr><td>Stimulus Generator</td><td>STG4002, Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland</td><td>STG4002-160&micro; A</td><td>Stimulationsaufbau</td></tr><tr><td>Stimulationssoftware</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland</td><td>MC_Stimulus II</td><td>Stimulationsaufbau</td></tr><tr><td>Datenerfassungssystem und entsprechende Software für epikardiale Elektrogramme</td><td>ME128-FAI-MPA-System, Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland</td><td>USB-ME128-System</td><td>MEA-Aufbau</td></tr><tr><td>Multielektrodenarray</td><td>MEA, EcoFlexMEA36, Mehrkanalsysteme, Reutlingen, Deutschland</td><td>EcoFlexMEA36</td><td>MEA-Einrichtung</td></tr><tr><td>Multi-Elektroden-Array-Aufzeichnungssoftware</td><td>Multi Channel Systems, Reutlingen, Deutschland</td><td>MC_Rack</td><td>MEA-Einrichtung</td></tr><tr><td>Federschere</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>15003-08</td><td>Herzaufbereitung</td></tr><tr><td>Strabismusschere</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>14575-09</td><td>Herzvorbereitung</td></tr><tr><td>Mayo Scissors</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>14110-15</td><td>Herzpräparation</td></tr><tr><td>Dumont SS Pinzette</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>11203-25</td><td>Herzaufbereitung</td></tr><tr><td>London Forceps</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>11080-02</td><td>Herzpräparation</td></tr><tr><td>Narrow Pattern Pinzette</td><td>Fine Science Tools GmbH, Heidelberg, Deutschland</td><td>11003-13</td><td>Vorbereitung des Herzens</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>M, Bemis, NA, mit Sitz in Neenah, WI, USA</td><td></td>, Stereomikroskop für <td>Verbrauchsmaterialien</td></tr><tr><td></td><td>Leica M165FC; Leica Microsystems GmbH, Wetzlar, Deutschland</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>LED</td><td>CoolLED, Andover, UK</td><td>pE-100</td><td>FRET</td></tr><tr><td>DualView</td><td>Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>DV2-SYS</td><td>FRET</td></tr><tr><td>DualView Filterset</td><td>Photometrics, Tucson, AZ, USA</td><td>05-EM</td><td>FRET</td></tr><tr><td>optiMOS wissenschaftliche CMOS-Kamera</td><td>Qimaging, Surrey, BC, Kanada</td><td>01-OPTIMOS-R-M-16-C</td><td></td></tr><tr><td>FRET Imaging Software &nbsp;</td><td>Mikromanager; Vale Lab, Universität von Kalifornien San Francisco, CA, USA</td><td></td><td>FRET</td></tr><tr><td>Analysesoftware</td><td>Image J Software; Public Domain, NIH, USA</td><td></td><td>FRET</td></tr></tbody></table>

auswirkungen der intrakardialen neuronen auf kardiale elektrophysiologie und arrhythmogenesis in einem ex-vivo -langendorff-system

Impact of Intracardiac Neurons on Cardiac Electrophysiology and Arrhythmogenesis in an Ex Vivo Langendorff System

Seit seiner Erfindung imspäten 19 Jahrhundert weiter Langendorff ex Vivo Herz-Perfusions-System zu einem wichtigen Instrument für das Studium eines breiten Spektrums an physiologische, biochemische, morphologische und pharmakologischen Parameter in Zentral denervierten Herzen. Hier beschreiben wir eine Setup für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und zyklische Adenosin Monophosphate (cAMP) Dynamik. Die intrakardiale vegetative Nervensystem moduliert durch die mechanische Zerlegung von Vorhofflimmern Fett Pads-in welche murinen Ganglien sich hauptsächlich befinden — oder durch die Nutzung des globalen sowie gezielte pharmakologische Interventionen. Ein Octapolar elektrophysiologische Katheter wird in den rechten Vorhof und der rechten Herzkammer eingeführt, und epicardial platziert Multi-Elektroden (MEA) für hochauflösende Abbildung dienen, kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis zu bestimmen. Förster Resonanz Energietransfer (FRET) imaging wird für die Echtzeit-Überwachung von cAMP Ebenen in verschiedenen kardialen Regionen durchgeführt. Neuromorphology wird untersucht mittels Antikörper-basierten Färbung von ganzem Herzen mit neuronalen Marker, um die Identifikation und Modulation der spezifischen Ziele des intrakardialen Nervensystem in den durchgeführten Studien zu führen. Das ex-Vivo Langendorff Setup ermöglicht eine hohe Anzahl von reproduzierbare Experimente in kurzer Zeit. Dennoch, der teilweise offene Charakter des Setups (zB., während MEA Messungen) Konstante Temperaturregelung erschwert und sollte auf ein Minimum gehalten werden. Das beschriebene Verfahren ermöglicht es, zu analysieren und zu modulieren die intrakardiale vegetative Nervensystem in dezentralen Herzen.

Abbildung 1 zeigt ein Bild von Langendorff Setup inklusive 2 Multi-Elektroden (MEAs). Vor dem Experiment ist der intrakardiale Katheter positioniert, in der Nähe der Kanüle, eine schnelle und einfache Einfügung in den rechten Atrium/rechten Ventrikel zu erleichtern und eine kurze Zeit bis die Gleichgewichtherstellung anfangen kann zu gewährleisten. Der untere Teil der Kammer kann (siehe die Pfeile in Abbildung 1) erhöht werden da...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für die Modulation der intrakardialen vegetative Nervensystem und die Bewertung ihres Einflusses auf grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenesis und Lager Dynamik mit einem ex-Vivo Langendorff Setup.

Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System

Since its invention in the late 19th century, the Langendorff ex vivo heart perfusion system continues to be a relevant tool for studying a broad spectrum ...

Das übergeordnete Ziel dieses ex vivo Langendorff-Aufbaus ist es, das intrakardiale autonome Nervensystem zu analysieren und zu modulieren und seinen Einfluss auf die grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenese und cAMP-Dynamik in dezentralen Herzen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, das intrakardiale Nervensystem in dezentralen Herzen zu analysieren und zu modulieren. Obwohl diese Methode Einblicke in gesunde Herzen geben kann, haben wir erste Hinweise darauf erhalten, dass dieser Ansatz auch zur Untersuchung verschiedener Formen von strukturellen Herzerkrankungen verwendet werden kann.Beginnen Sie damit, das Wasserbad zu starten und die Perfusionslösung mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid darin zu platzieren. Stellen Sie dann die Pumprate ein, bevor Sie das Herz anbringen, so dass bei der Montage an der Apparatur keine Luftblasen in der Kanüle zurückbleiben. Stellen Sie in den allgemeinen Einstellungen den angestrebten Perfusionsdruck auf 80 Millimeter Quecksilbersäule ein und starten Sie die Aufnahme.Verwenden Sie für die Datenaufzeichnung und Stimulation mit einem dafür vorgesehenen digi

impact-intracardiac-neurons-on-cardiac-electrophysiology

Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Quelle: Jungen, C., et al. Einfluss intrakardialer Neuronen auf die kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenese in einem ex vivo Langendorff-System. J. Vis. exp. (2018). Das Video zeigt eine ex vivo-Technik zur Stimulation des intrakardialen Nervensystems, um die Anfälligkeit des Herzens für Herzrhythmusstörungen zu beurteilen. Mit Hilfe eines Perfusionsapparaturs wird ein isoliertes Mausherz mit einem sauerstoffhaltigen Puffer perfundiert. Das intrakardiale Nervensystem wird dann mit hoher...

Stimulation des intrakardialen Nervensystems zur Beurteilung der Anfälligkeit für Herzrhythmusstörungen

Hier beschreiben wir die Herstellung von lebensfähigen ventrikulären Scheiben von erwachsenen Mäusen und deren Verwendung für scharfe Elektroden-Aktionspotentialaufnahmen. Diese multizellulären Präparate bieten eine konservierte in vivoähnliche Gewebestruktur, die sie zu einem wertvollen Modell für elektrophysiologische und pharmakologische Studien in vitro macht .

Murine Kurze Axis Ventrikuläre Herzscheiben für elektrophysiologische Studien

Ziel dieser Studie war es, eine Methode zur Untersuchung der Herzdynamik anhand eines translationalen Tiermodells zu etablieren. Der beschriebene experimentelle Ansatz beinhaltet eine duale Emissions-Optokardiographie in Verbindung mit einer elektrophysiologischen Studie zur Beurteilung der elektrischen Aktivität in einem isolierten, intakten Schweineherzmodell.

Optokardiographie und Elektrophysiologie Studien an Ex Vivo Langendorff-perfundierten Herzen

Dieses Protokoll beschreibt das Verfahren zum Schneiden und Kultivieren menschlicher Herzscheiben für präklinische Arzneimitteltests und beschreibt die Verwendung von optischen Kartierungen zur gleichzeitigen Aufzeichnung von Transmembranspannung und intrazellulären Calciumsignalen aus diesen Scheiben.

Präklinische Kardiale Elektrophysiologie Bewertung durch Dual Voltage und Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Dieses Protokoll zielt darauf ab, eine neue Methodik zur Messung der intrinsischen Herzfeuerrate zu beschreiben, indem Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung des gesamten Sinusknotengewebes verwendet wird, um Schrittmacherfehler bei Mäusen zu identifizieren. Pharmakologische Wirkstoffe können auch in diese Methode eingeführt werden, um ihre Auswirkungen auf die intrinsische Schrittmacherei zu untersuchen.

Mikroelektroden-Array-Aufzeichnung der Sinoatrialknoten-Feuerrate zur Identifizierung intrinsischer Herzschrittmacherfehler bei Mäusen

Das vorliegende Protokoll beschreibt Methoden zur Transgenexpression in Ratten- und Mausherzen durch direkte intramyokardiale Injektion des Virus unter echokardiographischer Leitung. Methoden zur Beurteilung der Anfälligkeit des Herzens für ventrikuläre Arrhythmien durch die programmierte elektrische Stimulation isolierter, Langendorff-durchbluteter Herzen werden hier ebenfalls erläutert.

Virale Transgenexpression in Nagetierherzen und die Bewertung des Risikos für Herzrhythmusstörungen

Die Kombination aus Laserporation und Mikroelektrodenarrays (MEA) ermöglicht aktionspotentialartige Aufnahmen von kultivierten Primär- und Stammzell-abgeleiteten Kardiomyozyten. Die Wellenformform bietet einen besseren Einblick in die Wirkungsweise von Testverbindungen als Standardaufzeichnungen. Es verbindet Patch-Clamp und MEA-Anzeige, um die kardiosichere Forschung in Zukunft weiter zu optimieren.

Laserinduzierte Aktionspotential-ähnliche Messungen von Kardiomyozyten an Mikroelektrodenarrays für erhöhte Vorhersagbarkeit der Sicherheitspharmakologie

Dieses Protokoll veranschaulicht ein Verfahren zur optogenetischen Stimulation von intrinsischen Herzneuronen in transgenen Mausherzen. Der beschriebene Ansatz wird verwendet, um die Kinetik der plötzlichen Aktivierung von Herzneuronen in ex vivo perfundierten Herzen und die Wechselwirkungen zwischen cholinerger und katecholaminerger Aktivität zu untersuchen.

Optogenetische Aktivierung von intrinsischen kardialen autonomen Neuronen in exzidierten perfundierten Mausherzen

Wir beschreiben ein Protokoll für die extrazelluläre Aufzeichnung der spinalen Mehrkanal neben der Aufzeichnung der Herzfunktion und der Analyse der kardialgesperrten Neuronen des Spinalhorns. Diese Methode bietet einen zeitlich synchronisierten Rahmen für die Untersuchung der Wirbelsäulenmechanismen, die den durch Akupunktur induzierten viszeralen Funktionsveränderungen des Brustkorbs zugrunde liegen.

Untersuchung der kodierenden Profile der somatischen Stimulation auf kardio-gesperrte neuronale Reaktionen im Spinalhorn der Ratte

Dieses Protokoll beschreibt fortschrittliche Materialherstellungs- und ex vivo-Methoden am Rattenherzen für optische und elektrische bidirektionale Bioschnittstellen, die eine präzise Herzstimulation, Aufzeichnung und Infarktmodellierung für die bioelektronische Forschung ermöglichen.

Bidirektionale elektrische und optoelektronische Grenzflächen in gesunden und ischämischen ex vivo Rattenherzen

Erfahren Sie die Analyse und Modulation des intrakardialen autonomen Nervensystems im Ex-vivo-Langendorff-Setup. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Elektrophysiologie, Arrhythmogenese und cAMP-Dynamik in dezentralisierten Herzen.

Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System (Video) | JoVE Journal

Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System

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