Auswirkungen der intrakardialen Neuronen auf kardiale Elektrophysiologie und Arrhythmogenesis in einem Ex-Vivo -Langendorff-System

Das übergeordnete Ziel dieses ex vivo Langendorff-Aufbaus ist es, das intrakardiale autonome Nervensystem zu analysieren und zu modulieren und seinen Einfluss auf die grundlegende Elektrophysiologie, Arrhythmogenese und cAMP-Dynamik in dezentralen Herzen zu bewerten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es den Forschern ermöglicht, das intrakardiale Nervensystem in dezentralen Herzen zu analysieren und zu modulieren. Obwohl diese Methode Einblicke in gesunde Herzen geben kann, haben wir erste Hinweise darauf erhalten, dass dieser Ansatz auch zur Untersuchung verschiedener Formen von strukturellen Herzerkrankungen verwendet werden kann.

Beginnen Sie damit, das Wasserbad zu starten und die Perfusionslösung mit einer Mischung aus 95 % Sauerstoff und 5 % Kohlendioxid darin zu platzieren. Stellen Sie dann die Pumprate ein, bevor Sie das Herz anbringen, so dass bei der Montage an der Apparatur keine Luftblasen in der Kanüle zurückbleiben. Stellen Sie in den allgemeinen Einstellungen den angestrebten Perfusionsdruck auf 80 Millimeter Quecksilbersäule ein und starten Sie die Aufnahme.

Verwenden Sie für die Datenaufzeichnung und Stimulation mit einem dafür vorgesehenen digitalen Stimulusgenerator einen elektrophysiologischen Katheter mit Platinelektroden, einer Elektrodenfläche von 0,5 x 0,5 Millimetern und einem Elektrodenabstand von 0,5 Millimetern. Platzieren Sie dann den Katheter in der Nähe des Bereichs, in dem das Herz nach der Befestigung am Gerät positioniert wird. Befestigen Sie dann die Kanüle schnell an der Langendorff-Apparatur und stellen Sie sicher, dass keine Blasen in der Kanüle zurückbleiben.

Schalten Sie den Perfusionsdruck auf 80 Millimeter Quecksilbersäule um, was eine konstante Druckperfusion ermöglicht. Führen Sie den Katheter vorsichtig in den rechten Vorhof und die rechte Herzkammer ein, ohne das Herz zu berühren oder zu beschädigen, und befestigen Sie den Katheter mit Klebeband an der Kanüle. Beginnen Sie dann die Stimulation mit der vorbereiteten Zykluslänge von 100 Millisekunden für eine anfängliche 20-minütige Äquilibrierungsperiode.

Schließen Sie abschließend die Kammer, um eine stabile Temperatur zu ermöglichen. Beginnen Sie mit einer programmierten Stimulation über die distalen oder proximalen Elektroden des Katheters bei doppelter atrialer oder ventrikulärer Stimulationsschwelle, um die elektrophysiologischen Parameter zu bewerten. Führen Sie dann eine programmierte Extrastimulation oder Burst-Pacing-Protokolle in Übereinstimmung mit den Lambeth-Konventionen durch, um die ventrikuläre Arrhythmogenese zu bewerten.

Platzieren Sie als Nächstes das Multi-Elektroden-Array MEA in dem dafür vorgesehenen Bereich des Herzens und fügen Sie die Erdung an einem anderen Teil des Herzens hinzu. Platzieren Sie einen epikardialen Stimulationskatheter in der Nähe des MEA und beginnen Sie mit einer konstanten Stimulation. Starten Sie schließlich die Aufnahme, nachdem Sie den guten Kontakt der Elektroden bestätigt haben, indem Sie die Signalqualität und die Amplitude überprüfen.

Platzieren Sie das Stereomikroskop zunächst mit einem selbstgebauten Bildgebungssystem um ein Stereomikroskop herum und stellen Sie es auf die Sehschärfe ein. Regen Sie den cAMP-Sensor mit einer Lichtquelle an und teilen Sie das Emissionslicht mit einem Strahlteiler in Donor- und Akzeptorkanäle auf. Nehmen Sie Bilder mit einer wissenschaftlichen komplementären Metall-Oxid-Halbleiter-Kamera (sCMOS) auf.

Starten Sie als Nächstes die Bildaufnahme, indem Sie die Multi-D-Acq.-Taste drücken und einen Zeitraffer einrichten, der alle 10 Sekunden ein Bild mit der entsprechenden Belichtungszeit aufnimmt, abhängig von der Stärke des Fluoreszenzsignals. Verwenden Sie dann die zuvor beschriebenen und verfügbaren Plugins FRET Online und FRET Online 2, um das Bild in zwei Kanäle aufzuteilen, die interessierenden Bereiche auszuwählen und die Verhältnisverfolgung zu überwachen.

Während der Einnahme wird das Herz mit einer modifizierten Krebs-Henseleit-Lösung durchblutet, die verschiedene Substanzen enthält. Schalten Sie dann am Ende des Experiments die Aufnahme aus, indem Sie die Stopp-Taste drücken, und speichern Sie den Bildstapel. Analysieren Sie schließlich die FRET-Daten offline mit einer speziellen Analysesoftware, die Bilder in zwei identische Abschnitte für den Donor- und den Akzeptorkanal aufteilen und FRET-Analysen in mehreren Interessenbereichen durchführen kann.

Auf diesen Ganztagsfärbungen sind Teile des vegetativen Nervensystems abgebildet. Eine exemplarische Vergrößerung eines immunhistochemisch gefärbten Vorhofganglions zeigt die überwiegend parasympathischen Zellen in rot, verglichen mit weniger zahlreichen sympathischen Zellen, die in grün dargestellt sind. Bei repräsentativen immunhistochemischen Färbungen verlaufen die Nervenfasern von den Vorhöfen über den Koronarsinus in Richtung der hinteren Ventrikel mit sympathischer Prädomine.

Beispielhafte Fasern sind durch Pfeilspitzen gekennzeichnet. Hier wird die Empfindlichkeitsprüfung der ventrikulären Arrhythmie über die Elektroden im RV vorgestellt. Die Induktion einer ventrikulären Tachykardie im Herzen trat nach partieller Vorhofdenervation häufiger auf.

Darüber hinaus ist in diesem Versuchsaufbau eine globale sowie lokale topische Anwendung von Arzneimitteln problemlos möglich. Nach der Perfusion des Adenylylcyclase-Aktivators zur Erhöhung des cAMP-Spiegels wurde Nikotin angewendet, um den cAMP-Spiegel akut zu senken. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, die Verfahrenszeit auf ein Minimum zu beschränken und die Länge zwischen den Experimenten auf eine vergleichbare Länge zu beschränken.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie den Einfluss des intrakardialen autonomen Nervensystems auf die kardiale Elektrophysiologie, Arrhythmogenese und cAMP-Dynamik in einem ex vivo Langendorff-Setup untersuchen können.