Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation
3. Mai 2018
Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, DNA-Plasmide in vivo in das Blasen-Urothel lebender Mäuse zu bringen, um eine Genüberexpression oder Genom-Editierung zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Blasenkrebs zu beantworten, wie zum Beispiel, wie verschiedene genetische Mutationen das Fortschreiten von Blasenkrebs fördern? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle und bequeme Möglichkeit bietet, Gene in die Blase zu bringen, ohne die Sicherheitsbedenken und technischen Barrieren, die mit viralen Vektoren verbunden sind.
Ich hatte zuerst die Idee für diese Methode, zu versuchen, irgendwelche manipulierten assoziierten Viren für die DNA-Übertragung zu verwenden, was in der Blase nicht gut funktionierte. Die Implikation dieser Technik kann sich auch auf die Gentherapie erstrecken, da die Elektroporation eine effiziente Abgabe von DNA-Plasmiden in die Urothelzellen erreichen kann. Das Verfahren wird von Ofir Stefanson und Yueli Liu aus meinem Labor vorgeführt.
Um mit diesem Verfahren zu beginnen, autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol. Besprühen Sie chirurgische Instrumente und die Handschuhe häufig mit 70%igem Ethanol, wenn Sie die nachfolgenden Eingriffe durchführen, um sterile Bedingungen zu erhalten. Betäuben Sie zunächst die Maus und rasieren Sie den Operationsbereich.
Um den Urin zu erschöpfen, tragen Sie Gleitmittel auf den Katheter auf und stellen Sie sicher, dass seine äußere Oberfläche vollständig bedeckt ist. Führen Sie anschließend den Katheter in die Harnröhrenöffnung der Maus ein und schieben Sie ihn langsam bis zur Blase. Drücken Sie sanft auf den Bauch, um den Urinmangel zu unterstützen.
Entsorgen Sie anschließend den Urin mit einer Pipette in ein Abfallbecherglas und pipettieren Sie dann 80 Mikroliter PBS in das äußere Ende des Katheters, wobei sich das andere Ende noch in der Blase befindet. Befestigen Sie anschließend vorsichtig eine Ein-Millimeter-Spritze am Katheter. Drücken Sie vorsichtig auf die Spritze, um PBS in die Blase zu injizieren.
Lassen Sie etwas PBS im Katheter, um Luftblasen in der Blase zu vermeiden. Entfernen Sie danach die Spritze und warten Sie, bis PBS aus der Blase abfließt. Drücken Sie vorsichtig auf den Bauch, um PBS zu evakuieren, und entsorgen Sie dann das PBS im Katheter mit einer Pipette in das Abfallbecherglas.
Wiederholen Sie das PBS-Waschen noch zwei weitere Male. Für jede zu transfizierende Blase bereiten Sie mindestens 20 Mikroliter DNA-Plasmid mit einem Mikrogramm pro Mikroliter vor. Geben Sie als Nächstes einen Mikroliter Trypanblau zu den 20 Mikrolitern Plasmidlösung und einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und einer Pipette, um gut zu mischen.
Um das Plasmid zu verabreichen, tragen Sie 70% Ethanol auf den Bauch auf. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von einem Zentimeter, um die Bauchhaut über der Blase zu öffnen. Schneiden Sie als Nächstes die Muskelschicht durch, um die Blase freizulegen.
Pipettieren Sie mindestens 20 Mikroliter Plasmid plus Trypanblau-Lösung in das äußere Ende des Katheters und lösen Sie es von der Spritze. Injizieren Sie dann die Plasmidlösung in die Blase. Färbt sich die Blase blau, ist die Injektion erfolgreich.
Lassen Sie etwas Flüssigkeit im Katheter, um Luftblasen in der Blase zu vermeiden. Fassen Sie anschließend die äußere Harnröhrenöffnung und entfernen Sie den Katheter und die Spritze. Verwenden Sie eine Schnur, um die äußere Harnröhrenöffnung zu straffen.
Mache zwei Schlaufen mit der Schnur und binde sie dann mit zwei Knoten zusammen. Dies ist ein entscheidender Schritt, der die Zusammenarbeit von zwei Personen erfordert. Stellen Sie sicher, dass die Knoten fest sind, damit die Plasmide nicht austreten.
Schalten Sie nun den Elektroporationsgenerator ein. Kneifen Sie die Blase mit zwei Elektroden zusammen und drücken Sie das Fußpedal, um die Elektroporation durchzuführen. Um die Blase abgestützt zu halten, kann man die Rückseite des Bauchschnitts mit einer Pinzette einklemmen.
Vermeiden Sie jeglichen Kontakt zwischen Pinzette und Elektroden, da dies einen Funken erzeugen kann. Wenn dies erledigt ist, vernähen Sie die Bauch- und Hautöffnung mit einer sterilen, chirurgischen Naht. Entfernen Sie die Schnur und bringen Sie Clips an.
Tragen Sie Jod auf die Wunde auf und entfernen Sie dann das Tier aus dem Isofluran-System. Verabreichen Sie Buprenorphin analgetisch subkutan, um postoperative Schmerzen zu lindern. Bewahren Sie das Tier auf dem Heizkissen auf und bringen Sie es nach vollständiger Genesung in den Heimkäfig zurück.
Kontrollieren Sie das Tier mindestens einmal täglich auf normale Mobilität, Trink- und Fütterungsverhalten und keine Anzeichen einer Infektion, bis der Schnitt verheilt ist. Entfernen Sie dann, eine Woche später, die Clips. Verabreichen Sie nachfolgende Injektionen von Buprenorphin-Analgetikum, wenn das Tier Schmerzsymptome wie verminderte Fellpflege, erhöhte Aggressivität und Lautäußerung zeigt.
Um den erfolgreichen Gentransfer in das Odythel der Blase zu demonstrieren, wurden 20 Mikroliter pCAG-GFP-Plasmid und Trypanblau-Lösung durch die Harnröhre injiziert und fünf elektrische Impulse verabreicht. Hier ist die erfolgreiche Elektroporation zu sehen, die die Blase nach 48 Stunden grün färbte, während eine negative Kontrollblase, die sich keiner Elektroporation unterzogen hatte, kein GFP-Signal zeigte. Die Immunfluoreszenzfärbung von geschnittenen Blasengeweben wurde mit CK5-, CK18- und GFP-Antikörpern durchgeführt.
Es wurde beobachtet, dass das GFP-Signal in Schirm-, Zwischen- und Basalzellen vorhanden ist, aber nicht in der Muskelschicht, was auf eine gute Spezifität der Plasmidabgabe in das Urothel hinweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet des Blasenkrebses den Weg, neue autochthone Mausmodelle zu bauen, um die Mechanismen des Krankheitsverlaufs zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Verabreichung von DNA-Plasmiden in urotheliale Zellen der Mausblase in vivo mittels Harnröhrenkatheterisierung und Elektroporation. Diese Technik bietet eine schnelle und bequeme Möglichkeit, autochthone Mausmodelle von Blasenerkrankungen zu erzeugen.
Wichtige Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Gen-Therapie
- Forschung zum Blasenkrebs
- Elektroporationstechniken
Hintergrund
- Die Methode zielt darauf ab, DNA-Plasmide in das Harnblasenurothel von lebenden Mäusen einzubringen.
- Sie befasst sich mit zentralen Fragen zur Progression von Blasenkrebs.
- Herkömmliche virale Vektoren bergen Sicherheitsbedenken und technische Hürden.
- Diese Methode bietet eine Alternative für die Genübertragung.
Zweck der Studie
- Um die Genüberexpression oder Genomeditierung in Blasenzellen zu ermöglichen.
- Um die Auswirkungen genetischer Mutationen auf Blasenkrebs zu untersuchen.
- Um die Effizienz von DNA-Übertragungsmethoden zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Katheterisierung der Harnröhre zur Plasmidapplikation.
- Elektroporation zur Verbesserung der DNA-Aufnahme.
- In-vivo-Anwendung in Mausmodellen.
- Demonstration durch Ofir Stefanson und Yueli Liu.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Abgabe von DNA-Plasmiden in Urothelzellen.
- Schnelle und effiziente Methode im Vergleich zu viralen Vektoren.
- Potentielle Anwendungen in der Gentherapie und Krebsforschung.
- Nachgewiesene Durchführbarkeit in lebenden Mausmodellen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz für die Genübertragung in die Harnblase.
- Sie hat Auswirkungen auf die Erforschung von Harnblasenerkrankungen und -krebs.
- Weitere Forschung könnte ihre Anwendungen in der Gentherapie erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode behebt einen kritischen Engpass in der Blasenkrebsforschung, indem sie eine schnelle, nicht-virale Genübertragung auf das Urothel in vivo ermöglicht. Sie unterstützt die Zielvalidierung und die mechanistische Risikominderung, indem sie eine vorübergehende Überexpression oder Absenkung von Kandidatengenen in einem krankheitsrelevanten System erlaubt. Der Ansatz beschleunigt die Erzeugung präklinischer Modelle und verkürzt Zeit und Kosten im Vergleich zu Keimbahnmodellen, behält dabei aber die physiologische Relevanz für translationsmedizinische Studien bei.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch die gezielte Übertragung von Plasmiden in urotheliale Blasenzellen zur funktionellen Genmodulation.
- Operativer Wert: Bietet eine schnelle und praktische Alternative zu viralen Vektoren und vermeidet dabei biosicherheitsrelevante Einschränkungen sowie Verzögerungen bei der Herstellung.
- Predictive Value: Unterstützt die phänotypische Bildschirmung in einem nativen Gewebekontext und erhöht so die Zuverlässigkeit bei der Zielstrukturauswahl für Blasenkrebs-Pathwege.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt reproduzierbare, quantifizierbare Messgrößen (z. B. GFP-Expression), um die Transfektionseffizienz und Genexpressionsniveaus zu bewerten.
- Operativer Wert: Standardisiert die Plasmidabgabe mittels Katheterisierung und Elektroporation und ermöglicht so konsistente Tests von Substanzen oder genetischen Störungen.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Herstellung validierter Harnblasenmodelle für nachgeschaltete Arzneimittelwirksamkeits- oder Biomarkeranalysen.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Erstellt autochthone Mausmodelle, die die Initiation und Progression von Blasenkrebs widerspiegeln.
- Operativer Wert: Ermöglicht die induzierbare Genmodulation bei erwachsenen Mäusen und unterstützt damit die zeitliche Kontrolle in präklinischen Studien.
- Translationale Kontinuität: Verbindet entdeckte Befunde mit der präklinischen Validierung, indem genetische Effekte in einem klinisch relevanten Organsystem getestet werden.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Kontinuum von der Entdeckung bis zur präklinischen Phase ein und ermöglicht eine schnelle Iteration von der Zielhypothese bis zur in-vivo-Validierung im Blasengewebe.
- Entdeckungsbiologie: Unterstützt die Aufklärung von Signalwegen und die Bestätigung von Zielstrukturen durch direkte Genübertragung in urotheliale Kompartimente.
- Screening: Ermöglicht quantitative fluoreszenzbasierte oder immunhistochemische Auswertungen zur Beurteilung der Transfektions- und Genmodulations-Effizienz.
- Analytik: Bietet messbare Endpunkte (z. B. GFP-Signalintensität, Zelltyp-spezifische Expression) zum Vergleich experimenteller Bedingungen.
- Translationale Forschung: Ermöglicht die präklinische Modellierung von Blasenkrebs-Phänotypen unter Verwendung genetisch veränderter Urothelien.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine wiederverwendbare Plattform für die Genübertragung über mehrere Zielstrukturen und Studien in der urologischen Krankheitsforschung hinweg.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht die Vorhersagesicherheit bei der Zielvalidierung, indem die Abhängigkeit von künstlichen Überexpressionssystemen verringert wird.
- Operativer Wert: Verbessert die Reproduzierbarkeit durch standardisierte chirurgische und Elektroporationsparameter.
- Strategischer Wert: Steigert die Kapitaleffizienz, indem die Erzeugung von Modellen beschleunigt und die Ausschussrate aufgrund ungeeigneter Zielwahl reduziert wird.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Blasenkrebszielen basierend auf funktionellen In-vivo-Daten.
Durchführungsüberlegungen
- Erfordert Fachkenntnisse in murinen chirurgischen Techniken, Katheterisierung und Elektroporation.
- Abhängig von sterilen chirurgischen Instrumenten, einem Elektroporationsgenerator und kompatiblen Elektroden.
- Erfordert eine Standardisierung zwischen den Teams hinsichtlich des Plasmidvolumens, der Pulsparameter und der Blasenexposition.
- Zu berücksichtigende Anpassungsaspekte sind die Größe des Plasmids, die Wahl des Promotors und die Urothel-Umstellungsgeschwindigkeit, die die Dauer der Expression beeinflusst.
- Praktische Einschränkungen umfassen die vorübergehende Expression (Spitze nach 48 Stunden) sowie technische Herausforderungen bei der Aufrechterhaltung der Blasenintegrität während der Eingriffe.
