Name: Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung von Unterkieferdrüseninhalten bei Colobopsis explodens für die Volatilomanalyse mittels GC-MS. Diese Methode ermöglicht die Profilierung flüchtiger Metaboliten in der chemischen Ökologie von Ameisen.

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Finanzierung für diese Studie wurde durch die Wiener Wissenschafts-, Forschungs- und Technologiefonds (WWTF) LS13-048 zu ISD erhalten. Besonderer Dank geht an Diane W. Davidson (University of Utah, jetzt im Ruhestand) teilen ihr Wissen über die Bornean COCY Ameisen mit uns. Wir freuen uns über Verwaltungen der Kuala Apoi Field Studies Center (KBFSC) und Universiti Brunei Darussalam (UBD) für die Genehmigung des Projekts sowie Brunei Forstamt und Brunei Forschungs- und Innovationszentrum für die Erlaubnis, Ameisen sammeln und Zulassung und Erteilung von Ausfuhrgenehmigungen. Besonderer Dank geht an UBD und KBFSC Personal, vor allem Salleh bin Abdullah Muhammad Bat, Teddy Chua Wee Li, Masnah Mirasan, Rafhiah Kahar, Roshanizah Rösli, Rodzay Wahab, Chan Chin Mei und Kushan Tennakoon für unsere Forschung zu erleichtern.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

In diesem Manuskript präsentieren wir Ihnen ein komplettes Protokoll für die Analyse der Volatilome des Inhalts in der hypertrophierten MGRs C. Explodens kleinere Arbeiterameisen gefunden. Da die Ameisen verwendet, hier können "explodieren" und inhaltlich MGR unkontrolliert Auswerfen bei Berührung mit der Pinzette, empfiehlt es sich, eine "weiche" Sammlung Technik durch ein Insekt Absauganlage (Abbildung 1) zu verwenden. Für einige Ameisenarten, darunter COCY Ameisen ist es möglicherweise erforderlich, die maximale Anzahl der Ameisen zu fünf Personen pro 50 mL Fläschchen zu begrenzen, da ansonsten Selbstvergiftung der Ameisen (z. B. durch Anhäufung von Ameisensäure in den Gasraum) auftreten kann. Für das Einfrieren der Ameisen im Feld, kann eine coole Tasche gefüllt mit tiefgefrorene Kühlakkus verwendet werden. Die Proben schnell eingefroren und unter gekühlten Bedingungen (z. B. -20 ° C, am besten bei-80 ° C) gelagert werden sollten, aber es wird nicht empfohlen, um zu töten und die Ameisen in flüssigem Stickstoff zu speichern, da erhöhten Schaden ihre Drüsen mit dieser Methode beobachtet wurde.
Die vorgestellten Puffer und lösungsmittelfreie Dissektion Methodik eignet sich für den Erhalt der Wachs-wie Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt sowie anderen Drüsen im gefrorenen Arbeiterameisen. Für die Volatilome Analyse des Inhalts der C. ExplodensMGR sind wichtige Aspekte bei der Dissektion berücksichtigt werden kontinuierliche Kühlung von d Ameise (Schritt 2.1.4) und Minimierung der Kreuz-Kontaminationen der MG Proben mit anderen Drüse Inhalt/Flüssigkeiten im die Ameise Gaster (Schritt 2.5, Abbildung 4und Abbildung 15). Ein beträchtlicher Bruchteil der gefrorenen Ameisen beschädigt werden, da die Ameisen "", während der Probenahme explodiert oder während des Transports auf Trockeneis von der Probenahme-Website ins Labor beschädigt wurden. Wenn die Region Gaster gebrochen ist, eignen sich diese Ameisen nicht für die weitere Analyse (Abbildung 2, D). Wenn nur Antennen und Beine fehlen oder kaputt sind, können diese Ameisen noch für die Extraktion der MGR Inhalte und weitere Analysen verwendet werden. Da die MGR Inhalt abgekühlt haben C. Explodens Ameisen eine wachsähnliche Konsistenz ist geradlinig, mit dem Einsatz der Dissektion Nadeln (Schritt 2.5, Abbildung 3Eund Abbildung 14) zu isolieren. Zusätzliche Pflege muss werden beim Umgang mit der klebrigen MGR Inhalte. Es kann zu nichts kommen in körperlichen Kontakt mit ihm halten und haften auch oft an die Dissektion Zange, die erhöht das Risiko einer Kontamination von anderen Proben. Es ist notwendig, berühren nur die MGR-Inhalte mit der Dissektion Nadel und übertragen Sie es sofort in die Glasfläschchen für die Extraktion (Schritt 2.5 und 2.6) verwendet. Darüber hinaus empfiehlt es sich, die Dissektion mit einer MeOH/H2O Mischung reinigen beim Umschalten zwischen den Ameisen oder Drüse-Typen (Schritt 2,8).
Drüse-Inhalte von anderen Ameisenarten können in einem flüssigen Zustand auch bei Kühlung mit kältepackungen vorhanden sein. In diesem Fall werden die ganze Drüse einschließlich der Membran kann zunächst isoliert und anschließend punktiert, um den Inhalt zu erhalten. Flüssige Absonderungen können auch mit Hilfe von feinen Kapillare Pipetten erhalten werden. Mit einer durchschnittlichen Körperlänge von etwa 4-5 mm (ohne Antennen) gehören Arbeiter von C. Explodens , die kleineren Arten des Arbeitskreises COCY. Ihre oft geschwollen Gaster umfasst ca. 2-2,5 mm in der Länge und Breite von 1-1,5 mm. Arbeiter der bisher größten bekannten Arten der Gruppe COCY erreichen eine Größe von ca. 8 mm Körperlänge mit einer Gaster Größe von ca. 3 mm in der Länge und Breite von 2,5 mm. Da das Protokoll gut geeignet ist, um zu sezieren und untersuchen einzelne Ameisen und dabei die Größe der verschiedenen COCY Arten, die hier verwendeten Dissektion Instrumente und Mikroskop möglicherweise angepasst werden, um für kleinere Ameisen oder kleinere Organe gelten. Darüber hinaus kann die Anzahl der Ameisen pro Analyseprobe müssen erhöht werden.
Beim sezieren der Ameise für den MGR Inhalt, ist es wichtig, nicht zu beschädigen, anderen Drüsen oder den Darm - deren, die, die, die Inhalt Kreuz-die Probe (Schritt 2.5, Abbildung 4 und Abbildung 15) verunreinigen können. Im optimalen Fall sind nach dem Extrahieren des Inhalts MGR, DG, sowie das VG sichtlich intakt (Abbildung 4) gehalten. Kontaminationen mit dem Inhalt der DG, die unter die MGRs befindet, sind nur schwer vollständig zu vermeiden. Gründe dafür können auch die partielle Unterbrechung der Drüse Integrität während des Transports auf Trockeneis von der Probenahme-Website ins Labor. Es ist auch möglich, dass der DGs bei der Probenahme oder bei der Explosion, beschädigt, wie wir für die MGR in einer Reihe von untersuchten Ameisen bemerkt haben. Da der DG-Inhalt die gleiche Weise analysiert werden können wie die MGR (Abschnitte 3 und 4) Inhalt, können die Ergebnisse, die daraus resultierenden Daten nach Analyse der MGR zufriedene Beispiele (Kap. 6) verglichen werden. Im Falle von MGR Inhalt Extrakte von C. Explodens Ameisen erhalten beginnen auch in der DG enthaltenen Verbindungen zu spät in das Chromatogramm (Abbildung 12) eluieren. Um zu verhindern, DG zu verkennen Verbindungen für MGR Bestandteile, die jeweiligen Metaboliten von der weiteren Analyse ausgeschlossen werden können. Aus Studien zu anderen Ameisenarten ist bekannt, dass DGs auch (hoch) flüchtige Verbindungen1,24, enthalten können, die in der Regel früh in der GC-Chromatogramm eluieren.
In früheren Studien, die der Umgang mit der chemischen Zusammensetzung die MGR-Inhalte von COCY Ameisen, ganze Ameisen oder ihre ganze dabei waren analysierten16,17,18,23, während hier die MGR-Inhalt selbst stammen über Dissektion der Ameisen.
Analyse seziert MGR Inhalte ermöglicht Ermittler zahlreiche biochemische Untersuchungen, einschließlich Ermittlung der Metaboliten, die darin enthaltenen durchführen. Da hier die durchgeführte Studie zur Identifizierung von die flüchtigen Bestandteile in die MGR C. Explodensenthaltenen konzentriert, wurde GC-MS für die Analyse (Abschnitt 4) gewählt. Hierzu sollten die Extrakte idealerweise gemessen unmittelbar nach der Herstellung oder bis zur Analyse bei-80 ° C gelagert werden. Es sei darauf hingewiesen, dass (erweiterter) Lagerung chemische Veränderungen der Extrakte verursachen (siehe Hinweise nach Schritten 3.3 und 4.2). Da die Konzentration der MGR Inhalte verschiedener Größenordnungen abdecken kann, es möglicherweise notwendig, die MGR-Extrakte bei verschiedenen GC aufgeteilt Verhältnisse zu analysieren. Da die beiden wichtigsten Verbindungen in den MGR Inhalt der Ameisen ergriffen extrahieren, um veranschaulichen das Protokoll verursacht Spalte Überlastung bei einem Split-Verhältnis von 2:1 verwendet wurde, wurde in diesem Beispiel ein zweites Mal auf ein höheres Split-Verhältnis von 50: 1 (Schritt 4.3.1.2and Abbildung 5) analysiert. Die GC-MS-Parameter-Einstellungen im Abschnitt 4 präsentiert eignen sich für Daten generiert mit GC-MS-Geräte, die in der Tabelle der Materialienangegeben. Neben der RI Kalibrierstandards (Schritt 4.1.1) sollte ein Lösungsmittel-Rohling (Schritt 4.1.2) auch analysiert werden, um nicht-biologische Artefakte und Verunreinigungen während der nachfolgenden Datenanalyse zu erkennen. Für die Identifizierung der Metabolit ist es auch wichtig, authentische Standards der kommentierten Verbindungen unter den gleichen Bedingungen der GC-MS wie verwendet für die Analyse der Probe-Extrakte (5.4.7and folgende Schritte) zu messen. Um die Genauigkeit und Zuverlässigkeit der endgültigen Daten zu verbessern, empfiehlt es sich, alle Beispiel-Kategorien (Lösungsmittel-Blank, RI Kalibrierstandards, Probe-Extrakte und Standards) innerhalb der gleichen Messablauf zu analysieren. Darüber hinaus sollten die authentische Standards in einer Konzentration vergleichbar, die für die Probe-Extrakte beobachtet analysiert werden. Dadurch verbessern die Genauigkeit der RI Werte und Ähnlichkeit zwischen Probe und standard Massenspektren, die schließlich zu erhöhten und bedeutungsvoller Metabolit Annotation/Identifikation führen wird. Zu diesem Zweck können die Standards immer wieder mit verschiedenen Split Faktoren gemessen werden.
Metabolit Identifikation, die anspruchsvolle Software dient MetaboliteDetector Spektren Entfaltung und RI und Spektren Vergleich zu einer implementierten NIST-Bibliothek sowie über eine etablierte Hausbibliothek (Abschnitt 5). Es wird empfohlen, MetaboliteDetector auf einem 64-Bit LINUX-basierten Betriebssystem (z. B. KUBUNTU) laufen und das erzeugte kopieren *. CDF-Daten-Dateien (Schritt 4.4) aus dem portablen Datenträgers auf der lokalen Festplatte. MetaboliteDetector ist in der Lage, GC-MS-Rohdaten im Schwerpunkt oder Profil NetCDF-Format zu importieren. Die Software der meisten GC-MS-Instrumente sollten die aufgenommenen raw-Daten in diesem Format19umwandeln können. Vor Beginn der Analyse der Daten, ist es dringend empfohlen, die Literatur zur vorherigen MetaboliteDetector-Software-Versionen vertraut mit den Funktionen und der grafischen Schnittstelle19,25, zu lesen 26.
Für RI Kalibrierung und anschließender RI Wertberechnung der zusammengesetzten Gipfel in die Probe Extrakte vorhanden wird eine Bibliothek mit RIs und Spektren von RI Kalibrierstandards (hier: n-Alkanen) verwendet. Solch eine Bibliothek kann entweder selbst hergestellt werden oder eine bereits vorhandene ("CalibrationLibrary_Alkanes") können heruntergeladene27sein. Die zur Verfügung gestellten Kalibrator Standardbibliothek enthält RIs und Spektren für n-Alkane von C09 bis hin zu C39, die analysiert wurden, wie in Abschnitt 4 beschrieben. Die mitgelieferte Bibliothek ermöglicht Benutzern das Arbeiten mit Metabolit Detektor direkt mit der Kalibrierung ihrer Daten beginnen. Bei Bedarf kann diese Bibliothek auch mit zusätzlichen Einträge für weitere Alkane erweitert werden. Aufgrund der Ähnlichkeit der Referenz und experimentell abgeleitete RIs und Massenspektren (siehe Schritt 5.3 und Teilschritte, Abbildung 7, Bild 8, Bild 9), Beschriftung oder Kennzeichnung der Verbindungen kann sein durchgeführt (Schritt 5.4 und Teilschritte, ( Abbildung 11). Es ist auch wichtig, dass nach der automatisierten Datenverarbeitung mit MetaboliteDetector, der Benutzer manuell für richtige Peak Picking und Spektrum Dekonvolution prüft der Inspektion Massenspektren zugrunde liegt das "Dreieck" für jeden vermeintlichen Verbindung von Interesse. Darüber hinaus können abhängig von der GC-MS-Instrumentierung und die Parameter-Einstellungen, die für die Datengenerierung, Anpassungen der vorgestellten MetaboliteDetector Einstellungen erforderlich sein. Die MetaboliteDetector-Software ist in der Lage, viele weitere nützliche Operationen als in diesem Manuskript, z. B. Anzeige der extrahierten Ion aktuelle (EIC) Chromatogramme, Export der Chromatogramme als CSV, automatische Batch-Quantifizierung der erklärt Verbindungen und vieles mehr.
Das Protokoll präsentiert in dieser Handschrift kann als Anregung für Experimente, die von anderen Forschern mit Schwerpunkt auf Isolation von Drüsen oder Drüse Inhalt von Insekten sowie Volatilome Analyse und Metabolit Identifikation dienen.

Das übergeordnete Ziel des hier vorgestellten Workflows ist die allgemeine Untersuchung der chemischen Zusammensetzungen in Ausscheidungen von Insekten. Dies geschieht mit dem vorrangigen Ziel der Aufklärung die ökologische Rolle der Sekretion als Ganzes oder einzelne Verbindungen davon. Darüber hinaus sind wir bei der Untersuchung der Stoffwechselwege zugrunde liegen die Verbindungen in die jeweiligen Sekrete interessiert. Vor allem Drüse Inhalt von Ameisen (Hymenoptera, Ameisen) haben steigende Zinsen in den letzten Jahren gewonnen, da diese Quellen bisher unerforschten potentiell bioaktiven Substanzen (Klebstoffe, Antibiotika, etc.)1, bieten 2. kleinere Arbeiterameisen einiger Arten gehören zu den COCY Gruppe3,4 können solche Verbindungen in ihre hypertrophierten MGRs, die von der Mundwerkzeuge, die Gaster5,6verlängern. Wenn von vermeintlichen Feinden bedroht, kleinere Arbeiter von C. Explodens7 und einige verwandte Arten machen Verwendung von ihrer MGR Inhalt auf ungewöhnliche Weise: sie opfern sich durch Brechung ihre gastral Wand zum Auswerfen des klebrigen Inhalts der MGRs explosionsartig auf den Gegner, sterben worauf der vermeintliche Feind festgehalten wird und kann sogar5,6,8,9. Der Zweck der Entwicklung und den Einsatz der hier vorgestellten Methoden war, um das Verständnis der chemischen Zusammensetzung und der Art der vorläufig toxische Bestandteile dieser Ameise Sekretion zu verbessern.
Zu diesem Zweck präsentieren wir ein Protokoll für die Zerlegung des C. Explodens Arbeiterameisen gastral Portion inhaltlich wachsähnliche MGR mit nachfolgenden Lösungsmittel-Extraktion und Analyse von GC-MS zu erhalten.
GC-MS-Analyse gehört zu den etablierten Methoden für die Profilerstellung und Identifizierung von flüchtigen Metaboliten (Volatilome) von Insekten. Typische Analyten von Interesse an Ameisen gehören kutikulären Kohlenwasserstoffe10, Botenstoffe11, und im Allgemeinen mit biologischer Aktivität12Verbindungen. Muster erhalten ganze Tiere oder Körperteile und Flüssigkeiten isoliert über Dissektion der Insekten13,14. Probe Präparationstechniken gehören Extraktion der darin enthaltenen Metaboliten mit dem Einsatz von Lösungsmitteln14 oder Headspace-Solid-Phase-Microextraction (HS-SPME)15.
Metabolomic Studien ist es wichtig, dass die Proben unmittelbar nach der Probenahme, schnell eingefroren werden, um Veränderungen in der chemischen Zusammensetzung und Menge der Verbindungen zu minimieren. Die Ameisen, die für diese Studie verwendet wurden durch schnelles Gefrieren vor Ort in eine coole Tasche gefüllt mit tiefgefrorene Kühlakkus getötet. Die Proben wurden anschließend in einem-20 ° C-Gefrierschrank elektrisch Generator angetrieben, bevor sie in das Labor auf Trockeneis transportiert wurden gespeichert. Hier vorgestellten Dissektion-Verfahren bietet die Möglichkeit, MGR Inhalt ohne Analyse der gesamten Ameise oder die Gaster als Ganzes, zu isolieren, da es verschiedene COCY Arten16,17,18zuvor getan hat. Darüber hinaus ermöglicht der vorgestellte Protokoll auch direkten Zugang und Analyse der umgebenden Drüsen und Gewebe, wie die Venom Drüse (VG)5,8, die Dufour Drüse (DG)8oder den Darm in anderen biologischen Studien oder zu Suchen Sie nach möglichen Kreuz-Kontaminationen während der Handhabung oder Dissektion der Ameisen eingeführt. Um die Änderungen in der chemischen Zusammensetzung die MGR Inhalte während der Dissektion, Auftauen Proben oder durch den Einsatz von Chemikalien zu minimieren, wurde die Dissektion Prozess optimiert, um auf einem Kühlakku (-20 ° C), ohne die Verwendung von jeder zusätzlichen Puffern durchgeführt werden, Spüllösungen oder Lösungsmittel. Die Proben über diese Methode eignen sich für qualitative und quantitative Fragen zu beantworten.
Analyse der Daten zum Zwecke der vermeintlichen Metabolit Annotation und Identifikation erfolgt über Open-Source-Software MetaboliteDetector19, das für die automatische Analyse der Metabolomik GC-MS-basierte Daten entwickelt wurde. Es erkennt einzelne Ionen-Gipfeln im Chromatogramme, führt einen Dekonvolution Schritt und Extrakte der deconvoluted Massenspektren von chemischen Verbindungen, die in den analysierten Proben enthalten. Vermeintliche Identifizierung von Verbindungen mit MetaboliteDetector basiert auf den ermittelten Retention-Index (RI; der Kovats RI kann automatisch von der Software berechnet werden) sowie Ähnlichkeit der deconvoluted Massenspektren. RI und spektrale Match-Faktor kann gegengeprüft gegen entweder bestehende Präsenzbibliotheken (, die importiert werden können wenn sie in der gemeinsamen NIST-Format sind,), oder eine etablierte Hausbibliothek. Dies ist in Übereinstimmung mit den Richtlinien für die (vermeintlich) zusammengesetzte Identifizierung vorgeschlagen, z. B.durch die chemische Analyse arbeiten Gruppe (CAWG) der Metabolomik Standards Initiative (MSI), wo ein Minimum von zwei unabhängigen und orthogonal Daten bezogen auf eine authentische Verbindung (hier Retention time (RT) /RI und Massenspektrum) analysiert unter identische Versuchsbedingungen werden nach Bedarf zu bestätigen-Roman Metabolit Identifikationen20vorgeschlagen.
Das komplette Experiment ist auf dem MGR-Inhalt der Gattung COCY Modell C. Explodensdurchgeführt, aber die Dissektion Schritte auch an die anderen Drüsen vorhanden in der Ameise Gaster isolieren angepasst werden können. Darüber hinaus während präsentieren wir ein Protokoll für die umfassende Analyse der Volatilome des MGR Inhalts, die generische Teile des Workflows beschreiben, Extraktion, GC-MS Messung und Auswertung der Daten auch für die Analyse und (vermeintlich) einsetzbar Kennung der flüchtige Stoffwechselprodukte im Allgemeinen.
Da die Experimente in diesem Manuskript beschrieben auf Insekten durchgeführt werden, ist keine ethische Genehmigung erforderlich. Feldarbeit, Probenahme von den Ameisen, sowie ihre Verwendung zur Veröffentlichung sind gemäß den Richtlinien zur Regelung dieses Projekts durch die Universiti Brunei Darussalam, Forschung und Innovation Centre und Brunei Forstamt, Brunei Brunei Darussalam.

<table><tbody><tr><td>Röhrchen 50 ml, 115 x 28 mm, flacher/konischer Boden PP</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td>siehe Abbildung 1 in der Handschrift</td></tr><tr><td>PVC-Schläuche</td><td>Rehau</td><td>290 4489</td><td>siehe Abbildung 1 in der Handschrift</td></tr><tr><td>Maschenweite, Edelstahl, Maschenweite 0,63 mm</td><td>Antstore</td><td>1000378</td><td>siehe Abbildung 1 in der Handschrift</td></tr><tr><td>Gefrierschrank</td><td>Severin</td><td>KS 9890</td><td>&nbsp;-20 & Grad; C oder untere</td></tr><tr><td>Polystyrol-Schaumstoffbox, Innenmaße 155 mm x 100 mm x 45 mm</td><td>Thorsten Koch</td><td>4260308590481</td><td></td></tr><tr><td>Petrischale, Glas, 100 mm x 15 mm</td><td>Aldrich</td><td>BR455742</td><td></td></tr><tr><td>Kühlakku 150 mm x 100 mm</td><td>Elite Bags</td><td>1998</td><td>einfrieren auf -20 & Grad; C</td></tr><tr><td>Eimer mit Crushed Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,5 mL Kurzgewindefläschchen, 32 x 11,6 mm, Klarglas, 1. hydrolytische Klasse, weit öffnendes</td><td>La-Pha-Pack</td><td>11090500</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlüsse für 1,5 mL Kurzgewindefläschchen, geschlossen, Silikon weiß/PTFE rotes Septum, 55° Shore A, 1,0 mm</td><td>La-Pha-Pack</td><td>9151799</td><td></td></tr><tr><td>Stereomikroskop</td><td>Bresser</td><td>5806100</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, superfeine Spitze gebogen</td><td>Medizinische Instrumente May, Norman May</td><td>PI-0005B</td><td></td></tr><tr><td>Pinzette, superfeine Spitze gerade</td><td>blauINOX</td><td>BL-3408</td><td></td></tr><tr><td>Präpariernadel 140 mm, spitz, gerade</td><td>Heinz Herenz Medizinalbedarf GmbH</td><td>1110301</td><td></td></tr><tr><td>Methanol, LC-MS CHROMASOLV, Honeywell Riedel-de Ha&euml; n</td><td>fisher scientific</td><td>15654740</td><td></td></tr><tr><td>Destilliertes Wasser</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rotizell-Tissue-T&uuml; cher</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>0087.2</td><td></td></tr><tr><td>Essigsäureethylester ROTISOLV &ge; 99,8 %</td><td>Carl Roth GmbH + Co.KG</td><td>4442,1</td><td>Frost auf -20 &Grad; C</td></tr><tr><td>Vortex Genie 2</td><td>neoLab</td><td>7-0092</td><td></td></tr><tr><td>0,1 mL Mikroeinsätze für 1,5 mL Kurzgewindefläschchen, 31 x 6 mm, Klarglas, 1. hydrolytische Klasse, 15 mm Spitze&nbsp;</td><td>La-Pha-Pack</td><td>06090357</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlüsse für 1,5 mL Kurzgewindefläschchen, mit Loch, RedRubber/PTFE-Septum, 45 μm Shore A, 1,0 mm</td><td>La-Pha-Pack</td><td>9151819</td><td></td></tr><tr><td>Alkan-Standardlösung C8-C20</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>04070</td><td></td></tr><tr><td>Alkan-Standardlösung C21-C40</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>04071</td><td></td></tr><tr><td>n-Hexan SupraSolv</td><td>Merck</td><td>104371</td><td></td></tr><tr><td>GC-Autosampler, z.B. MPS2XL-Twister</td><td>Gerstel</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agilent Gaschromatograph 6890 N</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schwanenhals splitless Liner</td><td>Restek</td><td>22406</td><td></td></tr><tr><td>Helium (5,0 - F50)</td><td>Messer</td><td>102532501</td><td></td></tr><tr><td>GC Kapillarsäule HP-5MS UI 30 m &mal; 0,25 mm & mal; 0,25 &Mikro; m</td><td>Agilent</td><td>19091S-433UI</td><td></td></tr><tr><td>Agilent Massenselektiver Detektor 5975B</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MSD ChemStation Datenanalyse Anwendungssoftware&nbsp;</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaboliteDetector Software (3.1.Lisa20170127Ra-Linux)</td><td>Hiller K</td><td></td><td>download von: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr><tr><td>Calibration Library for MetaboliteDetector</td><td>Hiller K</td><td></td><td>download von: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr><tr><td>MD Conversion Tool for NIST-library</td><td>Hiller K</td><td></td><td>download von: http://metabolitedetector.tu-bs.de/node/10</td></tr></tbody></table>

isolierung der unterkiefer drüse reservoir inhalt von bornean "explodierende ameisen (ameisen) für die volatilome analyse von gc-ms und metabolitedetector

Isolation of Mandibular Gland Reservoir Contents from Bornean 'Exploding Ants' (Formicidae) for Volatilome Analysis by GC-MS and MetaboliteDetector

Dieses Manuskript soll ein Protokoll beschreiben Metabolomic Analyse von Bornean "explodierende Ameisen" Colobopsis Cylindrica (COCY) Gruppe zu präsentieren. Zu diesem Zweck ist die Modell-Arten C. Explodens gebrauchte. Ameisen gehören zur Kaste kleine Arbeiter besitzen charakteristische hypertrophierten mandibulares Drüsen (MGs). Im territorialen Kampf verwenden sie den viskosen Inhalt ihrer vergrößerten Unterkiefer Drüse Stauseen (MGRs) rivalisierende Arthropoden in charakteristischen selbstmörderisch "Explosionen" durch freiwillige Ruptur der gastral Integument (Protozoen) zu töten. Wir zeigen das Sezieren von ArbeiterInnen dieser Art für die Isolierung des gastral Teils wachsähnliche MGR Inhalt sowie auflisten die notwendigen Schritte für Lösungsmittel-Extraktion der darin enthaltenen flüchtigen Verbindungen mit nachfolgenden Gas erforderlich Gaschromatographie-Massenspektrometrie (GC-MS) Analyse und vermeintliche Identifizierung von Metaboliten im Extrakt enthalten. Die Dissektion Prozedur erfolgt unter gekühlten Bedingungen und ohne den Einsatz von jedem Dissektion Pufferlösung, die Änderungen in der chemischen Zusammensetzung die MGR-Inhalte zu minimieren. Nach Lösungsmittel Extraktion der flüchtige Stoffwechselprodukte, die darin enthaltenen werden die notwendigen Schritte für die Analyse der Proben über Flüssigkeit-Injektion-GC-MS präsentiert. Zu guter Letzt zeigt Datenverarbeitung und vermeintliche Metabolit Identifikation mit dem Einsatz von Open-Source-Software MetaboliteDetector. Mit diesem Ansatz die Profilerstellung und Identifizierung von flüchtigen Metaboliten in MGRs Ameisen gehören zu den COCY Gruppe über GC-MS und die MetaboliteDetector-Software möglich.

Minorarbeiterinnen Ameisenarten Colobopsis Explodens werden indiziert, um den Wachs-wie Inhalt gespeichert in ihre hypertrophierten Unterkiefer Drüse Lagerstätten für nachfolgende Lösungsmittel-Extraktion und Analyse von Gaschromatographie-Massenspektrometrie zu isolieren. Die Beschriftung und Kennzeichnung an flüchtigen Bestandteilen, die mit der Open-Source-Software MetaboliteDetector ist ebenfalls beschrieben.

Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean "explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector

The aim of this manuscript is to present a protocol describing the metabolomic analysis of Bornean &#39;exploding ants&#39; belonging to the Colobopsis ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen der Insekten-Metabolomik zu beantworten. Der Ansatz der Metabolitenprofilierung kann verwendet werden, um die chemische Ökologie von Ameisen zu untersuchen, indem die Rolle der flüchtigen Bestandteile in der Interaktion mit anderen Organismen aufgeklärt wird. Der Hauptvorteil des vorgestellten Workflows besteht darin, dass er aus zwei unterschiedlichen Teilen besteht, die grundsätzlich unabhängig voneinander angewendet werden können.Erstens, die physikalische Isolierung des Unterkieferdrüsenreservoirs und seines Inhalts, und zweitens, die ungezielte Profilerstellung und Identifizierung flüchtiger organischer Bestandteile in der biologischen Probe von Interesse. Das Verfahren wird von Michaela Hoenigsberger, einer talentierten Doktorandin aus meinem Labor, demonstriert. Reinigen Sie vor dem Präparieren der Ameisen in einem Abzug eine Petrischale aus Glas und die Sezierinstrumente mit Papiertüchern und einer Mischung aus Methanol und Wasser.Lagern Sie das Gericht bei minus 20 Grad Celsius. Nehmen Sie dann die Masse von 1,5-Milliliter-Kurzgewindefläschchen einschließlich ihrer Schraubverschlüsse, die Silikon-PTFE-Septen enthalten. Lagern Sie die Fläschchen auf Eis.Legen Sie als Nächstes eine gefrorene, formbare Kühlpackung in eine Styroporschaumbox. Dann die Petrischale auf den Kühlakku laden und eine gefrorene Ameise in die Schale geben. Untersuchen Sie nun die Ameise mit einem Stereomikroskop.Überprüfen Sie die Unversehrtheit der Magenkammern. Die Ameise muss eine intakte Gasterregion haben. Verwenden Sie keine Ameisen mit flachen Gastern oder Spuren von verhärtetem Unterkieferdrüsenreservoir auf ihren Körperoberflächen.Isoliere nun den Inhalt des Unterkieferdrüsenreservoirs von der Ameise. Benutze eine Pinzette, um das Propodium und den Blattstiel zu greifen, und ziehe dann diese Körpersegmente vorsichtig auseinander. Fassen Sie dann den Gaster bei Tergit vier mit einer feinen Pinzette.Nimm mit einer anderen Pinzette Tergit eins und entferne den Tergit vorsichtig, indem du ihn abziehst. Wiederhole diesen Vorgang, um die Tergite zwei und drei abzureißen, so dass der Gastrol-Teil der Unterkieferdrüsenreservoirs größtenteils sichtbar ist. Die Reservoire der Unterkieferdrüsen sind bei C.Explodens Arbeiterameisen gelb gefärbt, aber die Farbe kann von weiß über gelb bis rot bei anderen Arten reichen.Entfernen Sie anschließend mit einer Präpariernadel vorsichtig den wachsartigen Inhalt der paarigen Unterkieferdrüsenreservoire, indem Sie ihn aus dem Magenkompartiment kratzen. Entfernen Sie nur die Teile des Unterkieferdrüsenreservoirs, die isoliert werden können, ohne Druck auf die anderen im Ameisengaster vorhandenen Drüsen und Körperstrukturen auszuüben. Es ist nicht notwendig, den gesamten Inhalt des Unterkieferreservoirs zu sammeln.Nehmen Sie nun den Inhalt des Unterkieferdrüsenreservoirs auf, indem Sie ihn vorsichtig mit der Spitze der Seziernadel berühren, bis er daran kleben bleibt. Übertragen Sie dann den Drüseninhalt in ein kaltes 1,5-Milliliter-Fläschchen mit kurzem Gewinde. Es kann erforderlich sein, die Nadelspitze entlang der Wand des Fläschchens zu bewegen und den Drüseninhalt auf die Wand des Fläschchens zu schmieren.Bewahren Sie die Sammlung abgedeckt und auf Eis auf, bis sie analysiert werden kann. Reinigen Sie die Instrumente und die Schale zwischen den Dissektionen erneut mit dem Methanol-Wasser-Gemisch. Um eine analytische Probe herzustellen, kombinieren Sie den Inhalt des Drüsenreservoirs mehrerer Ameisen.In diesem Fall werden die Drüseninhalte von fünf C.explodens Arbeiterameisen gepoolt. Für eine Kontrolle entnehmen Sie Proben, die aus der Dufour-Drüse bestehen, die an die Unterkieferdrüsenreservoire angrenzt. Vor der Extraktion des Drüseninhalts sind die Massen der analytischen Proben zu bestimmen.Fügen Sie dann 14 Teile eiskaltes hochreines Ethylacetat nach Volumen zu einem Teil Gewebe nach Masse hinzu. Wirbeln Sie das Präparat fünf Minuten lang unter gekühlten Bedingungen. Zentrifugieren Sie anschließend die Proben 10 Minuten lang und sammeln Sie die Überstände.Etwa 55 bis 75 Mikroliter Überstand werden von einer Probe von fünf Ameisen erwartet. Übertragen Sie jeden Überstand in ein vorgekühltes 1,5-Milliliter-Kurzgewindefläschchen mit einem 0,1-Milliliter-Mikroeinsatz und verschließen Sie die Fläschchen mit Schraubverschlüssen mit Löchern und roten PTFE-Gummisepten. Für eine vollständige GCMS-Messsequenz bereiten Sie ein 1,5-Milliliter-Kurzgewindefläschchen mit einer Retentionsindex-Kalibrationsmischung vor, die durch Verdünnen handelsüblicher Alkan-Standardlösungen in Hexan auf acht Milligramm pro Milliliter pro Verbindung hergestellt wird.Bereiten Sie dann ein weiteres Fläschchen mit reinem Ethylacetat vor, das als Lösungsmittelrohling dient. Auf das gekühlte Autosampler-Tablett des Gaschromatographen wird zuerst der Lösungsmittelrohling, dann das Retentionsindex-Kalibrantengemisch, drittens der Extrakt aus dem Unterkieferdrüsenreservoir und viertens der Extrakt aus dem Dufour-Drüsengehalt geladen. Legen Sie die Proben mit der Schale auf Eis, um sie zum Gaschromatographen zu transportieren.Setzen Sie das Tablett in den gekühlten Autosampler ein. Für jede Probe wird ein Mikroliter Aliquat in das GC-Massenspektrometer injiziert, um die chromatographische Trennung auf einer für die Zielverbindungen geeigneten Säule durchzuführen. Zum Beispiel eine HP-5MS UI-Spalte.Legen Sie als Nächstes die entsprechenden GC-Parameter fest. Verwenden Sie zum Beispiel Helium am Trägergas mit einem konstanten Säulenfluss von einem Milliliter pro Minute. Verwenden Sie eine Ofentemperaturrampe ab 40 Grad Celsius für zwei Minuten, gefolgt von einer Rampe von 10 Grad Celsius pro Minute auf bis zu 330 Grad Celsius.Gefolgt von einer siebenminütigen Pause. Mit diesen Parametern stellen Sie die Einlasstemperatur auf 270 Grad Celsius ein. Passen Sie nun bei Bedarf die Teilungsverhältnisse für die GC-Massenspektrometrie an.Injektion, so dass sie angemessene Peakformen und -intensitäten für die interessierenden Verbindungen liefern. Stellen Sie die Zusatztemperatur auf 350 Grad Celsius ein. Für die MassenspektrometrieVerwenden Sie die folgenden Parameter. Eine MS-Quelltemperatur von 230 Grad Celsius, eine MS-Quad-Temperatur von 150 Grad Celsius und ein Scanbereich von 30 mit niedriger Masse bis 500 mit hoher Masse, was zu einer Scanrate von etwa drei Scans pro Sekunde führt. Und eine Lösungsmittelverzögerung von 4,1 Minuten für den Lösungsmittel-Blindwert und die Versuchsproben oder eine Lösungsmittelverzögerung von 6,1 Minuten für das Retentionsindex-Kalibrantengemisch.Wenn die Messungen abgeschlossen sind, öffnen Sie die GCMS-Datenanalysesoftware und exportieren Sie die Daten als AIA-Projektdatei auf ein tragbares Speichergerät, um die Datenübertragung auf einen Computer mit einem 64-Bit-Linux-basierten Betriebssystem zu erleichtern. Um die Daten zu analysieren, befolgen Sie die Beschreibung des Protokolltextes zur Verwendung der Metabolitendetektorsoftware. Im Feld wurden Ameisen gesammelt und zwei Tage lang bei minus 20 Grad Celsius eingefroren und dann bis zur Analyse bei minus 80 Grad Celsius gelagert.Der Inhalt des Unterkieferdrüsenreservoirs von fünf C.explodens Arbeiterameisen wurde gepoolt und mit GCMS gemessen. Die Datenanalyse ergab Dutzende von mutmaßlichen Verbindungen mit Drüseninhalten. Die beiden dominanten Metaboliten im Extrakt aus dem Unterkiefer-Reservoir-Gehalt führten zu einer Überlastung der Säulen.Deshalb wurde die gleiche Probe erneut mit einem höheren Split-Verhältnis von 50 zu eins analysiert. Die Kreuzkontamination des Gehalts des Unterkieferdrüsenreservoirs nach Zusammensetzung der Dufour-Drüse wurde untersucht, indem Dufour-Drüsenproben untersucht wurden. Solche Schadstoffe wiesen späte Retentionszeiten auf, die bei etwa 29 Minuten begannen.Die detektierten mutmaßlichen Metaboliten des Unterkieferdrüsenreservoirs wurden auf der Grundlage einer Kombination aus Ähnlichkeit von Spektrum und Retentionsindex mit einer hauseigenen Bibliothek identifiziert. Auf diese Weise war es möglich, die Identität von etwa 10 % der nachgewiesenen Metaboliten zu bestätigen, von denen einige als Verbindungen eins bis fünf aufgeführt sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Metaboliten isolieren, extrahieren und bestimmen können, indem Sie sich für die MS-Messung entscheiden.Einmal gemeistert, können die Isolierung, die Lösungsmittelextraktion und die Datenerfassung derselben Probe in etwa zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie ordnungsgemäß durchgeführt wird. Abhängig von der Komplexität des Profils der flüchtigen organischen Verbindung variiert die Zeit, die für die Datenauswertung benötigt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, die Probe von der Entnahme bis zur Analyse dauerhaft gekühlt zu halten.Außerdem muss vor dem Schnitt überprüft werden, ob der Gaster der Ameise physisch intakt ist. Dieses Verfahren kann auch mit einer vergleichenden oder absoluten Quantifizierung der Metaboliten kombiniert werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten, wie z.B. die metabolische Zusammensetzung und die verschiedenen Umweltbedingungen oder die absoluten Mengen der Konservenbestandteile. Praktischerweise können die Extraktions-, Mess- und Datenauswertungsschritte dieses Protokolls auch auf mehrere biologische Systeme angewendet werden, wie z. B. andere Insekten, Mikroorganismen oder Pflanzen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

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Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector (Video) | JoVE Journal

Isolierung der Unterkiefer Drüse Reservoir Inhalt von Bornean "explodierende Ameisen (Ameisen) für die Volatilome Analyse von GC-MS und MetaboliteDetector

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