Ein Protokoll der degenerativen Tenocyte von Menschen zu erwerben

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen zur Biologie der degenerativen Tenozyten beim Menschen zu beantworten, da nur wenige Studien die Isolierung und Kultur der degenerativen Tenozyten beim Menschen im Detail beschrieben haben. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass wir menschliche degenerative Tenozyten ohne zusätzliche Verletzungen des Patienten gewinnen können, da das degenerative Gewebe während der Standard-Epicondylitis-Operation erworben wird. Die Prozedur wird von Dr. Soo-Hong Han, Minjung Baek und Hyung Kyung Kim aus meiner dritten Stufe demonstriert.

Um eine degenerative Tendocyten-Gewebeprobe zu entnehmen, verwenden Sie ein chirurgisches Skalpell mit der Nummer 15, um einen drei bis fünf Zentimeter langen Hautschnitt direkt anterior medial des Epicondylus lateralis und proximal auf Höhe des Gelenks vorzunehmen, um den lateralen Ellenbogen freizulegen und den Extensor carpi radialis longus visuell in der Extensoraponeurose-Schnittstelle zu lokalisieren. Mit dem Skalpell einen zwei bis drei Millimeter tiefen Spaltschnitt zwischen dem Extensor carpi radialis longus und der Extensoraponeurose an der Grenzfläche vornehmen. Nach der vorderen Retraktion des Extensor carpi radialis longus lokalisieren Sie das pathologische degenerative Gewebe anhand seiner charakteristischen stumpfen gräulichen Farbe und des typischerweise ödematösen und brüchigen Gewebes und verwenden Sie das Skalpell und die Miniklingen, um das gesamte degenerative Gewebe vorsichtig, aber scharf zu resezieren.

Wenn das gesamte Gewebe entnommen wurde, verschließen Sie die Wunde mit nicht resorbierbarem Nahtmaterial gemäß den Standardprotokollen und entfernen Sie vorsichtig das gesamte umgebende Gewebe aus einem etwa einen Kubikzentimeter großen Stück Gewebeprobe, indem Sie das saubere Sehnengewebe in 10 Milliliter PBS legen, sobald es getrimmt wurde. Fixieren Sie dann etwa die Hälfte des entnommenen Gewebes in neutral gepuffertem 10%igem Formalin in einem chemischen Abzug für 12 Stunden. Um eine Tenozytenkultur einzurichten, wird die andere Hälfte der entnommenen Kontroll- und entarteten Gewebeproben in einzelne Gewebekulturschalen mit frischem PBS überführt und das Gewebe in einen Kubikmeter oder kleinere Stücke zerkleinert, die Gewebefragmente in 30 Millilitern DMEM, ergänzt mit 30 Milligramm pro Milliliter Kollagenase, zwei pro Gewebegruppe, bei 37 Grad Celsius für eine Stunde verdaut.

Am Ende des Verdschlusses filtrieren Sie die Zelllösungen durch einzelne 100-Mikron-Zellsiebe und deaktivieren die Kollagenase mit einem Milliliter FBS pro Röhrchen. Sammeln Sie die Tenozyten durch Zentrifugation und resuspendieren Sie die Pellets dreimal 10 bis zu den fünften Zellen pro 10 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Antibiotika, antimykotische Lösungskonzentration. Dann säen Sie die Zellen in eine 100-Zentimeter-Kulturschale pro Bedingung und kultivieren Sie die Tenozyten eine Woche lang in einem 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid-Inkubator, wobei Sie das Kulturmedium alle drei Tage wechseln, bis eine Konfluenz von 80 % erreicht ist.

Für die immunzytochemische Analyse werden zwei mal 10 bis die fünften Zellen in 200 Mikrolitern frischem Medium in jede Vertiefung eines Objektträgers mit acht Vertiefungen pro Versuchsgruppe übertragen und die Zellen 24 Stunden lang bis zum Zusammenfluss gezüchtet. Waschen Sie die Zellen am nächsten Tag mit PBS, gefolgt von einer Fixierung mit 500 Mikrolitern 4 % Formaldehyd pro Vertiefung und einer Permeabilisierung mit 0,5 % Triton X 100 in PBS für 10 Minuten. Um eine unspezifische Bindung zu blockieren, inkubieren Sie die Zellen mit 1 % Rinderserumalbumin und 0,05 % Tween 20 in PBS, je nach experimenteller Eignung, gefolgt von einer Inkubation mit den fluoreszenzmarkierten Primärantikörpern von Interesse, die über Nacht vor Licht geschützt sind.

Am nächsten Morgen markieren Sie die Zellen eine Stunde lang bei lichtgeschützter Raumtemperatur mit den entsprechenden Sekundärantikörpern und mounten die Proben mit 0,5 Mikrolitern eines geeigneten Fluoreszenz-Einbettmediums pro Kammer. Anschließend werden die Proben auf einem Fluoreszenzmikroskop unter einem 400-fachen Objektiv abgebildet. Für die pathologische Analyse des Gewebes betten Sie die formalen und festen Kontroll- und degenerierten Sehnengewebeproben in vier bis fünf Milliliter Paraffin ein und entnehmen Sie vier bis fünf Mikrometerschnitte von jedem Paraffinblock.

Für Hämatoxylin in Eosin oder H&E-Färbung entparaffinisieren Sie die Proben durch drei fünfminütige Eintauchen in Xylol, gefolgt von einer Hydratation mit abgestuften Ethanol-Immersionen und einer zweiminütigen Reinigung mit Leitungswasser. Beschriften Sie die Proben anschließend fünf Minuten lang mit Hämatoxylin, gefolgt von einer weiteren zweiminütigen Wasserwäsche. Tauchen Sie die gespülten Proben drei Sekunden lang in 1 % Salzsäure und 70 % Ethanol, gefolgt von einer dreiminütigen Wasserwäsche.

Neutralisieren Sie die Säure mit einem 10-sekündigen Eintauchen in 0,5 % Ammoniak, gefolgt von einer weiteren dreiminütigen Wasserwäsche. Markieren Sie die neutralisierten Proben fünf Minuten lang mit dem Eosin und dehydrieren Sie die H&E-gefärbten Proben mit abgestuften Ethanol-Immersionen. Nach dreimaligem Eintauchen in Xylol werden die Proben mit einem geeigneten Einbettmedium und einem Objektträger eingefasst.

Um eine immunhistochemische Analyse der Gewebeproben durchzuführen, verwenden Sie das Bond Polymer Refined Detection Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers mit den folgenden geringfügigen Änderungen. Nach der Deparaffinierung mit Xylol, wie demonstriert, tauchen Sie die Proben 30 Minuten lang bei 100 Grad Celsius in eine Bindungsepitom-Rückgewinnungslösung für die Antigengewinnung, gefolgt von einer fünfminütigen Inkubation in Wasserstoffperoxid, um endogene Peroxidase zu löschen. Als nächstes beschriften Sie die Schnitte fünfzehn Minuten lang bei Raumtemperatur mit den primären Antikörpern von Interesse.

Am Ende der Inkubation werden die Proben 50 Minuten lang bei Raumtemperatur mit dem entsprechenden biotinfreien polymeren Meerrettichperoxidase-Linker-Sekundärantikörper-Konjugatsystem markiert. Anschließend montieren Sie die Schnitte mit einem Deckglas in das entsprechende Eindeckmedium und bilden die Proben auf einem Lichtmikroskop mit 400-facher Vergrößerung ab. H&E-Analysen zeigen, dass Gewebe, das aus der degenerierten lateralen Epicondylitis entnommen wird, unorganisierte Kollagenbündel mit Polaritätsverlust und feine, gerade, stark gepackte parallele Faserstrukturen aufweist.

Tatsächlich sind die Kollagenbündel positiv für die Alcianblau-Färbung in den degenerierten Gewebeschnitten, was auf ein erhöhtes Vorhandensein von Proteoglykanen und Glykosaminoglykan im geschädigten Gewebe hinweist. Die immunhistochemische Analyse der degenerierten Sehnen deutet auch auf eine zytoplasmatische granuläre positive Reaktion auf den vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor hin, die in kontrollierten, gesunden Sehnengewebeproben nicht beobachtet wird. Beide Arten von kultivierten Gewebeprobenzellen können durch Immunfluorchemie als Tenozyten bestätigt werden, wobei die meisten der kultivierten Zellen repräsentative Tenozytenmarker wie die Mohawk- und Tenomodulin-Proteine exprimieren und ein längliches Erscheinungsbild aufweisen.

Bemerkenswert ist, dass die degenerativen Tenozyten auch eine höhere Proliferationsrate in Kultur im Vergleich zu Tenozyten aufweisen, die von gesunden Kontrollen entnommen wurden, sowie eine höhere Expression mehrerer Gene, von denen bekannt ist, dass sie mit der Entwicklung von Tendinopathien in Verbindung stehen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass dieses validierte Protokoll mit degenerativen Tenozyten den Weg für zukünftige Untersuchungen in der Sehnenbiologie und für die Erprobung neuer Interventionen ebnet.