Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean "explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Insekten-Metabolomik zu beantworten. Der Ansatz der Metabolitenprofilierung kann verwendet werden, um die chemische Ökologie von Ameisen zu untersuchen, indem die Rolle der flüchtigen Bestandteile in der Interaktion mit anderen Organismen aufgeklärt wird. Der Hauptvorteil des vorgestellten Workflows besteht darin, dass er aus zwei unterschiedlichen Teilen besteht, die grundsätzlich unabhängig voneinander angewendet werden können.

Erstens, die physikalische Isolierung des Unterkieferdrüsenreservoirs und seines Inhalts, und zweitens, die ungezielte Profilerstellung und Identifizierung flüchtiger organischer Bestandteile in der biologischen Probe von Interesse. Das Verfahren wird von Michaela Hoenigsberger, einer talentierten Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Reinigen Sie vor dem Präparieren der Ameisen in einem Abzug eine Petrischale aus Glas und die Sezierinstrumente mit Papiertüchern und einer Mischung aus Methanol und Wasser.

Lagern Sie das Gericht bei minus 20 Grad Celsius. Nehmen Sie dann die Masse von 1,5-Milliliter-Kurzgewindefläschchen einschließlich ihrer Schraubverschlüsse, die Silikon-PTFE-Septen enthalten. Lagern Sie die Fläschchen auf Eis.

Legen Sie als Nächstes eine gefrorene, formbare Kühlpackung in eine Styroporschaumbox. Dann die Petrischale auf den Kühlakku laden und eine gefrorene Ameise in die Schale geben. Untersuchen Sie nun die Ameise mit einem Stereomikroskop.

Überprüfen Sie die Unversehrtheit der Magenkammern. Die Ameise muss eine intakte Gasterregion haben. Verwenden Sie keine Ameisen mit flachen Gastern oder Spuren von verhärtetem Unterkieferdrüsenreservoir auf ihren Körperoberflächen.

Isoliere nun den Inhalt des Unterkieferdrüsenreservoirs von der Ameise. Benutze eine Pinzette, um das Propodium und den Blattstiel zu greifen, und ziehe dann diese Körpersegmente vorsichtig auseinander. Fassen Sie dann den Gaster bei Tergit vier mit einer feinen Pinzette.

Nimm mit einer anderen Pinzette Tergit eins und entferne den Tergit vorsichtig, indem du ihn abziehst. Wiederhole diesen Vorgang, um die Tergite zwei und drei abzureißen, so dass der Gastrol-Teil der Unterkieferdrüsenreservoirs größtenteils sichtbar ist. Die Reservoire der Unterkieferdrüsen sind bei C.Explodens Arbeiterameisen gelb gefärbt, aber die Farbe kann von weiß über gelb bis rot bei anderen Arten reichen.

Entfernen Sie anschließend mit einer Präpariernadel vorsichtig den wachsartigen Inhalt der paarigen Unterkieferdrüsenreservoire, indem Sie ihn aus dem Magenkompartiment kratzen. Entfernen Sie nur die Teile des Unterkieferdrüsenreservoirs, die isoliert werden können, ohne Druck auf die anderen im Ameisengaster vorhandenen Drüsen und Körperstrukturen auszuüben. Es ist nicht notwendig, den gesamten Inhalt des Unterkieferreservoirs zu sammeln.

Nehmen Sie nun den Inhalt des Unterkieferdrüsenreservoirs auf, indem Sie ihn vorsichtig mit der Spitze der Seziernadel berühren, bis er daran kleben bleibt. Übertragen Sie dann den Drüseninhalt in ein kaltes 1,5-Milliliter-Fläschchen mit kurzem Gewinde. Es kann erforderlich sein, die Nadelspitze entlang der Wand des Fläschchens zu bewegen und den Drüseninhalt auf die Wand des Fläschchens zu schmieren.

Bewahren Sie die Sammlung abgedeckt und auf Eis auf, bis sie analysiert werden kann. Reinigen Sie die Instrumente und die Schale zwischen den Dissektionen erneut mit dem Methanol-Wasser-Gemisch. Um eine analytische Probe herzustellen, kombinieren Sie den Inhalt des Drüsenreservoirs mehrerer Ameisen.

In diesem Fall werden die Drüseninhalte von fünf C.explodens Arbeiterameisen gepoolt. Für eine Kontrolle entnehmen Sie Proben, die aus der Dufour-Drüse bestehen, die an die Unterkieferdrüsenreservoire angrenzt. Vor der Extraktion des Drüseninhalts sind die Massen der analytischen Proben zu bestimmen.

Fügen Sie dann 14 Teile eiskaltes hochreines Ethylacetat nach Volumen zu einem Teil Gewebe nach Masse hinzu. Wirbeln Sie das Präparat fünf Minuten lang unter gekühlten Bedingungen. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang und sammeln Sie die Überstände.

Etwa 55 bis 75 Mikroliter Überstand werden von einer Probe von fünf Ameisen erwartet. Übertragen Sie jeden Überstand in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Kurzgewindefläschchen mit einem 0,1-Milliliter-Mikroeinsatz und verschließen Sie die Fläschchen mit Schraubverschlüssen mit Löchern und roten PTFE-Gummisepten. Für eine vollständige GCMS-Messsequenz bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Kurzgewindefläschchen mit einer Retentionsindex-Kalibrationsmischung vor, die durch Verdünnen handelsüblicher Alkan-Standardlösungen in Hexan auf acht Milligramm pro Milliliter pro Verbindung hergestellt wird.

Bereiten Sie dann ein weiteres Fläschchen mit reinem Ethylacetat vor, das als Lösungsmittelrohling dient. Auf das gekühlte Autosampler-Tablett des Gaschromatographen wird zuerst der Lösungsmittelrohling, dann das Retentionsindex-Kalibrantengemisch, drittens der Extrakt aus dem Unterkieferdrüsenreservoir und viertens der Extrakt aus dem Dufour-Drüsengehalt geladen. Legen Sie die Proben mit der Schale auf Eis, um sie zum Gaschromatographen zu transportieren.

Setzen Sie das Tablett in den gekühlten Autosampler ein. Für jede Probe wird ein Mikroliter Aliquat in das GC-Massenspektrometer injiziert, um die chromatographische Trennung auf einer für die Zielverbindungen geeigneten Säule durchzuführen. Zum Beispiel eine HP-5MS UI-Spalte.

Legen Sie als Nächstes die entsprechenden GC-Parameter fest. Verwenden Sie zum Beispiel Helium am Trägergas mit einem konstanten Säulenfluss von einem Milliliter pro Minute. Verwenden Sie eine Ofentemperaturrampe ab 40 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von einer Rampe von 10 Grad Celsius pro Minute auf bis zu 330 Grad Celsius.

Gefolgt von einer siebenminütigen Pause. Mit diesen Parametern stellen Sie die Einlasstemperatur auf 270 Grad Celsius ein. Passen Sie nun bei Bedarf die Teilungsverhältnisse für die GC-Massenspektrometrie an.

Injektion, so dass sie angemessene Peakformen und -intensitäten für die interessierenden Verbindungen liefern. Stellen Sie die Zusatztemperatur auf 350 Grad Celsius ein. Für die Massenspektrometrie

Verwenden Sie die folgenden Parameter. Eine MS-Quelltemperatur von 230 Grad Celsius, eine MS-Quad-Temperatur von 150 Grad Celsius und ein Scanbereich von 30 mit niedriger Masse bis 500 mit hoher Masse, was zu einer Scanrate von etwa drei Scans pro Sekunde führt. Und eine Lösungsmittelverzögerung von 4,1 Minuten für den Lösungsmittel-Blindwert und die Versuchsproben oder eine Lösungsmittelverzögerung von 6,1 Minuten für das Retentionsindex-Kalibrantengemisch.

Wenn die Messungen abgeschlossen sind, öffnen Sie die GCMS-Datenanalysesoftware und exportieren Sie die Daten als AIA-Projektdatei auf ein tragbares Speichergerät, um die Datenübertragung auf einen Computer mit einem 64-Bit-Linux-basierten Betriebssystem zu erleichtern. Um die Daten zu analysieren, befolgen Sie die Beschreibung des Protokolltextes zur Verwendung der Metabolitendetektorsoftware. Im Feld wurden Ameisen gesammelt und zwei Tage lang bei minus 20 Grad Celsius eingefroren und dann bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert.

Der Inhalt des Unterkieferdrüsenreservoirs von fünf C.explodens Arbeiterameisen wurde gepoolt und mit GCMS gemessen. Die Datenanalyse ergab Dutzende von mutmaßlichen Verbindungen mit Drüseninhalten. Die beiden dominanten Metaboliten im Extrakt aus dem Unterkiefer-Reservoir-Gehalt führten zu einer Überlastung der Säulen.

Deshalb wurde die gleiche Probe erneut mit einem höheren Split-Verhältnis von 50 zu eins analysiert. Die Kreuzkontamination des Gehalts des Unterkieferdrüsenreservoirs nach Zusammensetzung der Dufour-Drüse wurde untersucht, indem Dufour-Drüsenproben untersucht wurden. Solche Schadstoffe wiesen späte Retentionszeiten auf, die bei etwa 29 Minuten begannen.

Die detektierten mutmaßlichen Metaboliten des Unterkieferdrüsenreservoirs wurden auf der Grundlage einer Kombination aus Ähnlichkeit von Spektrum und Retentionsindex mit einer hauseigenen Bibliothek identifiziert. Auf diese Weise war es möglich, die Identität von etwa 10 % der nachgewiesenen Metaboliten zu bestätigen, von denen einige als Verbindungen eins bis fünf aufgeführt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Metaboliten isolieren, extrahieren und bestimmen können, indem Sie sich für die MS-Messung entscheiden.

Einmal gemeistert, können die Isolierung, die Lösungsmittelextraktion und die Datenerfassung derselben Probe in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Abhängig von der Komplexität des Profils der flüchtigen organischen Verbindung variiert die Zeit, die für die Datenauswertung benötigt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Probe von der Entnahme bis zur Analyse dauerhaft gekühlt zu halten.

Außerdem muss vor dem Schnitt überprüft werden, ob der Gaster der Ameise physisch intakt ist. Dieses Verfahren kann auch mit einer vergleichenden oder absoluten Quantifizierung der Metaboliten kombiniert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die metabolische Zusammensetzung und die verschiedenen Umweltbedingungen oder die absoluten Mengen der Konservenbestandteile. Praktischerweise können die Extraktions-, Mess- und Datenauswertungsschritte dieses Protokolls auch auf mehrere biologische Systeme angewendet werden, wie z. B. andere Insekten, Mikroorganismen oder Pflanzen.