Neuartige Methode der Transport der Plasmid-DNA zu Maus Blase Urothel durch Elektroporation
May 3rd, 2018
Wir beschreiben eine neue Methode für die Lieferung von Plasmid DNA in die important-Zellen der Maus Blase in Vivo durch Katheterisierung der Harnröhre und Elektroporation. Freuen Sie sich auf eine schnelle und bequeme Möglichkeit zur Erzeugung von autochthonen Mausmodelle der Blase Krankheiten.
Das übergeordnete Ziel dieser Methode ist es, DNA-Plasmide in vivo in das Blasen-Urothel lebender Mäuse zu bringen, um eine Genüberexpression oder Genom-Editierung zu ermöglichen. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich Blasenkrebs zu beantworten, wie zum Beispiel, wie verschiedene genetische Mutationen das Fortschreiten von Blasenkrebs fördern? Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie eine schnelle und bequeme Möglichkeit bietet, Gene in die Blase zu bringen, ohne die Sicherheitsbedenken und technischen Barrieren, die mit viralen Vektoren verbunden sind.
Ich hatte zuerst die Idee für diese Methode, zu versuchen, irgendwelche manipulierten assoziierten Viren für die DNA-Übertragung zu verwenden, was in der Blase nicht gut funktionierte. Die Implikation dieser Technik kann sich auch auf die Gentherapie erstrecken, da die Elektroporation eine effiziente Abgabe von DNA-Plasmiden in die Urothelzellen erreichen kann. Das Verfahren wird von Ofir Stefanson und Yueli Liu aus meinem Labor vorgeführt.
Um mit diesem Verfahren zu beginnen, autoklavieren Sie alle chirurgischen Instrumente und sterilisieren Sie den Arbeitsbereich mit 70 % Ethanol. Besprühen Sie chirurgische Instrumente und die Handschuhe häufig mit 70%igem Ethanol, wenn Sie die nachfolgenden Eingriffe durchführen, um sterile Bedingungen zu erhalten. Betäuben Sie zunächst die Maus und rasieren Sie den Operationsbereich.
Um den Urin zu erschöpfen, tragen Sie Gleitmittel auf den Katheter auf und stellen Sie sicher, dass seine äußere Oberfläche vollständig bedeckt ist. Führen Sie anschließend den Katheter in die Harnröhrenöffnung der Maus ein und schieben Sie ihn langsam bis zur Blase. Drücken Sie sanft auf den Bauch, um den Urinmangel zu unterstützen.
Entsorgen Sie anschließend den Urin mit einer Pipette in ein Abfallbecherglas und pipettieren Sie dann 80 Mikroliter PBS in das äußere Ende des Katheters, wobei sich das andere Ende noch in der Blase befindet. Befestigen Sie anschließend vorsichtig eine Ein-Millimeter-Spritze am Katheter. Drücken Sie vorsichtig auf die Spritze, um PBS in die Blase zu injizieren.
Lassen Sie etwas PBS im Katheter, um Luftblasen in der Blase zu vermeiden. Entfernen Sie danach die Spritze und warten Sie, bis PBS aus der Blase abfließt. Drücken Sie vorsichtig auf den Bauch, um PBS zu evakuieren, und entsorgen Sie dann das PBS im Katheter mit einer Pipette in das Abfallbecherglas.
Wiederholen Sie das PBS-Waschen noch zwei weitere Male. Für jede zu transfizierende Blase bereiten Sie mindestens 20 Mikroliter DNA-Plasmid mit einem Mikrogramm pro Mikroliter vor. Geben Sie als Nächstes einen Mikroliter Trypanblau zu den 20 Mikrolitern Plasmidlösung und einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen und einer Pipette, um gut zu mischen.
Um das Plasmid zu verabreichen, tragen Sie 70% Ethanol auf den Bauch auf. Machen Sie einen vertikalen Schnitt von einem Zentimeter, um die Bauchhaut über der Blase zu öffnen. Schneiden Sie als Nächstes die Muskelschicht durch, um die Blase freizulegen.
Pipettieren Sie mindestens 20 Mikroliter Plasmid plus Trypanblau-Lösung in das äußere Ende des Katheters und lösen Sie es von der Spritze. Injizieren Sie dann die Plasmidlösung in die Blase. Färbt sich die Blase blau, ist die Injektion erfolgreich.
Lassen Sie etwas Flüssigkeit im Katheter, um Luftblasen in der Blase zu vermeiden. Fassen Sie anschließend die äußere Harnröhrenöffnung und entfernen Sie den Katheter und die Spritze. Verwenden Sie eine Schnur, um die äußere Harnröhrenöffnung zu straffen.
Mache zwei Schlaufen mit der Schnur und binde sie dann mit zwei Knoten zusammen. Dies ist ein entscheidender Schritt, der die Zusammenarbeit von zwei Personen erfordert. Stellen Sie sicher, dass die Knoten fest sind, damit die Plasmide nicht austreten.
Schalten Sie nun den Elektroporationsgenerator ein. Kneifen Sie die Blase mit zwei Elektroden zusammen und drücken Sie das Fußpedal, um die Elektroporation durchzuführen. Um die Blase abgestützt zu halten, kann man die Rückseite des Bauchschnitts mit einer Pinzette einklemmen.
Vermeiden Sie jeglichen Kontakt zwischen Pinzette und Elektroden, da dies einen Funken erzeugen kann. Wenn dies erledigt ist, vernähen Sie die Bauch- und Hautöffnung mit einer sterilen, chirurgischen Naht. Entfernen Sie die Schnur und bringen Sie Clips an.
Tragen Sie Jod auf die Wunde auf und entfernen Sie dann das Tier aus dem Isofluran-System. Verabreichen Sie Buprenorphin analgetisch subkutan, um postoperative Schmerzen zu lindern. Bewahren Sie das Tier auf dem Heizkissen auf und bringen Sie es nach vollständiger Genesung in den Heimkäfig zurück.
Kontrollieren Sie das Tier mindestens einmal täglich auf normale Mobilität, Trink- und Fütterungsverhalten und keine Anzeichen einer Infektion, bis der Schnitt verheilt ist. Entfernen Sie dann, eine Woche später, die Clips. Verabreichen Sie nachfolgende Injektionen von Buprenorphin-Analgetikum, wenn das Tier Schmerzsymptome wie verminderte Fellpflege, erhöhte Aggressivität und Lautäußerung zeigt.
Um den erfolgreichen Gentransfer in das Odythel der Blase zu demonstrieren, wurden 20 Mikroliter pCAG-GFP-Plasmid und Trypanblau-Lösung durch die Harnröhre injiziert und fünf elektrische Impulse verabreicht. Hier ist die erfolgreiche Elektroporation zu sehen, die die Blase nach 48 Stunden grün färbte, während eine negative Kontrollblase, die sich keiner Elektroporation unterzogen hatte, kein GFP-Signal zeigte. Die Immunfluoreszenzfärbung von geschnittenen Blasengeweben wurde mit CK5-, CK18- und GFP-Antikörpern durchgeführt.
Es wurde beobachtet, dass das GFP-Signal in Schirm-, Zwischen- und Basalzellen vorhanden ist, aber nicht in der Muskelschicht, was auf eine gute Spezifität der Plasmidabgabe in das Urothel hinweist. Einmal gemeistert, kann diese Technik in 15 Minuten ausgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nach ihrer Entwicklung ebnet diese Technik Forschern auf dem Gebiet des Blasenkrebses den Weg, neue autochthone Mausmodelle zu bauen, um die Mechanismen des Krankheitsverlaufs zu untersuchen.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt eine neuartige Methode zur Verabreichung von DNA-Plasmiden in die Urothelzellen der Mausblase in vivo durch Harnröhrenkatheterisierung und Elektroporation. Diese Technik bietet eine schnelle und bequeme Möglichkeit, autochthone Mausmodelle von Blasenerkrankungen zu erzeugen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Gentherapie
- Blasenkrebsforschung
- Elektroporationstechniken
Hintergrund
- Die Methode zielt darauf ab, DNA-Plasmiden in das Blasenurothelium lebender Mäuse zu liefern.
- Sie beantwortet wichtige Fragen zur Progression von Blasenkrebs.
- Traditionelle virale Vektoren bergen Sicherheitsbedenken und technische Barrieren.
- Diese Methode bietet eine Alternative für die Genübertragung.
Zweck der Studie
- Um die Genüberexpression oder Genombearbeitung in Blasenzellen zu erleichtern.
- Um die Auswirkungen genetischer Mutationen auf Blasenkrebs zu untersuchen.
- Um die Effizienz von DNA-Übertragungsmethoden zu verbessern.
Verwendete Methoden
- Harnröhrenkatheterisierung für die Plasmid-Lieferung.
- Elektroporation zur Verbesserung der DNA-Aufnahme.
- In-vivo-Anwendung in Mausmodellen.
- Demonstration durch Ofir Stefanson und Yueli Liu.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Verabreichung von DNA-Plasmiden in Urothelzellen.
- Schnelle und effiziente Methode im Vergleich zu viralen Vektoren.
- Potenzielle Anwendungen in der Gentherapie und Krebsforschung.
- Nachgewiesene Machbarkeit in lebenden Mausmodellen.
Schlussfolgerungen
- Diese Methode bietet einen neuartigen Ansatz für die Blasen-Genübertragung.
- Sie hat Auswirkungen auf die Untersuchung von Blasenerkrankungen und Krebs.
- Weitere Forschung könnte ihre Anwendungen in der Gentherapie erweitern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method addresses a critical bottleneck in bladder cancer research by enabling rapid, non-viral gene delivery to the urothelium in vivo. It supports target validation and mechanistic de-risking by allowing transient overexpression or knockdown of candidate genes in a disease-relevant system. The approach accelerates preclinical model generation, reducing time and cost compared to germline models while maintaining physiological relevance for translational studies.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by delivering plasmids to bladder urothelial cells for functional gene modulation.
- Operational Value: Provides a fast, convenient alternative to viral vectors, avoiding biosafety constraints and production delays.
- Predictive Value: Supports phenotypic screening in a native tissue context, improving confidence in target selection for bladder cancer pathways.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates reproducible, quantifiable readouts (e.g., GFP expression) to assess transfection efficiency and gene expression levels.
- Operational Value: Standardizes plasmid delivery via catheterization and electroporation, enabling consistent compound or genetic perturbation screening.
- Scalability: Facilitates preparation of validated bladder models for downstream drug response or biomarker assays.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Creates autochthonous mouse models that reflect bladder cancer initiation and progression mechanisms.
- Operational Value: Allows inducible gene modulation in adult mice, supporting temporal control in preclinical studies.
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical validation by testing genetic effects in a clinically relevant organ system.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery-to-preclinical continuum, enabling rapid iteration from target hypothesis to in vivo validation in bladder tissue.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification and target confirmation through direct gene delivery to urothelial compartments.
- Screening: Delivers quantitative fluorescence or immunohistochemical outputs for assessing transfection and gene modulation efficiency.
- Analytics: Provides measurable endpoints (e.g., GFP signal intensity, cell-type specificity) to compare experimental conditions.
- Translational Research: Enables preclinical modeling of bladder cancer phenotypes using genetically manipulated urothelium.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for gene delivery across multiple targets and studies in urological disease research.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing reliance on artificial overexpression systems.
- Operational Value: Enhances reproducibility through standardized surgical and electroporation parameters.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by accelerating model generation and reducing attrition from poor target selection.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of bladder cancer targets based on functional in vivo data.
Implementation Considerations
- Requires expertise in murine surgical techniques, catheterization, and electroporation.
- Dependent on sterile surgical instruments, electroporation generator, and compatible electrodes.
- Necessitates standardization across teams for consistent plasmid volume, pulse parameters, and bladder exposure.
- Adaptation considerations include plasmid size, promoter choice, and urothelial turnover rate affecting expression duration.
- Practical limitations include transient expression (peak at 48 hours) and technical challenges in maintaining bladder integrity during procedures.
