Protokoll zur Herstellung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen
25. September 2019
Chronische Wunden werden aus akuten Wunden auf einem diabetischen Mausmodell entwickelt, indem sie nach einer schweren Kutanwunde einen hohen Grad an oxidativem Stress induzieren. Die Wunde wird mit Inhibitoren für Katathase und Glutathionperoxidase behandelt, was zu einer beeinträchtigungen Heilung und Biofilmentwicklung durch Bakterien im Hautmikrobiom führt.
Dieses Mausmodell kann helfen, Fragen im medizinischen Bereich der Wundchronik zu beantworten. Der große Vorteil dieses Modells ist, dass die chronischen Wunden bei Mäusen viele Aspekte der chronischen Wunden beim Menschen imitieren. Um zu beginnen, legen Sie die Maus auf eine saubere Oberfläche und halten Sie sie an Ort und Stelle, indem Sie die Basis ihres Schwanzes kneifen.
Dann bereiten Sie die Haarschneider vor und sind bereit, sie schnell wegzuziehen, wenn die Maus plötzliche Bewegungen macht. Rasieren Sie den ganzen Rücken vom Hals bis zum Schwanz einschließlich rund um den Schwanz. Führen Sie die Klinge leicht gegen die Richtung des Haarwachstums für den effizientesten Schnitt.
Drücken Sie die Clippers nicht tief in die Haut, da dies prellungen oder schneiden kann. Als nächstes bereiten Sie die Haut für eine Anwendung der Enthaarungslotion. Befeuchten Sie die Haut mit einem wassergetränkten Papiertuch, um chemische Verbrennungen zu verhindern.
Drücken Sie leicht mit genügend Druck, um die geschnittenen Haare auf die Haut zu befeuchten. Dann, während die Haut nass ist, reiben Sie eine kleine Puppe op der Enthaarungslotion in den rasierten Bereich für 15 bis 20 Sekunden. Nach dem Auftragen lassen Sie die Lotion 20 bis 45 Sekunden lang mit der Haut reagieren.
Vor dem Abspülen der Lotion, leicht wischen einige Lotion an verschiedenen Stellen, um die Reaktion zu überprüfen. Wenn die Haut rosa und haarlos ist, ist die Reaktion vollständig. Greifen Sie dann die Maus, um sie abzuwaschen.
Drücken Sie mit der nicht dominanten Hand mit dem Daumen die Basis ihres Schwanzes gegen die Handfläche und schließen Sie die anderen Finger. Dann mit der Nase der Maus auf und weg vom Wasser, lassen Sie Wasser über den Rücken des Tieres laufen. Dann schnell, aber sanft, reiben Sie die Rückseite der Maus mit der anderen Hand, um die Lotion wegzuwaschen.
Nach dem Entfernen der enthaarten Creme die Haut mit einem Papiertuch trocknen. Es ist wichtig, keine Lotion auf die Ohren, den Schwanz oder irgendwo in der Nähe des Gesichts aufzutragen. Wenn dies geschehen sollte, wischen Sie sofort die Lotion mit einem nassen Handtuch weg und laufen Sie dann Wasser über die Maus, um Schäden an diesen Bereichen zu verhindern.
Wenn dunkle Flecken nach der Verwendung der Creme bemerkt werden, wenden Sie die Creme erneut auf diese Bereiche an. Die dunklen Flecken der Haut wachsen Haare schneller während der Dauer des Experiments. Also schneiden Sie die Haare kurz alle drei bis fünf Tage, wenn nötig.
Ein oder zwei Pflaster, die sich nicht über der Wundstelle befinden, ist akzeptabel, aber wenn die Rückseite der Maus mehr dunkle Flecken hat, verwenden Sie sie nicht für das chronische Wundmodell. Nach dem Entfernen der Haare, hausieren Sie die Maus allein für mindestens einen Tag vor der Wundung, weil die Haut zu empfindlich von der Enthaarungslotion sein wird. 30 Minuten vor der Operation die Maus mit 120 Mikroliter Buprenorphin intraperitoneal in steriles PBS injizieren.
Alle Volumes in diesem Verfahren gehen von einer 60-Gramm-Maus aus. 20 Minuten vor der Operation die Maus mit 480 MikroliterAT ATZ intraperitoneal in steriles PBS injizieren. Teilen Sie das Volumen auf beiden Seiten des Bauches.
Nach der Verabreichung des ATZ, legen Sie die Maus in einem kleinen Kunststoffbehälter auf einem warmen Heizkissen, bis die Operation beginnt. Bedecken Sie den kleinen Behälter mit einem Papiertuch, um die Hitze einzudämmen. Die Maus sollte sich beruhigen, wenn sie sich erwärmt.
Nach Bestätigung eines anästhesierten Zustands, fahren Sie mit der Verwundung fort. Um den Wundvorgang zu beginnen, sprühen Sie ein Chemisches mit 70% Ethanol, um die Rückseite der Maus zu wischen, um die Wundstelle und die Hautoberfläche zu reinigen. Wischen Sie nicht übermäßig ab, oder es besteht die Gefahr, dass die auf der Haut vorhandenen Bakterien abgetötet werden.
Der Erfolg des chronischen Wundmodells beruht auf nicht-sterilen Bedingungen. Diese Mäuse sind nicht keimfrei und befinden sich in einem konventionellen Vivarium. Das bakterielle Mikrobiom, das sich auf der Haut befindet, ist entscheidend für die spätere Einleitung und Entwicklung chronischer Wunden bei der Behandlung mit Inhibitoren antioxidativer Enzyme.
Betrachten Sie nun, wo die Wunde. Im Idealfall verwenden Sie die dorsale Seite der Maus zentriert und weg von dunklen Flecken der Haut. Führen Sie nun die Verwundung sanieren, um in 30 bis 45 Sekunden zu kleiden.
Drücken Sie zunächst leicht einen sieben Millimeter großen Hautbiopsie-Punch auf die gewünschte Wundstelle und drehen Sie den Schlag gerade tief genug um, um einen Eindruck vom Schlag zu hinterlassen. Dann verbrauchen Sie die skizzierte Haut, indem Sie die Mitte des Stempels mit einer Pinzette hochziehen und den Umriss mit einer chirurgischen Schere entlang schneiden. Nach fertigstellung, bedecken Sie die Wunde fest mit einem halben Stück transparenten Filmverband.
Innerhalb von 10 Minuten nach der Verwundung, wenden Sie einen 60 Mikroliter Aliquot von MSA in sterilen PBS und legen Sie MSA topisch auf die Wunde. Später, sechs Stunden nach der Operation, verabreichen Sie eine weitere Tutvon Buprenorphin. Zusätzliche Dosen können bei Bedarf gegeben werden.
Chronische Wundinitiation findet in weniger als sechs Stunden statt und der Wundrand wird sichtbar von oxidativem Stress verändert. Eine chronische Wunde ist eine Wunde, die offen bleibt, im Vergleich zur ersten Wunde vergrößert und Biofilm enthält. Nach 20 Tagen ist die Wunde in voller Chronizität.
Biofilm bildende Bakterien, die die Wundstelle dominieren, sind Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, und verschiedene Staphylococcus und Corynebacterium Arten. Diese Bakterien sind auch in menschlichen chronischen Wunden gefunden. Nachdem Sie sich dieses Video angeschaut haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man chronische Wunden bei Mäusen erzeugt.
Sobald Sie diese chronischen Wunden festgestellt haben, können Sie sie verwenden, um viele zelluläre molekulare Mechanismen zu untersuchen, die an der Initiierung der Wundchronik beteiligt sind.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein detailliertes Protokoll zur Erzeugung chronischer Wunden bei db/db-/--Mäusen vor, die den Eigenschaften menschlicher diabetischer chronischer Wunden eng nachempfunden sind. Das Modell nutzt die Induktion von oxidativem Stress und die Hemmung zentraler antioxidativer Enzyme, um Wunden zu erzeugen, die offen bleiben, Biofilme bilden und chronisch verlaufen, wodurch ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Mechanismen der Entstehung und Aufrechterhaltung chronischer Wunden bereitgestellt wird.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Forschung zur Wundheilung
- Diabetes-Komplikationen
- Tiermodelle
Hintergrund
- Chronische Wunden entstehen durch eine Fehlregulation zellulärer und molekularer Heilungsprozesse.
- Sie betreffen Millionen von Menschen und sind kostenintensiv in der Behandlung.
- Bestehende Modelle weisen Einschränkungen bei der Nachbildung menschlicher Merkmale chronischer Wunden auf.
- Biofilmbildung und anhaltend offene Wunden sind Kennzeichen der Chronizität.
Zweck der Studie
- Ein reproduzierbares Mausmodell etablieren, das menschliche diabetische chronische Wunden genau widerspiegelt.
- Die Untersuchung der zellulären und molekularen Mechanismen ermöglichen, die für die Chronifizierung von Wunden verantwortlich sind.
- Eine Plattform bereitstellen, um therapeutische Ansätze zur Behandlung chronischer Wunden zu testen.
Verwendete Methoden
- Vorbereitung der db/db-/--Mäuse durch Rasieren und Enthaaren der dorsalen Haut.
- Gabe von Buprenorphin zur Analgesie und ATZ zur Hemmung von antioxidativen Enzymen.
- Erzeugung einer vollständigen dorsalen Wunde mittels einer 7-mm-Biopsie-Stanze und chirurgischer Exzision.
- Topische Applikation von MSA (einem Inhibitor), um oxidativen Stress an der Wundstelle zu induzieren.
- Aufrechterhaltung nicht steriler Bedingungen zur Erhaltung des natürlichen Hautmikrobioms.
- Beobachtung und Dokumentation des Wundverlaufs, der Biofilmbildung und Chronifizierung.
Hauptergebnisse
- Wunden weisen innerhalb weniger Stunden einen hohen oxidativen Stress und veränderte Wundränder auf.
- Biofilme bilden sich natürlich, wobei Bakterien wie Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Staphylococcus und Corynebacterium-Arten vorhanden sind.
- Die Wunden werden innerhalb von 20 Tagen vollständig chronisch und können über 60 Tage offen bleiben.
- Das Modell reproduziert wesentliche Merkmale menschlicher diabetischer chronischer Wunden.
Schlussfolgerungen
- Dieses Mausmodell bietet eine robuste Plattform zur Untersuchung der Pathogenese chronischer Wunden.
- Es ermöglicht die Erforschung des Zusammenspiels zwischen oxidativem Stress, Mikrobiom und der gestörten Wundheilung.
- Das Protokoll unterstützt die Entwicklung und Testung neuer therapeutischer Strategien für chronische Wunden.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Dieses diabetische Mausmodell schließt eine entscheidende Lücke in der präklinischen Wundheilungsforschung, indem es zentrale pathophysiologische Merkmale menschlicher diabetischer chronischer Wunden reproduziert, einschließlich der durch oxidativen Stress verursachten Biofilmbildung und verlängerter nicht-heilender Phänotypen. Es ermöglicht die mechanistische Absicherung therapeutischer Kandidaten, die auf Signalwege der Wundchronizität abzielen, und unterstützt die Vorhersagekraft bei der Zielvalidierung und Identifizierung führender Wirkstoffe. Die Relevanz des Modells für die jährliche Belastung in Höhe von 40 Milliarden US-Dollar in den USA unterstreicht seinen strategischen Wert für die Portfolio-Priorisierung in Dermatologie- und Regenerativen Medizin-Programmen.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Untersuchung oxidativen Stresses und der Hemmung antioxidativer Enzyme als mechanistische Treiber der Wundchronifizierung.
- Operativer Wert: Bietet ein reproduzierbares System, um Zielstrukturen, die an der Redoxregulation und Biofilmbildung beteiligt sind, zu validieren.
- Wissenschaftlicher Wert: Unterstützt die Hypothesenprüfung bezüglich Signalwegen, die Diabetes, gestörte Wundheilung und anhaltende Entzündungen verbinden.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt quantifizierbare Metriken zur Wundverschlussrate und zum Biofilmbefall als abhängige Variablen für die Wirkstoffscreening.
- Operativer Wert: Standardisiert die Wundinduktion mittels topischer Katalase- und Glutathionperoxidase-Inhibitoren und ermöglicht so die Bereitschaft des Assays.
- Wissenschaftlicher Wert: Liefert krankheitsrelevante Endpunkte, einschließlich persistierender offener Wunden, mikrobieller Belastung und histologischer Anzeichen von Chronizität.
Translationale und präklinische Forschung
- Wissenschaftlicher Wert: Spiegelt die mikrobiologischen Verhältnisse diabetischer Wunden beim Menschen wider, einschließlich Pseudomonas aeruginosa und Staphylococcus-Arten, wodurch die Vorhersagevalidität verbessert wird.
- Operativer Wert: Ermöglicht die longitudinale Überwachung vom akuten Wundstadium bis zur vollständigen Chronifizierung nach 20 Tagen und unterstützt damit die Beurteilung zeitabhängiger Wirksamkeit.
- Wissenschaftlicher Wert: Erleichtert die Entdeckung von Biomarkern im Zusammenhang mit oxidativem Stress, mikrobieller Kolonisation und Wirtsantwort in diabetischen Kontexten.
Pipeline- und Workflow-Integration
Das Modell fügt sich in die Entdeckungskette von der Target-Validierung bis zur Lead-Optimierung ein, insbesondere für Modalitäten, die darauf abzielen, oxidativen Stress, mikrobielle Persistenz oder Wirt-Pathogen-Interaktionen bei diabetischen Wunden zu modulieren.
- Entdeckungsbiologie: Überprüft therapeutische Hypothesen zur Redox-Balance und zur Störung von Biofilmen in einem mikrobiellen Wundmilieu bei Diabetes.
- Screening: Ermöglicht die Bewertung von Wirkstoffen, die die Dauerhaftigkeit von Wunden oder die Biofilmbildung unter diabetischen Bedingungen reduzieren.
- Analytik: Liefert quantitative Endpunkte wie die Wundfläche über die Zeit, die mikrobielle Belastung und Marker für oxidativen Stress, um Go/No-Go-Entscheidungen zu treffen.
- Translationale Forschung: Verbindet die Entdeckung mit der präklinischen Validierung, indem sie die zeitlichen Abläufe der chronischen Wundheilung beim Menschen sowie mikrobiologische Profile nachbildet.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Dient als wiederverwendbare Plattform für verschiedene Wirkstoffklassen, einschließlich Enzyminhibitoren, Antimikrobielle und Immunmodulatoren.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert die mechanistische Unklarheit bei Wundheilungswegen, indem er diabetesspezifische Faktoren für Chronizität modelliert.
- Operativer Wert: Stellt die Reproduzierbarkeit sicher durch standardisierte Verletzungserzeugung, Induktion oxidativen Stresses und Unterbringung unter konventionellen Vivarienbedingungen.
- Strategischer Wert: Verbessert die Kapitalnutzungseffizienz, indem mechanistisch unwahrscheinliche Kandidaten vor kostspieligen spätstufigen Studien ausgeschlossen werden.
- Portfolio-Wirkung: Ermöglicht eine risikoadjustierte Priorisierung von Wundheilungsprogrammen basierend auf Wirksamkeit in einem klinisch relevanten diabetischen Modell.
Durchführungsaspekte
- Kenntnisse im Umgang mit diabetischen Mäusen, in Wundlegungstechniken und der topischen Applikation von Wirkstoffen.
- Zugang zu steriler PBS-Lösung, Buprenorphin, ATZ, Katalase- und Glutathionperoxidase-Inhibitoren, MSA sowie transparenten Filmsverbänden.
- Standardisierung der Wundgröße, des Zeitpunkts der oxidativen Stressinduktion und der Biofilmbewertung über verschiedene Versuchspersonen hinweg.
- Überlegungen zur Anpassung an verschiedene Mausstämme oder diabetische Modelle jenseits des db/db-Modells.
- Einschränkungen umfassen die Abhängigkeit vom nicht-sterilen Hautmikrobiom und die Variabilität in der Kinetik der Biofilmbildung.
