Name: Markierungsfreie Neutrophilenzahl Anreicherung von Patienten abgeleitet Airway-Sekretion mit Closed-Loop Inertial Mikrofluidik (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Erfahren Sie die markierungsfreie Anreicherung von Neutrophilen aus Patienten-Luftwegsekreten mittels geschlossener Kreislauf-Inertialmikrofluidik. Diese Methode ermöglicht die Isolierung funktionaler Zellen ohne chemische Störung für Atemwegserkrankungen.

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Diese Arbeit wurde von NIH/NIAID (R21AI119042) sowie NIH U24 Probe Sparing-Assay-Programm (U24-AI118656) unterstützt.

Die Musterkollektion wurde von der University of Pittsburgh Institutional Review Board (IRB # PRO16060443, PRO10110387) genehmigt. Alle Experimente werden unter einen Schrank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung Biosafety durchgeführt.
1. Gerät Fertigung und weiche Lithographie
Hinweis: Standard weichen Lithographie Techniken15,16 dienten der Microchannel Polydimethylsiloxan (PDMS) zu erstellen.
<ol><li>Mischen Sie den PDMS-Vorläufer im Verhältnis 10:1 von base und Aushärtung Agent.</li>
	<li>30 g der PDMS Vorläufer Mischung auf der Mikro-gefräst aus Aluminium Form Gießen (siehe Abbildung 1 für Dimensionen) und 20 g der PDMS Vorläufer Mischung auf 100 mm Petrischale. Hinweis: Die Petrischale wird verwendet, um den dicken Film von PDMS (~ 3 mm) für die Tragschicht zu machen. Die tragende Schicht des PDMS bietet einheitliche physikalische Oberflächeneigenschaften während der Mikrofluidik. Alternativ kann eine Dünnschicht des PDMS auf der Glas-Folie verwendet werden. Der master-Form mit bestimmten Kanal Abmessungen wurde entworfen und hergestellt durch Mikrofräsen auf der Alu-Blech. In dieser Studie verwendete Spirale-Kanal war ein 8-Schleife Spirale mikrokanal mit einem ein- und zwei Ausgänge mit dem Radius von 8 mm bis 24 mm für effiziente Größe-basierte Trennung erhöhen.</li>
	<li>Legen Sie die Form und die Petrischale in einem Vakuum Exsikkator zu entgasen, bis keine Luftblasen an der Oberfläche, in der Regel ca. 5-10 min. Einsatz ein Haus-Vakuum für die Exsikkator sichtbar sind.</li>
	<li>Lassen Sie das Vakuum und legen Sie die Form und die Petrischale in einem 90 ° C Ofen für 1 h. Hinweis: Eine Herdplatte oder andere Heizung Werkzeuge können anstelle von einem Ofen verwendet werden.</li>
	<li>Die Form und die Petrischale aus dem Ofen nehmen und bei Raumtemperatur für 10 min. abkühlen lassen.</li>
	<li>Vorsichtig die Umrisse schneiden Sie aus und Lochen Sie der flüssigen Zugriff auf das Gerät mit einem 2 mm-Puncher. Hinweis: Die Größe des Stempels kann variieren je nach Größe des Handbuchs Rohre oder Flüssigkeit.</li>
	<li>Befestigen Sie ein Klebeband auf die Kanal-Seite des Gerätes und Dickschicht PDMS und schälen Sie sorgfältig mit der Pinzette um Staub zu entfernen.</li>
	<li>Sowohl die Kanal-Seite des Gerätes und schlichte PDMS mit Luft-Plasma und Verbundenheit mit der vorbereiteten Tragschicht schlicht PDMS (Abbildung 1A) zu behandeln.</li>
	<li>Platzieren Sie den Chip auf der 50 x 70 mm-Glas-Folie und legen Sie sie in einem Ofen 70 ° C für mindestens 30 min um die Haftfestigkeit zu verbessern.</li>
</ol>(2) trachealen Sekretion Sammlung von mechanisch beatmeten Patienten
Hinweis: Trachealen Sekrete aus mechanisch beatmeten Patienten während der normalen Routine Atemwege Betreuung erhalten Sie über ein Protokoll von den herkömmlichen Methoden geändert, der standard, Erwachsene belüfteten Patient unterzubringen. Proben wurden de-identifiziert und sofort zur Verarbeitung gesendet.
<ol><li>Wenn trachealen streben angegeben ist, verwenden Sie einen Katheter Atemwege Sekrete zu extrahieren.</li>
	<li>Den Katheter vorsichtig halb in den Endotrachealtubus vorantreiben und 5 mL 0,9 % sterile normale Kochsalzlösung aus einer vorgefüllten 10 mL Spritze zu vermitteln.</li>
	<li>Wenn der Katheter ist voll ausgereift, oder Widerstand traf, die Sekrete abzusaugen und in einem sterilen Auswurf Sammelbehälter sammeln.</li>
	<li>Sammle 10 mL trachealen Sekrete in einem sterilen Sputum Container und auf Eis legen. Senden Sie die Proben sofort zur Bearbeitung.</li>
</ol>(3) trachealen Sekretion Probenvorbereitung
Hinweis: Alle Experimente müssen unter einen Schrank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung Biosafety durchgeführt werden.
<ol><li>1 mL der Atemwege Sekretion Proben in 9 mL Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) mit einer Kunststoff 10 mL Spritze (für ein 10 X Verdünnung) zu verteilen. Verwenden Sie eine stumpfe Pipette, um die Schleim-Probe zu homogenisieren.</li>
	<li>Belasten Sie das Verdünnungsmittel mit einem 40 µm Nylon Zelle Sieb entfernen große Stücke oder Blutgerinnsel, die die Mikrofluidik Zugangsöffnung oder den Kanal blockieren können. Legen Sie die Probe auf dem Eis nach der Verarbeitung.</li>
	<li>Das Verdünnungsmittel jeder Probe mit einem 100 X Volumen von PBS-Puffer, wodurch eine 1.000 x verdünnten Suspension zu zerstreuen. Legen Sie die Probe auf dem Eis während der gesamten Dissoziation-Operation.</li>
</ol>(4) Versuchsaufbau
Hinweis: Alle Experimente müssen unter einen Schrank mit der richtigen persönlichen Schutzausrüstung Biosafety durchgeführt werden.
<ol><li>Montieren des PDMS-Chips mit dem Fluid Guide, gleichförmige Strömung zu jedem der vier Spirale Mikrokanäle (Abbildung 1 b) anzuwenden. Hinweis: Vier Kanäle wurden verwendet, um den Durchsatz zu erhöhen durch Parallelisierung sowie Optimierung der Lautstärke und Zelle Dichte die entstandene Suspension. Der flüssige Guide ist entworfen und hergestellt mit einem Stereolithographie Art 3D-Drucker mit klaren Harz. Einlass und Auslass des flüssigen Guide verwenden Luer-Anschluss-Buchsen für einfache Verbindung und stabile Abdichtung während der Operation.</li>
	<li>Verbinden Sie einen Luer-Anschluss-Stecker 1/16-Zoll mit Einlauf, der inneren Steckdose (IW) und der Außenwand (OW) Auslassöffnung des flüssigen Guide und verbinden ein Silikonschlauch zur Probe Aussetzung.</li>
	<li>Legen Sie die stumpfe Spitzen an beiden Enden der zu- und Abgänge zu den unteren Rand der Probe-Stausee erreichen.</li>
	<li>Die Peristaltische Pumpe mit dem Zulauf-Schlauch anschließen.</li>
	<li>Stecken Sie das Ende der Zulauf Schlauch und IW-Auslass-Schlauch in der Probe-Stausee und das Ende des Schlauches OW Outlet in den Abfall Behälter (Abbildung 1, D).</li>
	<li>Ort der 50 mL-Tube von gefilterten PBS ohne Kalzium und Magnesium auf die Probe-Stausee.</li>
	<li>Pumpen mit einer low-Flow-Rate (~ 1 mL/min) an das Gerät zu starten. Hinweis: Wenn Luftblasen im Kanal erfasst werden, drücken Sie die Spitze des Kanals mit der Pinzette zu destabilisieren und Luftblasen zu beseitigen. Wenn das Gerät vollständig mit Pufferlösung gefüllt ist, ändern Sie die PBS-Röhre um die Atemwege Sekretion Probenröhrchen vorzubereiten.</li>
	<li>Wenn die Probe in der Probe-Stausee befindet, Peristaltische Pumpe einschalten und Einstellen der Durchflussmenge bei 4 mL/min (Abbildung 1, D).</li>
	<li>Wenn das Probenvolumen benannten Volumen (~ 1 mL) erreicht, beenden Sie den Betrieb und trennen Sie den Silikonschlauch. Hinweis: Die vorgeschlagene Methode ist effizienter zu verringern eine große Menge an Verdünnungsmittel (> 50 mL) in ein Mikro-Zentrifugenröhrchen Volumen (~ 1 mL) (Abbildung 2).</li>
</ol>(5) Flow Cytometry Analysis
Hinweis: Um die Dissoziation Methoden (Mikrofluidik und Lyse) zu vergleichen, wurde Durchflusszytometrie mit Immunfluoreszenz verwendet.
<ol><li>Fügen Sie Fluorescein erfolgt (FITC) - konjugierten Maus Anti-Human CD66b monoklonaler Antikörper und Allophycocyanin (APC) - Maus Anti-Human CD45 monoklonaler Antikörper, die ersten Aussetzungen (Schritt 3.3) und daraus resultierende Suspensionen (Schritt 4,9) (200 µL konjugiert jeder Antikörper) im Verhältnis von 01:25 V/V.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben bei 4 ° C im Dunkeln für 30 min.</li>
	<li>Analysieren Sie beide Proben auf einem Durchflusszytometer, die PMNs zu quantifizieren. Hinweis: Die Bevölkerung, die doppelt positiven FITC-APC, CD66b positiv und CD45 positiven galt als neutrophile. Erholung wurde durch das Verhältnis der Ergebniszelle Zahlen die Eingabe und die entstandene Suspension berechnet.</li>
</ol>6. NE Release Analyse
Hinweis: Um die Funktionalität des isolierten zu vergleichen war Neutrophilenzahl von der Mikrofluidik und Lyse-Methode eine NE-Assay-Kit verwendet.
<ol><li>PMA (zur Verfügung gestellt, in dem Assay Kit) hinzufügen jedes entstandene Suspension (erhältlich bei Schritt 4,9), eine Endkonzentration von 50 nM.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C für 2 h.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Suspensionen bei 300 X g für 10 min.</li>
	<li>Übertragen Sie 10 µL jeder überstand auf eine 96-Well-Platte (zur Verfügung gestellt, in dem Assay Kit). Hinweis: Eine 96-Well-Mikrotestplatte mit einem flachen Boden und schwarzem Polystyrol kann auch verwendet werden.</li>
	<li>Jedes gut fügen Sie 90 µL verdünnter testpuffer (zur Verfügung gestellt, in dem Assay Kit hinzu).</li>
	<li>Fügen Sie 10 µL des Substrats Elastase (Z-Ala-Ala-Ala-Ala 2Rh110, im Assay Kit enthalten).</li>
	<li>1,5 h bei 37 ° c inkubieren</li>
	<li>Lesen Sie die 96-Well-Platte mit einem Fluorometer bei einer Erregung Wellenlänge von 485 nm und einer Emissionswellenlänge von 525 nm. Hinweis: Die Höhe der NE teilte der PMN-Graf von Flow-zytometrie-Analyse.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben die hier beschriebene Technik patent angemeldet.

Inertial Mikrofluidik lokalisieren Partikel- und Zellen an einer bestimmten seitlichen Position in einem Mikro-Kanal anhand ihrer Größe5,18,19,20. Durch die kombinierte Wirkung des Dekans zu ziehen, Kraft und die trägen Auftriebskraft im gekrümmten Microchannel, große Partikel oder Neutrophilen (> 10 µm) befinden sich in den Kanal und kleine Partikel Schleim Aggregate und Trümmer kleiner als 6 ...

Da Zellen in einer großen Menge von Schleim in den Atemwegen Sekrete gekapselt sind, hat die funktionelle Beurteilung der Leukozyten durch eine in-vitro- Assay behindert. Dithiothreitol (DTT) ist der häufigste Lyse-Puffer zu distanzieren und homogenisieren Sputum für zytologische Analyse und Erkennung von Mediatoren und bietet gleichzeitig erträglich Lebensfähigkeit der isolierten Zellen1,2. Jedoch kann DVB-t stören Oberfläche-gebundene Antigene der Atemwege Neutrophilen, wodurch die Störung der Neutrophilen Funktion wie z. B. die Elastase und Myeloperoxidase (MPO)2,3. Daher wurden nur wenige Studien der menschlichen Atemwege Neutrophilenzahl Funktion mit peripherem Blut neutrophile durchgeführt, die nicht die physiologischen Eigenschaften der pulmonalen4verraten kann. Unterdessen hat sich träge Mikrofluidik Fortschritte bei der Isolierung von Zellen aus verschiedenen Patienten Biomatrices5,6. Das Gleichgewicht zwischen inertial Aufzug Kräfte und Dean ziehen richtet die Partikel/Zelle gemäß ihrer Größe die markierungsfreie Partikel Trennung7ermöglicht. Unsere Gruppe zuvor führte eine Probe Zubereitungsart für zirkulierenden Tumor Zellen8,9, Krankheitserreger im Blut8, Zellen aus einer Suspension Kultur10,11, 12, und Polymorphkernige Leukozyten (PMNs) von Blut13,14.
Hier stellen wir ein Protokoll um Immunzellen des Patienten Airway Sekrete mit geschlossenen inertial Mikrofluidik für einen nachgeschalteten in-Vitro -Assay, wie der Neutrophilen Elastase (NE)-Test vorzubereiten. Diese Methode bietet hohe Konzentration und Erholung, vor allem wenn es eine deutliche Überschneidung in seitlicher Richtung der Zelle/Teilchen aus dem die Zelle/Partikel des Interesses ist zu entfernen, die häufig in klinischen Proben beobachtet wird. Durch Rezirkulation der inneren Mauer (IW)-große Partikel oder Zellen zurück zu der Eingabe Probenröhrchen, die Partikel oder Zelle-of-Interest-Konzentrate im ursprünglichen Behälter konzentrieren, während Hintergrund Flüssigkeiten mit kleinen Mucin Aggregate durch den Abfall Behälter übergeben. Trotz der heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften von klinischen Proben, erholt sich die vorgeschlagene Methode konsequent über 95 % der Neutrophilen aus Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit einer sauberen Kochsalzlösung (~ 1 mL). Im Gegensatz dazu stellt die Lyse-Methode eine breite Palette von PMNs Verwertungsquoten je nach dem Zustand der Probe. Das vorgeschlagene Protokoll erfasst Leukozyten in gewissem markierungsfreie ohne physikalische oder chemische Unterbrechung, bietet die Möglichkeit, empfindliche Zellen aus klinisch gegen Biometrie mit minimal-invasiven Eingriffen zu ernten.

<table><tbody><tr><td>PDMS-Vorläufer</td><td>Dow corning</td><td>184 SIL ELAST KIT 3,9 kg</td><td>10:1 Verhältnis von Basis und Härter</td></tr><tr><td>VWR Schwerkraftkonvektionsofen</td><td>VWR</td><td>414005-128</td><td>PDMS-Vorläufer zum Aushärten in 90 Grad.</td></tr><tr><td>100 mm Petrischale</td><td>VWR</td><td>89000-324</td><td>Herstellung von PDMS Stützschicht</td></tr><tr><td>Harris Uni-Core Puncher</td><td>Sigma-aldrich</td><td>WHAWB100076</td><td>2 mm Durchmesser oder andere, abhängig von der Schlauchgröße</td></tr><tr><td>Luftplasmamaschine</td><td>Femto Science</td><td>Niedliche</td><td>Oberflächenplasmabehandlung für PDMS-Gerät bis zur unteren Basis.</td></tr><tr><td>2" x 3" Glasrutsche</td><td>TED PELLA, INC.</td><td>2195</td><td>Zur Unterstützung des PDMS-Geräts</td></tr><tr><td>Masterflex gewickelter platingehärteter Silikonschlauch, L/S 14</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-96410-14</td><td>Schlauch für Mikrofluidik und Peristlationspumpe</td></tr><tr><td>1/16 Zoll Luer-Anschluss, männliches</td><td>Harvard-Gerät</td><td>PC2 72-1443</td><td>Anschluss für Flüssigkeitsführung</td></tr><tr><td>50 ml Falcon-Schlauch</td><td>Corning</td><td>21008-940</td><td>Probenentnahme und -vorbereitung</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung, 1X ohne Calcium und Magnesium</td><td>Corning</td><td>45000-446&nbsp;</td><td>Pufferlösung zur Verdünnung der Probe</td></tr><tr><td>Fall Geschlossener Absaugkatheter, Ellbogen, 14F/ Kanal 4,67 mm</td><td>HALYARD HEALTH</td><td>22113</td><td>Trachealsektions-Saugkatheter</td></tr><tr><td>0,9 % steril Normale Kochsalzlösung, 10 ml Fertigspritze</td><td>BD PosiFlush</td><td>NHRIC: 8290-306547</td><td>Für die Entnahme von Trachealsekretion bei Patienten</td></tr><tr><td>SecurTainer&trade; III Probenbehälter, 20 mL</td><td>Simport</td><td>1176R36</td><td>Steriler Sammelbehälter für Sputum (Atemwegssekret)</td></tr><tr><td>Spritze mit Luer-Lok-Spitze, 10 mL</td><td>BD</td><td>BD309604</td><td>Zum Pipettieren homogenisieren Sie die Schleimprobe und erreichen Sie den Boden des Probenröhrchens</td></tr><tr><td>BD&nbsp; Blunt Fill Nadel, mit BD Luer-Lok&nbsp; Tipp</td><td>BD</td><td></td><td>Zum Pipettieren homogenisieren Sie die Schleimprobe und erreichen Sie den Boden des Probenröhrchens</td></tr><tr><td>40&micro; M Nylon-Zellsieb&nbsp;</td><td>Falcon</td><td>21008-949</td><td>Zur Entfernung von großen Brocken oder Blutgerinnseln, die das Zugangsloch zur Mikrofluidik oder den Kanal blockieren können.</td></tr><tr><td>Peristaltische Pumpe (Masterflex L/S Digital Drive)</td><td>Cole-Parmer</td><td>HV-07522-30</td><td>Betrieb von Mikrofluidik</td></tr><tr><td>BD LSR II Durchflusszytometer</td><td>BD Bioscience</td><td>LSR II Durchflusszytometer</td><td>Quantifizierung des Zellrückgewinnungsverhältnisses</td></tr><tr><td>Fluorescein-Isothiocyanat (FITC)-konjugierter Maus-Anti-Human-CD66b-Monoklonaler Antikörper</td><td>BD Bioscience</td><td>561927</td><td>Immunfärbung von Neutrophilen für die Durchflusszytometer-Analyse</td></tr><tr><td>Monoklonaler Anti-Human-CD45-Antikörper mit Allophycocyanin (APC)-konjugiertem Maus-Antikörper</td><td>BD Bioscience</td><td>561864</td><td>Immunfärbung von Neutrophilen für die Durchflusszytometer-Analyse</td></tr><tr><td>Platten-Reader</td><td>Thermo Fisher wissenschaftlicher</td><td>Varioskan-Platten-Reader</td><td>für Neutrophilen-Elastase-Assay, ex485/em525</td></tr><tr><td>Neutrophilen-Elastase-Assay-Kit</td><td>Cayman Chemical</td><td>600610</td><td>Bewertung der Neutrophilenfunktionalität</td></tr><tr><td>Fluoresbrite YG Mikrosphären 10.0&micro; m</td><td>PolyScience, Inc.</td><td>18140-2</td><td>Fluoreszierende Partikel zur Darstellung der Flugbahn weißer Blutkörperchen in der Mikrofluidik</td></tr></tbody></table>

markierungsfreie neutrophilenzahl anreicherung von patienten abgeleitet airway-sekretion mit closed-loop inertial mikrofluidik

Label-free Neutrophil Enrichment from Patient-derived Airway Secretion Using Closed-loop Inertial Microfluidics

Atemwege Sekrete enthalten eine große Anzahl von immunvermittelte Zellen, z. B.Neutrophile, Makrophagen und Lymphozyten, die als eine wichtige Ressource verwendet werden können, um eine Vielzahl von Lungenerkrankungen, sowohl für Forschung und klinische Zwecke zu bewerten. Aufgrund der heterogenen und Viskose von Patienten Schleim ist jedoch derzeit keine zuverlässige Dissoziation-Methode, die die Host Immunzellen in die Patienten Airway-Sekretion nicht schadet. In dieser Studie stellen wir eine Probe Vorbereitung Methode, die trägen Mikrofluidik immun Beurteilung des Patienten verwendet. Unabhängig von den heterogenen strömungstechnischen Eigenschaften der klinischen Proben, die vorgeschlagene Methode erholt mehr als 95 % der Neutrophilen Atemwege Sekretion Proben, die 1,000-fold verdünnt werden mit Milliliter sauber Kochsalzlösung. Durch Rezirkulation konzentrierte Ausgabedatenstrom Erstmuster-Reservoir, sind eine hohe Konzentration, die Wiederherstellung und die Reinheit der Immunzellen zur Verfügung gestellt; Rezirkulation gilt einen Kompromiss für den Einzel-Lauf Spritze ansässige Betrieb des inertialen Mikrofluidik. Der geschlossene Betrieb der Spirale Mikrofluidik bietet Leukozyten ohne physikalische oder chemische Störungen, wie Phorbol Myristate-12 13-Acetat (PMA) zeigt-induzierte sortierte neutrophile Elastase Freilassung.

Wir erreichten transparentere immun-Zellsuspensionen mit beiden DVB-t-Mucolysis und Mikrofluidik Dissoziation (Abb. 3A). Mikrofluidik Dissoziation gesammelt 4,40 x 105 PMNs im Durchschnitt (2,1 x 104 bis 5,60 x 105 PMNs n = 6) von den Atemweg Sekretion Proben 1,000-fold verdünnt (50 mL Gesamtvolumen) in 1 mL Suspension sauber. Im Vergleich zu dem ursprünglichen Verdünnungsmittel, 94,0 % PMNs (CD66b+/CD45+...

In dieser Forschung zeigen wir markierungsfreie Neutrophilenzahl Trennverfahren von klinischen Atemwege Sekrete mit geschlossenen Regelkreis der Spirale inertial Mikrofluidik. Die vorgeschlagene Methode würde die klinische in-vitro- Tests für verschiedene Erkrankungen der Atemwege zu erweitern.

Markierungsfreie Neutrophilenzahl Anreicherung von Patienten abgeleitet Airway-Sekretion mit Closed-Loop Inertial Mikrofluidik

Airway secretions contain a large number of immune-related cells, e.g., neutrophils, macrophages, and lymphocytes, which can be used as a major resource ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Forschung zu Lungenerkrankungen wie Lungenentzündung, Asthma, Mukoviszidose und chronisch obstruktiver Lungenerkrankung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, Neutrophile des Patienten aus der Atemwegssekretion des Patienten ohne vertikale chemische Störung zu isolieren und anzureichern. Kyungyong, eine Doktorandin aus meinem Labor, wird das Verfahren vorführen.Halten Sie zunächst ein Verhältnis von 10 zu eins ein und mischen Sie den PDMS-Vorläufer mit der Base und dem Härter. Geben Sie anschließend 30 Gramm der PDMS-Mischung auf die Aluminiumform der Mikromaschine. Geben Sie dann weitere 20 Gramm PDMS-Mischung auf eine 100-Millimeter-Petrischale.Zum Entgasen geben Sie die Form und die Petrischale in den Vakuum-Exsikkator. Lassen Sie nach dem Entgasen das Vakuum los und stellen Sie die Form und die Petrischale für eine Stunde bei 90 Grad Celsius in einen Ofen. Nach einer Stunde die Form und die Petrischale aus dem Ofen nehmen und 10 Minuten bei Zimmertemperatur abkühlen lassen.Schneiden Sie anschließend mit einem Messer den Umriss ab und stanzen Sie die Löcher für den Flüssigkeitszugang mit einem Zwei

label-free-neutrophil-enrichment-from-patient-derived-airway

Research

Forschung

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologie und Infektion

In diesem Video beschreiben wir das Verfahren zur Isolierung von Neutrophilen niedriger Dichte (LDNs) aus der Peritonealspülflüssigkeit eines postoperativen menschlichen Patienten. Die so erhaltenen LDNs können in weiteren nachgelagerten Experimenten verwendet werden, um ihre Rolle beim Tumorwachstum und bei der Tumorprogression zu verstehen.

Peritoneale Isolierung von Neutrophilen niedriger Dichte: Eine Technik zur Gewinnung von Neutrophilen niedriger Dichte aus Peritonealspülflüssigkeit unter Verwendung von magnetisch aktivierter Zellsortierung

Dieses Video zeigt die Trennung von Neutrophilen von Trachealsekreten mit Hilfe eines mikrofluidischen Geräts mit spiralförmigen Kanälen. Das Gerät erreicht eine effiziente Trennung basierend auf der Zellgröße durch die Verwendung unterschiedlicher Dicken und trapezförmiger Kanäle. Das Zusammenspiel der Kräfte führt dazu, dass sich große Neutrophile in der Nähe der Innenwand ansammeln, während Erythrozyten und Muzinaggregate in der Nähe der Außenwand verbleiben, was eine effektive Trennung der...

Markierungsfreie Abtrennung von Neutrophilen aus der Trachealsekretion mittels spiralförmigem Mikrofluidikkanal

Dieses Video zeigt den Chemotaxis-Assay von Neutrophilen mit einer All-on-Chip-Methode. Die Methode ermöglicht die direkte Isolierung von Neutrophilen aus dem Vollblut durch immunomagnetische Negativselektion, gefolgt von einem Chemotaxis-Assay auf einem mikrofluidischen Chip.

Eine mikrofluidische Chip-basierte Methode zur schnellen Chemotaxis-Analyse von Neutrophilen mit Vollblut

Dieses Protokoll Details einen Test entwickelt, um menschliche Neutrophilen-Chemotaxis von einem Tropfen Vollblut mit robusten Reproduzierbarkeit messen. Dieser Ansatz umgeht die Notwendigkeit der Trennung von Neutrophilen und nur wenige Minuten von Assay Vorbereitungszeit erfordert. Die Mikrofluidik-Chip ermöglicht die wiederholte Messung der Neutrophilen-Chemotaxis über die Zeit bei Säuglingen oder Kleinsäuger, wo Probenvolumen ist begrenzt.

Mikrofluidik-Plattform zur Messung der Neutrophilen-Chemotaxis von Rohboden Vollblut

Der Gesundheitszustand der Lunge spiegelt sich in der Art und Anzahl der Immunzellen, die in den Bronchiolen der Lunge vorhanden sind. Wir beschreiben eine bronchoalveoläre Lavagetechnik, die die Isolierung und Untersuchung von nichtadhärenten Zellen und löslichen Faktoren aus dem unteren Atemtrakt der Mäuse ermöglicht.

Bronchoalveoläre Lavage von murinen Lungen zur Analyse der entzündlichen Zellinfiltration

Dieser Artikel liefert die detaillierte Methode zur Durchführung eines schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Assays durch Integration der On-Chip-Neutrophilen-Isolation aus Vollblut und dem Chemotaxis-Test auf einem einzigen mikrofluidischen Chip.

Ein All-on-Chip-Verfahren zur schnellen Neutrophilen-Chemotaxis-Analyse direkt aus einem Blutstropfen

Dieses Protokoll beschreibt eine nicht-invasive Technik für die Entnahme von ungestörten Schleimhaut Flüssigkeit aus den oberen Atemwegen. Es kann verwendet werden, die Quantifizierung der in Vivo -Level von Protein Mediatoren wie Zytokine und Chemokine, bei Patienten aller Altersgruppen durchführen.

Nicht-invasive Probenahme von Schleimhaut-Flüssigkeit für die Quantifizierung von In Vivo oberen Atemwegen immun-Mediator-Level

Dieses Manuskript beschreibt die Verwendung von nasalen und bronchialen Absorption Techniken, speziell mit synthetischen absorptive Matrizen (SAM), um die Schleimhaut Flüssigkeit (MLF) der oberen und unteren Atemwege zu probieren. Diese Methoden bieten bessere Standardisierung und Verträglichkeit als bestehende Atemwege Sampling-Techniken.

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Isolierung und Anreicherung menschlicher Lungenepithel-Vorläuferzellen für Organoidkulturen

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Ein mikrophysiologisches System zur Untersuchung der Leukozyten-Endothelzell-Interaktion während einer Entzündung

Erfahren Sie die markierungsfreie Anreicherung von Neutrophilen aus Patienten-Luftwegsekreten mittels geschlossener Kreislauf-Inertialmikrofluidik. Diese Methode ermöglicht die Isolierung funktionaler Zellen ohne chemische Störung für Atemwegserkrankungen.

Markierungsfreie Neutrophilenzahl Anreicherung von Patienten abgeleitet Airway-Sekretion mit Closed-Loop Inertial Mikrofluidik

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