Name: Protokoll zur Herstellung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2019-09-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 55 s
Description: Lernen Sie ein Protokoll zur Erzeugung chronischer Wunden bei diabetischen db/db-Mäusen durch oxidativen Stress und Biofilmbildung. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Wundchronizität.

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Die Autoren haben keine Bestätigungen.

Die Autoren erklären, dass sie keine konkurrierenden finanziellen Interessen haben.

Sobald chronische Wunden an den Mäusen entstehen, kann das Modell verwendet werden, um beeinträchtigte Wundheilungsprozesse zu untersuchen, die an der Initiierung der Chronik beteiligt sind. Das Modell kann auch verwendet werden, um die Wirksamkeit einer breiten Palette von Chemikalien und Medikamenten zu testen, die chronische Wundentwicklung und beeinträchtigungsende Heilung umkehren und zu Wundverschluss und Heilung führen können. Es können verschiedene Zeitpunkte nach Beginn der Chronik untersucht werden: z.B.</e...

Die Wundheilung umfasst komplexe zelluläre und molekulare Prozesse, die zeitlich und räumlich reguliert sind, in sequenziellen und überlappenden Stadien organisiert sind, die viele verschiedene Zelltypen umfassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Immunantwort und die Gefäße. System1. Unmittelbar nachdem die Haut eine Verletzung erlitten hat, aggregieren sich Faktoren und Blutzellen zur Wundstelle und initiieren die Gerinnungskaskade zu einem Gerinnsel. Nachdem die Homöostase erreicht ist, glaudern die Blutgefäße, um Sauerstoff, Nährstoffe, Enzyme, Antikörper und chemotaktische Faktoren, die Polymorphonukleozyten zur Räumung des Wundbettes von fremdem Schutt reinigen und proteolytische Enzyme absondern, in die Wundstelle zu lassen. 2. Aktivierte Blutplättchen sezernieren eine Vielzahl von Wachstumsfaktoren, um die Keratinozyten an der Wundkante zu stimulieren, um den verwundeten Bereich neu zu epithelisieren. Monozyten, die an der Wundstelle rekrutiert werden, differenzieren sich in Makrophagen, die Phagozytosebakterien und tote Neutrophile phagozytosieren und zusätzliche Faktoren absondern, um keratinozyte proliferative und pro-wandernde Signale aufrechtzuerhalten. In der Proliferationsphase, während die Reepithelisierung anhält, setzt neues Granulationsgewebe, bestehend aus Fibroblasten, Monozyten/Makrophagen, Lymphozyten und Endothelzellen, den Wiederaufbauprozess fort2. Die Angiogenese wird durch die Förderung der Endothelzellproliferation und -migration stimuliert, was zu einer neuen Gefäßentwicklung führt. Die Epithelisierung und Remodellierung der extrazellulären Matrix konstruieren eine Barriere gegen die Umwelt. Wenn sich die Wunde heilt und sich granulationsgewebe zu einer Narbe entwickelt, eliminiert Apoptose entzündliche Zellen, Fibroblasten und Endothelzellen, ohne zusätzliche Gewebeschäden zu verursachen. Die Zugfestigkeit des Gewebes wird durch Fibroblasten verstärkt, die verschiedene Komponenten der extrazellulären Matrix wie Kollagen umbauen, so dass das neu gebildete Gewebe fast so stark und flexibel ist wie die unverwundete Haut2.
Jede Abweichung von dieser stark abgestimmten Progression hin zum Wundverschluss führt zu beeinträchtigten und/oder chronischen Wunden3. Chronische Wunden sind gekennzeichnet durch erhöhten oxidativen Stress, chronische Entzündung, beschädigte Mikrovaskulatur und abnorme Kollagenmatrix in der Wunde4. Oxidativer Stress, insbesondere in derWunde, kann den Wundverschluss 2,5verzögern. Wenn in der ersten Phase der Wundheilung die Entzündliche Phase unreguliert wird, geht das Wirtsgewebe aufgrund eines kontinuierlichen Zustroms von Entzündlichen Zellen5, die zytotoxische Enzyme freisetzen, einer Zunahme freier Sauerstoffradikale und unregulierte Entzündungsmediatoren, die zum Zelltod6,7führen.
In dieser zerstörerischen Mikroumgebung nutzen biofilmbildende Bakterien wirtsnährstoffe und tragen zur Schädigung des Wirtsgewebesbei 2. Diese Biofilme sind schwer zu kontrollieren und zu entfernen, da die hydratisierten extrazellulären polymeren Substanzen, die aus Proteinen, DNA, RNA und Polysacchariden bestehen, es Bakterien, die im Inneren leben, ermöglichen, gegenüber konventionellen Antibiotikatherapien tolerant zu sein und sich der angeborene und adaptive Immunantwort des Wirts2,8,9.
Das Studium chronischer Wunden ist von entscheidender Bedeutung, da sie 6,5 Millionen Us-Dollar betreffen und allein in den USA 40 Milliarden DOLLAR pro Jahr kosten10. Patienten mit Diabetes haben ein erhöhtes Risiko für die Entwicklung chronischer Wunden, die einer Amputation bedürfen, um die Ausbreitung der Infektion einzudämmen. Diese Patienten haben ein Sterblichkeitsrisiko von 50 % innerhalb von 5 Jahren nach der Amputation, das dem Pathophysiologiemechanismus von Diabetes11zugeschrieben wird. Die Beziehung zwischen dem Immunsystem des Wirts und dem Mikrobiom in der Wundheilung ist ein wichtiges Thema der laufenden Forschung, da die Folgen chronischer Wunden, wenn ungelöst, Amputation und Tod12umfassen.
Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, ist es immer noch unklar, wie und warum sich chronische Wunden bilden. Experimente zur Untersuchung der Mechanismen der beeinträchtigungen Heilung sind beim Menschen schwierig durchzuführen, und Wundheilungsspezialisten sehen nur Patienten mit chronischen Wunden, die bereits seit Wochen bis Monaten die Chronik erreicht haben. So sind Spezialisten nicht in der Lage zu untersuchen, welche Prozesse schief gelaufen sind, die die Wunde zu entwickeln, um chronisch zu werden2. Es fehlt an Tiermodellen, die die Komplexität menschlicher chronischer Wunden rekapitulieren. Bis zur Entwicklung unseres Modells gab es kein Modell für chronische Wundstudien.
Das chronische Wundmodell wurde bei Mäusen entwickelt, die eine Mutation im Leptinrezeptor haben (db/db-/-) 13. Diese Mäuse sind fettleibig, diabetisch, und haben beeinträchtigte Heilung, aber entwickeln keine chronischen Wunden14. Der Blutzuckerspiegel liegt im Durchschnitt bei 200 mg/dL, kann aber bis zu 400 mg/dL15betragen. Wenn ein hoher oxidativer Stress (OS) im Wundgewebe unmittelbar nach der Wundverwundung induziert wird, wird die Wunde chronisch16. Die db/db-/- Wunden gelten von 20 Tagen als chronisch und bleiben 60 Tage oder mehr geöffnet. Biofilm, der von Bakterien produziert wird, entwickelt sich ab drei Tagen nach der Verwundung; ein ausgereifter Biofilm ist 20 Tage nach der Verwundung zu sehen und besteht bis zum Wundenverschluss. Die biofilmbildenden Bakterien, die wir in diesen Mäusen finden, finden sich auch in menschlichen diabetischen chronischen Wunden.
Oxidativer Stress wird induziert, indem die Wunden mit zwei Inhibitoren antioxidativer Enzyme, Kataalase und Glutathionperoxidase, zwei Enzymen mit der Fähigkeit, Wasserstoffperoxid abzubauen, behandelt werden. Wasserstoffperoxid ist eine reaktive Sauerstoffspezies und kann durch die Oxidation von Proteinen, Lipiden und DNA zelluläre Schäden verursachen. Kataase katalysiert die Zersetzung von Wasserstoffperoxid in weniger schädliche Chemikalien Sauerstoff und Wasser. 3-Amino-1,2,4-Triazol (ATZ) hemmt die Kataalase durch spezifische und kovalente Bindung an das aktive Zentrum des Enzyms und inaktiviert es17,18,19. ATZ wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress sowohl in vitro als auch in vivo durch die Hemmung der Kataalase20,21,22,23,24zu untersuchen. Glutathionperoxidase katalysiert die Reduktion von Wasserstoffperoxid durch das Antioxidans Glutathion und ist ein wichtiges Enzym, das die Zelle vor oxidativem Stress schützt25. Mercaptosuccinsäure (MSA) hemmt Glutathionperoxidase durch Bindung an die Selenocystein-aktive Stelle des Enzyms mit Thiol, inaktiviert es26. MSA wurde verwendet, um die Auswirkungen von oxidativem Stress in vitro und in vivo sowie20,27,28zu untersuchen.
Dieses neuartige Modell chronischer Wunden ist ein mächtiges Modell zu studieren, weil es viele der gleichen Merkmale in menschlichen diabetischen chronischen Wunden beobachtet teilt, einschließlich längerer Entzündung entzeln von erhöhten OS und natürliche Biofilmbildung aus Hautmikrobiom. Die Wunden haben eine beeinträchtigte dermal-epidermale Wechselwirkung, abnormale Matrixablagerung, schlechte Angiogenese und beschädigte Vaskulatur. Chronische Wunden entwickeln sich sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Mäusen, so dass beide Geschlechter verwendet werden können, um chronische Wunden zu untersuchen. Daher kann das chronische Wundmodell wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis dessen, wie solche Wunden beginnen, zu fördern. Mit diesem chronischen Wundmodell können Antworten auf grundlegende Fragen darüber gegeben werden, wie Die Chronik durch Beiträge aus der Physiologie der beeinträchtigten Wundheilung und dem Mikrobiom des Wirts initiiert/erreicht wird.

<table><tbody><tr><td>B6. BKS(D)-Leprdb/J&nbsp;</td><td>Das Jackson Laboratory&nbsp;</td><td>00697</td><td>Homozygote und Heterozygote verfügbar&nbsp;</td></tr><tr><td>Nair Haarentferner-Lotion mit beruhigender Aloe und Lanolin</td><td>Nair</td><td></td><td>ein chemisches Enthaarungsmittel</td></tr><tr><td>Buprenex (Buprenorphin HCl)</td><td>Henry Stein Animal Health</td><td>059122</td><td>0,3 mg/ml, Klasse 3</td></tr><tr><td>3-Amino-1,2,4-triazol (ATZ)</td><td>TCI</td><td>A0432</td><td></td></tr><tr><td>Mercaptosbernsteinsäure (MSA)</td><td>Aldrich</td><td>88460</td><td></td></tr><tr><td>Phosphatpufferlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td>Autoklav, sterilisiert</td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Henry Schein Animal Health 029405</td><td></td><td>NDC 11695-6776-2</td></tr><tr><td>Sauerstofftank</td><td></td><td></td><td>muss mit dem Verdampfungssystem kompatibel sein</td></tr><tr><td>Isofluran-Verdampfer</td><td>JA Baulch & Gesellschafter&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wahl Haarschneider</td><td>Wahl</td><td></td><td>Lithium Ion Pro</td></tr><tr><td>Acu Punch 7mm Hautbiopsie Stanzen</td><td>Acuderm Inc.</td><td>P750</td><td></td></tr><tr><td>Tegaderm&nbsp;</td><td>3M</td><td>Ref: 1624W</td><td>Transparenter Filmverband (6 cm x 7 cm)</td></tr><tr><td>Heizkissen</td><td>Conair</td><td></td><td>Moist Dry Heizkissen</td></tr><tr><td>Insulinspritzen</td><td>BD</td><td>329461</td><td>0,35 mm (28G) x 12,7 mm (1/2")70</td></tr>% <tr><td>Ethanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pinzette</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scharfe chirurgische Schere</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dünner Metallspatel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Schlauch</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Maus Nasenkonus</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Handschuhe</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>kleine Kunststoffbehälter</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

protokoll zur herstellung chronischer wunden bei diabetischen mäusen

Protocol to Create Chronic Wounds in Diabetic Mice

Chronische Wunden entwickeln sich als Folge einer fehlerhaften Regulation in einem oder mehreren komplexen zellulären und molekularen Prozessen, die an der richtigen Heilung beteiligt sind. Sie wirken sich auf 6,5 Millionen US-Dollar aus und kosten allein in den USA 40 Milliarden US-Dollar pro Jahr. Obwohl erhebliche Anstrengungen unternommen wurden, um zu verstehen, wie sich chronische Wunden beim Menschen entwickeln, bleiben grundlegende Fragen unbeantwortet. Kürzlich haben wir ein neuartiges Mausmodell für diabetische chronische Wunden entwickelt, die viele Merkmale menschlicher chronischer Wunden aufweisen. Mit db/db-/- Mäusen können wir chronische Wunden erzeugen, indem wir unmittelbar nach der Wundwunde hohe Konzentrationen von oxidativem Stress (OS) im Wundgewebe induzieren, wobei eine einmalige Behandlung mit Inhibitoren speziell für die antioxidativen Enzyme Catalase und Glutathionperoxidase. Diese Wunden haben ein hohes OS-Niveau, entwickeln Biofilm natürlich, werden innerhalb von 20 Tagen nach der Behandlung vollständig chronisch und können mehr als 60 Tage offen bleiben. Dieses neuartige Modell hat viele Merkmale diabetischer chronischer Wunden beim Menschen und kann daher wesentlich dazu beitragen, das grundlegende Verständnis davon zu fördern, wie Wunden chronisch werden. Dies ist ein großer Durchbruch, weil chronische Wunden beim Menschen erhebliche Schmerzen und Leiden für Patienten verursachen und zu einer Amputation führen, wenn sie ungelöst sind. Darüber hinaus sind diese Wunden sehr teuer und zeitaufwändig zu behandeln und führen zu erheblichen Einkommensverlusten für die Patienten. Fortschritte in diesem Studienbereich durch die Verwendung unseres chronischen Wundmodells können die Gesundheitsversorgung von Millionen von Menschen, die unter diesem schwächenden Zustand leiden, erheblich verbessern. In diesem Protokoll beschreiben wir ausführlich das Verfahren, um akute Wunden chronisch zu werden, was bisher nicht geschehen ist.

Abbildung 5 zeigt ein Beispiel für eine Wunde ohne Behandlung von Inhibitoren, die sich in Richtung Wundverschluss bewegen, und eine Wunde mit der Behandlung von Inhibitoren, die in Richtung Chronik voranschreiten. Der transparente Verband wurde auf der chronischen Wunde belassen, so dass Biofilm und Flüssigkeitsansammlung sichtbar sind.
Chronische Wundinitiation findet in weniger als 6 Stunden stat...

Chronische Wunden werden aus akuten Wunden auf einem diabetischen Mausmodell entwickelt, indem sie nach einer schweren Kutanwunde einen hohen Grad an oxidativem Stress induzieren. Die Wunde wird mit Inhibitoren für Katathase und Glutathionperoxidase behandelt, was zu einer beeinträchtigungen Heilung und Biofilmentwicklung durch Bakterien im Hautmikrobiom führt.

Protokoll zur Herstellung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen

Chronic wounds develop as a result of defective regulation in one or more complex cellular and molecular processes involved in proper healing. They impact ...

Dieses Mausmodell kann helfen, Fragen im medizinischen Bereich der Wundchronik zu beantworten. Der große Vorteil dieses Modells ist, dass die chronischen Wunden bei Mäusen viele Aspekte der chronischen Wunden beim Menschen imitieren. Um zu beginnen, legen Sie die Maus auf eine saubere Oberfläche und halten Sie sie an Ort und Stelle, indem Sie die Basis ihres Schwanzes kneifen.Dann bereiten Sie die Haarschneider vor und sind bereit, sie schnell wegzuziehen, wenn die Maus plötzliche Bewegungen macht. Rasieren Sie den ganzen Rücken vom Hals bis zum Schwanz einschließlich rund um den Schwanz. Führen Sie die Klinge leicht gegen die Richtung des Haarwachstums für den effizientesten Schnitt.Drücken Sie die Clippers nicht tief in die Haut, da dies prellungen oder schneiden kann. Als nächstes bereiten Sie die Haut für eine Anwendung der Enthaarungslotion. Befeuchten Sie die Haut mit einem wassergetränkten Papiertuch, um chemische Verbrennungen zu verhindern.Drücken Sie leicht mit genügend Druck, um die geschnittenen Haare auf die Haut zu befeuchten. Dann, während die Haut nass ist, reiben Sie eine kleine Puppe op der Enthaarungslotion in den rasierten Bereich für 15 bis 20 Sekunden. Nach de

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Research

Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Wir haben eine minimal-invasive Technik, ein Kaninchen ischämischen Wunde Ohr-Modell, indem die zentrale Arterie und Nerven und der Schädelbasis Gefäßnervenbündels erstellen entwickelt. Einen subkutanen Tunnel dann schneidet alle subkutanen Gewebe. Dieses Verfahren verursacht minimale Störung der Haut und kann sicher in diabetischen Tieren verwendet werden.

Eine vereinfachte Methode zur Herstellung eines ischämischen Wundmodell

Ein Mausmodell von kutanen Wundheilung, die zur therapeutischen Verbindungen in physiologischen und pathophysiologischen Einstellungen beurteilen kann.

Mausmodell der Wundheilung

Fettgewebe Stammzellen (ASC) leicht zu isolieren und aus dem Fett von normalen Ratten geerntet. ASC Blätter können mit Handy-Blatt Engineering erstellt werden und können in Zucker Diabetiker fetthaltige Ratten ausstellenden voll-dicke Haut Mängel mit freiliegenden Knochen und dann bedeckt mit einem Bilayer künstlicher Haut transplantiert werden.

Schaffung und Transplantation von einem Fettgewebe-derived Stem Cell (ASC) Blatt in einem diabetischen Wundheilung Modell

Hier beschreiben wir eine neuartige diabetische Mausmodell nutzt haarlose Mäusen für Echtzeit-, nicht-invasive Überwachung der Biofilm Wundinfektionen der Biolumineszenz Pseudomonas Aeruginosa. Diese Methode lässt sich die Infektion anderer Bakterienarten und genetisch veränderten Mikroorganismen, einschließlich Multi-Spezies Biofilme und testen die Wirksamkeit von Antibiofilm Strategien anpassen.

Besuchen Sie die Licht-Seite: In Vivo Monitoring von Pseudomonas Aeruginosa Biofilms Infektionen bei chronischen Wunden in einer diabetischen haarlose Mausmodell

Das präparierte DOX-CL-Gerüst erfüllte die Voraussetzungen für einen idealen DW-Verband in mechanischer Festigkeit, Porosität, Wasseraufnahme, Abbaurate, Verzögertfreisetzung, antibakterieller, Biokompatibilität und entzündungshemmender Eigenschaften, die als wesentlich für die Wiederherstellung von geschädigtem Gewebe in DWs angesehen werden.

Doxycyclin-belastetes Kollagen-Chitosan-Verbundgerüst zur beschleunigten Heilung diabetischer Wunden

Das Streptozotocin-induzierte diabetische Wundmodell bei männlichen SD-Ratten ist derzeit das am weitesten verbreitete Modell zur Untersuchung der Wundheilung bei Diabetes mellitus Typ I. Dieses Protokoll beschreibt die Methoden, die zum Erstellen dieses Modells verwendet werden. Darüber hinaus werden mögliche Herausforderungen vorgestellt und adressiert, und es werden die Progression und die angiogenen Eigenschaften diabetischer Wunden untersucht.

Ein Protokoll zur Erstellung eines Rattenwundmodells für Typ-1-Diabetes

Es wird ein optimiertes Protokoll für die Etablierung eines Brandwundenheilungsmodells bei Mäusen mit einem digitalen Heizgerät vorgestellt. Die auf der Haut angelegten schachbrettartigen Experimentierstellen ermöglichen die weitere Funktionsanalyse für den Wundheilungstest.

Schachbrettartiges Brandwundenheilungsmodell von Mäusen basierend auf digitalem Heizgerät

Wunden stellen eine globale gesundheitliche Herausforderung dar. In dieser Studie wurde eine standardisierte Fotokabine mit digitaler Planimetrie entwickelt, um die Variabilität der Wundmessung zu minimieren. Die Überwachung der Wunden bei Mäusen über einen Zeitraum von 14 Tagen zeigte eine anfängliche Zunahme der Wundfläche und des Wundumfangs, gefolgt von einem allmählichen Verschluss. Diese Methodik kann bei der Bewertung der Wundverschlusskinetik in präklinischen Modellen hilfreich sein.

Digitale Planimetrie zur Beurteilung der Wundverschlusskinetik in einem Mausmodell

Dieser Beitrag beschreibt ein Protokoll für die Ganzkörper-Hyperthermie bei Mäusen, die Fieber ähnlichen Bedingungen zu stimulieren bis zu 12-24 Stunden kann.

Protokoll für Long Duration Ganzkörper-Hyperthermie in Mäuse

Wir beschreiben hepatische neo-Inselzellen Formation in STZ (Streptozotocin)-induzierte diabetische Mäuse durch Gentransfer von Neurogenin3 (Ngn3) und Betacellulin (BTC) Verwendung von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektor (HDAd) und der Umkehrung von Hyperglykämie. Unsere Methode nutzt die Vorteile von Helfer-abhängigen Adenovirus-Vektoren mit ihren hocheffizienten in vivo Transduktion und der lang anhaltende Genexpression.

Neo-Islet Formation in Leber der diabetischen Mäuse von Helper-abhängigen Adenovirus-Vektor-vermittelten Gentransfer

Lernen Sie ein Protokoll zur Erzeugung chronischer Wunden bei diabetischen db/db-Mäusen durch oxidativen Stress und Biofilmbildung. Dieses Modell ermöglicht die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Wundchronizität.

Protokoll zur Herstellung chronischer Wunden bei diabetischen Mäusen

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