Name: Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-27T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 18 s
Description: Lernen Sie die fluoreszierende Funktionalisierung von virusähnlichen Partikeln mit Disulfidbindungen durch Dibromomaleimid-Chemie. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Einführung neuer funktioneller Gruppen und die Bildung konjugationsinduzierter Fluorophore.

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J.J.G. erkennt die National Science Foundation (DMR-1654405) und Cancer Prevention Research Institut of Texas (CPRIT) (RP170752s) für ihre Unterstützung.

1. Vorbereitung
<ol><li>Machen Sie Lysogeny Brühe (LB) Agar und Gießen Sie Platten12.</li>
	<li>
BL21(DE3) mit einem pET28 Plasmid enthält die Proteinsequenz WtQβ Mantel zu verwandeln.
	<ol>
<li>E. Coli BL21(DE3) kompetente Zellen im Eisbad Auftauen. Platz 50 μL der Zellen in einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Fügen Sie 2 μL des Plasmids in eine Röhre und sanft flick das Rohr. Inkubieren Sie dann für 30 min auf Eis.</li>
		<li>Hitzeschock Zellen für 45 s in einem Wasserbad, das bei genau 42 ° C. Legen Sie das Rohr zurück in das Eisbad unmittelbar nach der Hitze schockierend, und 5 min inkubieren.</li>
		<li>Fügen Sie 950 μl LB-Medium, die keines Antibiotikum enthält.</li>
		<li>Schütteln Sie die Kultur bei 200 u/min für 60 min bei 37 ° C.</li>
		<li>Platte 100 μL der Kultur auf LB-Agar-Platten (mit Kanamycin) und die Platte über Nacht bei 37 ° c inkubieren Wählen Sie weiße Kolonien bei Bedarf.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Machen Sie Super optimale Brühe (SOB) Medien.
	<ol>
<li>Autoklaven 2 L verblüfft Erlenmeyerkolben auf einem superdry Zyklus.</li>
		<li>In eine aseptische Umgebung abwiegen und fügen 20,0 g Tryptone, 5,0 g Hefe-Extrakt, 2,469 g wasserfreies Magnesiumsulfat, 0,584 g Natriumchlorid und 0,186 g Kaliumchlorid zu jedem Kolben.</li>
		<li>Bringen Sie die Lautstärke auf 1 L mit Reinstwasser in jeder Flasche und Autoklaven auf dem flüssigen Zyklus.</li>
		<li>Sobald die SOB-Medien nach dem Autoklavieren zuerst auf Zimmertemperatur kommen, jeder Liter Medien 1 mL Kanamycin (100 mg/mL) hinzu und Lagerung bei 4 ° C.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00) zu machen.
	<ol>
<li>Machen Sie 1 M Kalium monobasic Lösung durch 68,045 g Kalium in 500 mL Reinstwasser monobasic auflösen.</li>
		<li>Machen Sie 1 M Kalium Diabas-Lösung durch 87,09 g Kalium in 500 mL Reinstwasser Diabas-auflösen.</li>
		<li>Eine 1 L Flasche 38,5 mL Kalium monobasic Lösung und 61,5 mL Kalium Diabas-hinzufügen.</li>
		<li>PH bis 7.00 Uhr bei Bedarf anpassen, und bringen auf ein Volumen von 1 L.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Machen Sie 5 – 40 % Saccharose Steigungen in 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).
	<ol>
<li>Erarbeiten Sie in 50 mL Zentrifuge Röhren Lösungen mit 5 – 40 % (in Schritten von 5 % Steigerung) Saccharose in 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00) aufgelöst.</li>
		<li>Zahlen Sie 3,3 mL 5 % Saccharoselösung am unteren Rand ein 38 mL Rundboden Polycarbonat Rohr mit einer langen Nadel Spritze ein, und wiederholen Sie dies für fünf andere Röhren.</li>
		<li>Hinterlegen Sie 3,3 mL 10 % Saccharose-Lösung an der Unterseite des Schlauches sorgfältig zu, und entfernen Sie vorsichtig die Nadel, die Steigung nicht zu stören. Wiederholen Sie für die anderen fünf Röhren. 
		 </li>
	</ol>
</li>
	<li>Weiterhin einzahlen 3,3 mL Schichten von Saccharose-Lösungen, Steigerung von 15 % bis 40 % in jedem Röhrchen vorsichtig zu sein, die Steigung nicht zu stören.</li>
	<li>Wenn Sie fertig sind, die Spitzen der Gradienten mit Folie abdecken und lagern bei-80 ° C.</li>
</ol>(2) Ausdruck der Qβ
<ol><li>Wischen Sie Bank Fläche mit Bleichmittel/Ethanol 1:1.</li>
	<li>Machen Sie zwei 3 mL Starterkulturen in eine aseptische Umgebung, indem einzelne Kolonien von E. Coli BL21(DE3) in 3 mL SOB Medien in eine aseptische Umgebung.</li>
	<li>Über Nacht auf einem Boston-Shaker mit 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % Relative Luftfeuchtigkeit (rH) wachsen.</li>
	<li>
Impfen Sie Starterkultur in SOB Medien:
	<ol>
<li>Der Shaker beide 3 mL Starterkulturen ausziehen und in eine aseptische Umgebung jeder Starter-Kultur in einer der beiden Gießen 2 L verblüfft Erlenmeyerkolben mit 1 L frische SOB Medien in jedem.</li>
		<li>Legen Sie die beimpften Medien auf einen Shaker bei 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wachsen Sie die Bakterien auf einem Boston-Shaker mit 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH bis OD600 0,9 – 1,0 erreicht.</li>
	<li>Fügen Sie 1 mL 1 M Isopropyl β-D-1 Thiogalactopyranoside (IPTG) mit einer Pipette P1000 Proteinexpression induzieren.</li>
	<li>Lassen Sie die Medien auf den Shaker bei 250 u/min in einem 37 ° C und 0 % rH-Raum über Nacht.</li>
	<li>Entfernen Sie Medien aus der Shaker am folgenden Morgen und Zentrifuge mit 1000 mL-Flaschen bei 20.621 × g für 1 h bei 4 ° C um die Zellen zu ernten.</li>
	<li>
Verwerfen Sie den überstand und sammeln Sie die Zelle Pellet.
	<ol>
<li>Gießen Sie den überstand in eine Flasche mit ca. 5 mL Bleichen, um Bakterien abzutöten. Das ist Verschwendung.</li>
		<li>Einem Spatel zu kratzen die Zelle Pellet aus der Zentrifuge Flaschenboden und das Pellet in ein 50 mL Zentrifugenröhrchen.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. Reinigung des Qβ
<ol><li>Aufschwemmen der Zelle Pellet mit ~ 20 – 30 mL 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).</li>
	<li>Stellen Sie sicher die Wiederfreisetzung hat keine Klumpen, und lösen Sie die Zellen mit einem Microfluidizer Prozessor laut Protokoll des Herstellers (siehe Tabelle der Materialien). Lösen Sie die Zellen mindestens zweimal, um den Ertrag der Partikel zu erhöhen.</li>
	<li>Zentrifugieren der lysate in 250 mL Zentrifuge Flaschen bei 20.621 x g für 1 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Entsorgen Sie das Pellet und Messen Sie das Volumen der Überstand in mL. Multiplizieren Sie diesen Wert durch 0.265 und der Überstand fügen Sie diesen Betrag von g Ammoniumsulfat hinzu.</li>
	<li>Rühren Sie bei 4 ° C für mindestens 1 h auf einem Teller rühren bei 200 u/min das Protein ausgefällt.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie in 250 mL Flaschen bei 20.621 x g für 1 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Überstand verwerfen und erneut das Pellet mit etwa 10 mL 0,1 M Kalium Phosphatpuffer (pH 7,00).</li>
	<li>Gleiche Volumina von 1:1 Chloroform/n-Butanol am rohen Probe und fügen Sie Mischung durch Vortexen für ein paar Sekunden hinzu.</li>
	<li>Für 30 Minuten bei 4 ° c in 38 mL Röhrchen mit 20.621 × g zentrifugieren</li>
	<li>Die obere wässrige Schicht mit einer Pasteurpipette zu erholen. Seien Sie vorsichtig, nicht auf das Gel wie Schicht zu nehmen, der zwischen die wässrige und organische Schicht gebildet hat.</li>
	<li>Tauen Sie sechs 5 – 40 % vorgefertigte Saccharose Steigungen und laden Sie ca. 2 mL des Extrakts auf jede.</li>
	<li>Ultrazentrifugen 99.582 x g für 16 h bei 4 ° C mit kostenlosen Verlangsamung.</li>
	<li>Licht emittierende Dioden (LED) Licht unter jedes Rohr und ein blaues Band sollte sichtbar. Diese Partikel mit einer langen Nadel Spritze zu erholen.</li>
	<li>Ultrapellet die Partikel bei 370.541 x g 2,5 h bei 4 ° C.</li>
	<li>Den überstand verwerfen und Aufschwemmen der transparenten Pellets gereinigten Partikel mit 0,1 M Kalium-Phosphat-Puffer (pH 7,00).</li>
</ol>(4) Quantifizierung und Bestätigung des Produkts
<ol><li>Verwenden Sie Bradford-Test, um Produkt-13zu quantifizieren.</li>
	<li>Laufen zu reduzieren und nicht-reduzierende Sodium Dodecyl Sulfat Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE), die Produkt-14zu bestätigen. Hinweis: Verringerung der SDS-PAGE wird verwendet, um das Molekulargewicht des Hüllprotein bestätigen; nicht-reduzierende SDS-PAGE ist der höhere Auftragsstruktur bestätigen.</li>
</ol>(5) Konjugation DB Verbindungen auf Qβ
<ol><li>
Reduzieren Sie Disulfides auf Qβ.
	<ol>
<li>Lösen Sie 0,0020 g des tris(2-carboxyethyl) Phosphin (DÄMMUND) in 1 mL Reinstwasser eine 100 X-Stammlösung zu machen. Hinweis: Bereiten Sie frische DÄMMUND vor der Reduktion.</li>
		<li>Fügen Sie 200 µL des Qβ (5 mg/mL) zu einem Microcentrifuge Schlauch.</li>
		<li>Folgen Sie durch Zugabe von 20 µL der Stammlösung der 100 X TCEP.</li>
		<li>Inkubation bei Raumtemperatur für 1 h.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Neu Brücke reduzierte Disulfid mit Dibromomaleimide Polyethylenglykol (DB-PEG).
	<ol>
<li>0,0017 g Dibromomaleimide-Polyethylenglykol (DB-PEG) in 100 µL DMF auflösen.</li>
		<li>680 µL 10 mM Natriumphosphat Lösung (pH 5,00) hinzufügen.</li>
		<li>Fügen Sie Qβ in die DB-PEG-Lösung reduziert und beobachten Sie den Mischprozess unter 365 nm UV-Licht zu. Die helle gelbe Fluoreszenz kann sofort mit einer 365 nm handheld UV-Lampe beim Mischen visualisiert werden.</li>
		<li>Lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur (RT) auf ein Drehspieß fortfahren.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Das Reaktionsgemisch durch zentrifugale Filter zu reinigen (COMW = 10 kDa) dreimal mit 1 X PBS 3.283 x g für 20 min bei 4 ° C.</li>
	<li>Überwachen Sie die Konjugation von nicht-Verringerung der SDS-PAGE und native Agarose-Gelelektrophorese. Hinweis: Untersuchten als intakt Partikel in native Agarosegel, und trennt sie je nach ihrer Ladung, Größe und Form.</li>
</ol>

<ol><li>Pokorski, J., Breitenkamp, K., Liepold, L., Qazi, S., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+Virus-Based+Polymer-Protein+Nanoparticles+by+Atom+Transfer+Radical+Polymerization%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Functional Virus-Based Polymer-Protein Nanoparticles by Atom Transfer Radical Polymerization.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (24), 9242-9245 (2011).</li>
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<li>Manzenrieder, F., Luxenhofer, R., Retzlaff, M., Jordan, R., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+of+Virus-like+Particles+with+Poly%282-oxazoline%29s%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Stabilization of Virus-like Particles with Poly(2-oxazoline)s.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 50 (11), 2601-2605 (2011).</li>
<li>Chen, Z., Li, N., Chen, L., Lee, J., Gassensmith, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Functionalized+Bacteriophage+Q%CE%B2+as+a+Photocaged+Drug+Carrier%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Dual Functionalized Bacteriophage Qβ as a Photocaged Drug Carrier.</a> Small. 12 (33), 4563-4571 (2016).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Im Vergleich zu kleineren Proteinreinigung, ist ein einzigartiger Schritt bei der Reinigung von Bakteriophagen Qβ der Saccharose gradient Zentrifugation. Nach dem Chloroform/n-Butanol Extraktionsschritt wird Qβ weiter gereinigt mit 5-40 % Saccharose Steigungen. Bei der Zentrifugation werden Partikel anhand ihrer Größe getrennt. Größere Partikel Reisen in die höhere Dichte-Region, während kleinere Partikel in der niedrigeren Dichte Region bleiben. Qβ reist in das untere Drittel des Farbverlaufs und verweilt dort, während ...

Mit viralen Capsids nanogrösse entstanden als ein spannendes Gebiet, die darauf abzielt, die Ausweitung der Anwendungen in der biomedizinischen Forschung1,2,3. Rekombinant ausgedrückt virusähnliche Partikel (untersuchten) strukturell Viren abgeleitet sind, aber es fehlt das original virale Erbgut so dass sie nicht-infektiösen proteinhaltige Nanopartikel. Da die Oberflächen-Features genetisch programmiert sind und jede Kapsid sich identisch zu den davor und dahinter drückt, ist es möglich, die Lage und Anzahl der reaktiven Seitenketten der Aminosäuren mit atomistischen Präzision kennen. In vielen Fällen besitzen die äußeren und inneren Oberflächen viele Arten von Lösungsmittel ausgesetzt Aminosäurereste, die praktisch durch biokonjugaten Reaktionen - Reaktionen funktionalisiert werden können, die bilden kovalente Bindungen zwischen ein Biomolekül und ein synthetisches Molekül-4,-5.
Biokonjugaten Reaktionen helfen Biomoleküle von Interesse vielfältigere Funktionen auf relativ einfache Weise haben. Moleküle von Interesse, wie Medikamente6, fluoreszierende Tags7 und Polymere8,9 können Pre synthetisiert und charakterisiert, bevor sie auf der Oberfläche des untersuchten zugeordnet sind. Eine besonders häufige VLP in biomedizinischen und Biomaterialien Forschung wurde der VLP basiert auf Bakteriophagen Qβ, die als rekombinant ausgedrückt, ein 28 nm ikosaedrischen Kapsid virale10. Die häufigsten Lokalisationen der Reaktion auf Qβ sind Lysines bei weitem, obwohl wir vor kurzem die erfolgreiche Konjugation11 Dibromomaleimide Verbindungen zu den reduzierten Disulfides kommuniziert haben, die die Poren des Qβ über eine Haddleton-Baker-Reaktion säumen. Die Reaktion verläuft mit gutem Ertrag und ebenso wichtig ist, ohne die thermische Stabilität der Partikel zu verlieren. Zur gleichen Zeit erzeugt diese Reaktion Konjugation-induzierte Fluoreszenz, die verwendet werden, um die Aufnahme dieser Partikel in Zellen zu verfolgen. In dieser Arbeit zeigen wir die Konjugation von Polyethylenglykol (PEG) auf die Oberfläche des Qβ durch die Haddleton-Baker-Reaktion, die Ergebnisse in einem hellen gelben Fluorophor. Diese Partikel können dann verfolgt werden, wie sie von den Zellen aufgenommen werden. Das Protokoll hier hilft Forschern neue fluoreszierende pegylierten Qβ, proteinhaltige Nanopartikel Grundlage zu generieren, obwohl seine Prinzipien auf einer der vielen anderen untersuchten mit Lösungsmittel ausgesetzt Disulfides anwendbar sind.

<table><tbody><tr><td>LB Bouillon (Müller)&nbsp;</td><td>EMD Millipore</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Trypton, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>T60060-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Hefeextrakt, Poweder</td><td>Research Products International</td><td>Y20020-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Wasserfreies Magnesiumsulfat</td><td>P212121</td><td>CI-06808-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Natriumchlorid (kristallin/ACS-zertifiziert)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumchlorid</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP366-500</td><td></td></tr><tr><td>Elga PURELAB Flex 3 Wasseraufbereitungssystem</td><td>Fisher Scientific</td><td>4474524</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Monobasisch</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP362-1</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumphosphat Dibasisch wasserfrei</td><td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td></td></tr><tr><td>Saccharose</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>S25590B</tr><tr><td>Ethanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818500</td><td></td></tr><tr><td>Isopropyl &beta; -D-1-thiogalactopyranosid (IPTG)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>I6758-1G</td><td></td></tr><tr><td>Fiberlite F10-4x1000 LEX Rotor&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>096-041053</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumsulfat</td><td>P212121</td><td>KW-0066-5KG</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Alfa Aesar</td><td>32614-M6</td><td></td></tr><tr><td>1-Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-4</td><td></td></tr><tr><td>SW 28 Ti Rotor, Ausschwingschaufel, Aluminium</td><td>Beckman Schar</td><td>342204: SW 28 Ti Rotor/ 342217: Schaufelsatz</td><td></td></tr><tr><td>Typ 70 Ti Rotor, fester Winkel, Titan, 8 x 39 mL,</td> <td>Beckman Coulter</td><td>337922</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie (Bradford) Protein Assay</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI23200</td><td></td></tr><tr><td>TRIS Hydrochloride</td><td>Research Products International</td><td>T60050-1000.0</td><td></td></tr><tr><td>Tetramethylethylendiamin</td><td>Alfa Aesar</td><td>J63734-AC</td><td></td></tr><tr><td>Tris(2-carboxyethyl)phosphinhydrochlorid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C4706-2G</td><td></td></tr><tr><td>2 3-Dibrommaleimid 97%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>553603-5G</td><td></td></tr><tr><td>Polythylenglykol</td><td>Alfa Aesar</td><td>41561-22</td><td></td></tr><tr><td>Natriumphosphat</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC424375000</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamid / Bis-Acrylamid</td><td>P212121</td><td>RP-A11310-500.0</td><td></td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771-100G</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumpersulfat</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP179-100</td><td></td></tr><tr><td>FV3000 konfokales Laser-Scanning-Mikroskop</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>FV3000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Labnet Revolver Verstellbarer Rotator&nbsp;</td><td>Thomas Wissenschaftlich&nbsp;</td><td>1190P25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1000 mL Sorvall Hochleistungsflasche, PC, mit Aluminiumkappe&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>010-1459</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Zentrifugenflaschen mit Verschluss, Polypropylen-Copolymer</td><td>Thermo Scientific</td><td>3141-0250</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Röhrchen mit rundem Boden; 38 mL; PC</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380</td><td></td></tr><tr><td>2 L Erlenmeyerkolben mit schmalem Mund und Hochleistungsrand</td><td>Pyrex</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra-4 Zentrifugalfiltereinheiten</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC801024</td><td></td></tr><tr><td>M-110P Mikrofluidisierer Materialprozessor</td><td>Mikrofluidik</td><td>M-110P</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Hochgeschwindigkeits-Zentrifugenröhrchen aus Polycarbonat mit rundem Boden</td><td>Thermo Scientific</td><td>3117-0380PK</td><td></td></tr><tr><td>Flasche, mit Verschluss,</td><td>Beckman-Schar</td><td>aus Polycarbonat 41121703</td><td></td></tr><tr><td>Zylinder, graduiert - Polypropylen 250 mL</td><td>PolyLab</td><td>80005</td><td></td></tr><tr><td>533LS-E Serie Dampfsterilisatoren</td><td>Getinge</td><td>533LS-E</td><td></td></tr><tr><td>TrueLine, Zellkulturplatte, behandelt, PS, 96 Well, mit Deckel</td><td>LabSource</td><td>D36-313-CS</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 mL Konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959-53A</td><td></td></tr><tr><td>Mikrozentifugenröhrchen: 1,5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-408-129</td><td></td></tr><tr><td>VWR Os-500 Orbitalschüttler</td><td>VWR Scientifc Produkte</td><td>14005-830</td><td></td></tr><tr><td>Tetra Handcast Systeme</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylen, 250 mL</td><td>Beckman Coulter</td><td>41121703</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofluorometer NanoDrop</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>3300</td><td></td></tr><tr><td>Lange Nadel&nbsp;</td><td>Hamilton&nbsp;</td><td>7693</td><td></td></tr><tr><td>Exel International 5 bis 6 cc Spritzen Luer-Lock</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-841-46</td><td></td></tr><tr><td>P1000 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>P200 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123601</td><td></td></tr><tr><td>P100 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123615</td><td></td></tr><tr><td>P20 Pipetman</td><td>Gilson</td><td>F123600</td><td></td></tr><tr><td>P10 Pipetman</td><td>Gilson</td><td></td><td></td>F144802</tr><tr><td>Intel Weighing PM-100 Laboratory Classic Hochpräzise Laborwaage</td><td>Intelligente Wiegetechnologie</td><td>IWT_PM100</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 50 mL Konisches Zentrifugenröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>4&ndash; 15% Mini-PROTEAN TGX Gel, 10 Well, 50 & Mikro; l</td><td>Bio-Rad</td><td>456-1084</td><td></td></tr></tbody></table>

konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche partikel durch dibromomaleimide-disulfid chemie zu machen

Making Conjugation-induced Fluorescent PEGylated Virus-like Particles by Dibromomaleimide-disulfide Chemistry

Der jüngste Anstieg virusähnliche Partikel (untersuchten) in biomedizinischen und Materialforschung kann einfache Biosynthese, diskrete Größe, genetische Programmierbarkeit und biologische Abbaubarkeit zugeschrieben werden. Während sie biokonjugaten Reaktionen für das Hinzufügen von synthetischen Liganden auf ihrer Oberfläche sehr zugänglich sind, ist das Angebot in biokonjugaten Methoden auf diese wässrigen geboren Capsids relativ begrenzt. Um die Ausrichtung der funktionalen Biomaterialien Forschung zu erleichtern, müssen nicht traditionele biokonjugaten Reaktionen berücksichtigt werden. Die Reaktion in diesem Protokoll beschriebenen verwendet Dibromomaleimides, neue Funktionen in dem Lösungsmittel vorstellen exponierten Disulfid-Bindungen der ein VLP Bakteriophagen Qβ zugrunde. Darüber hinaus ist das Endprodukt Leuchtstofflampen, die hat den zusätzlichen Vorteil eine verfolgbaren in-vitro- Sonde mit einem handelsüblichen Filtersatz zu erzeugen.

Die Dibromomaleimide-Derivate können durch die Kondensationsreaktion zwischen Dibromomaleimide-Anhydrid und primäre Amine15synthetisiert werden. Alternativ wurde eine milde synthetische Methode16 mit N-Methoxycarbonyl aktiviert 3,4-Dibromomaleimide hier ausgenutzt durch die Reaktion mit Methoxypolyethylene Glykol (PEG) Rendite DB-PEG (Abbildung 1). NMR wurde verwendet, um die zusammengesetzte Struktur (<strong c...

Hier präsentieren wir Ihnen eine Prozedur zum eindringmittel Funktionalisieren Disulfides auf Qβ VLP mit Dibromomaleimide. Wir beschreiben Qβ Ausdruck und Reinigung, die Synthese von Molekülen Dibromomaleimide funktionalisiert und die Konjugation-Reaktion zwischen Dibromomaleimide und Qβ. Das daraus resultierende gelbe fluoreszierende konjugierte Teilchen kann als Fluoreszenz Sonde innerhalb der Zellen verwendet werden.

Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen

The recent rise in virus-like particles (VLPs) in biomedical and materials research can be attributed to their ease of biosynthesis, discrete size, ...

Das übergeordnete Ziel dieser Bio-Konjugationsmethode besteht darin, disulfidhaltige virusähnliche Partikel fluoreszenzmarkiert funktionalisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Bio-Konjugationsreaktion bei virusähnlichen Partikeln zu beantworten, die nur eine begrenzte Anzahl von Aminosäureresten aufweisen, die funktionalisiert werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch eine einzige Reaktion neue funktionelle Gruppen eingeführt und konjugationsinduzierte Fluorophore gleichzeitig gebildet werden können. Neben Q-Beta glauben wir, dass diese Reaktion auf beliebige virusähnliche Partikel angewendet werden kann, die Disulfidbindungen enthalten.Bevor mit dem Verfahren zur Expression des Q-Beta-Bakteriophagen begonnen wird, sollte die Arbeitsfläche mit einer 1:1-Bleichmittel:Ethanol-Lösung abgewischt werden. In einer aseptischen Umgebung zwei Starterkulturen mit je drei Milliliter herstellen, indem einzelne Kolonien von E. coli BL21 in SOB-Medium gegeben werden. Die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 0 % relativer Luftfeuchtigkeit bei 250 U/min schütteln. Am folgenden Tag beide dreimilliliter Starterkulturen vom Schüttler nehmen und in

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Methode zur Messung des Viral Fusion Kinetics auf der Single Particle Stufe

Unter Ausnutzung der Fortschritte in der Fluorophor Entwicklung und Imaging-Technologie, eine einfache Methode, Alexa Fluor Kennzeichnung von Dengue-Virus entwickelt, um den frühen Interaktionen zwischen Virus und Zelle sichtbar war.

Visualizing Dengue Virus durch Alexa Fluor Labeling

Adenovirus-Partikeln wurden entwickelt, um entweder die unnatürliche Aminosäure analogen azidohomoalanine oder die Azido Zucker...

Chemoselektive Modifizierung von Oberflächen durch Viral Bioorthogonale Click-Chemie

Pflanzen virale Nanopartikel (VNPS) sind vielversprechende Plattformen für Anwendungen in der Biomedizin. Hier beschreiben wir die Verfahren für die Anlage VNP Ausbreitung, Reinigung, Charakterisierung und Biokonjugation. Schließlich zeigen wir die Anwendung der VNPS für die Tumor-Homing und Bildgebung mit der Maus Xenograft-Modell und Fluoreszenz-Bildgebung.

Viral Nanopartikel für<em&gt; In vivo</em&gt; Tumor Imaging

Source: Olety, B., et. al., Visualization of HIV-1 Gag Binding to Giant Unilamellar Vesicle (GUV) Membranes. J. Vis. Exp. (2016)This study demonstrates a fluorescence-based assay to observe the membrane-binding behavior of human immunodeficiency virus type-1 structural protein. Using synthetic giant unilamellar vesicles as model membranes, the assay visualizes protein recruitment and assembly, mimicking early steps of viral particle formation.

Visualizing Viral Structural Protein Assembly on Giant Unilamellar Vesicle Membranes

Quelle: Natilla, A., und Hammond, R. W. Analyse der Lösungsmittelzugänglichkeit von Cysteinresten auf Virus-ähnlichen Partikeln des Maisstreifenvirus, hergestellt in Nicotiana benthamiana-Pflanzen, und Vernetzung von Peptiden an VLPs. J. Vis. Exp. (2013)Dieses Video zeigt die ortsspezifische fluoreszierende Markierung von in Nicotiana benthamiana hergestellten mutierten Virus-ähnlichen Partikeln (VLPs) mittels eines thiolreaktiven Farbstoffs, gefolgt von der Reinigung und Gelelektrophorese zur...

Markierung von oberflächenzugänglichen Cysteinresten in biotechnologisch hergestellten virusähnlichen Partikeln

Quelle: Chen, Z., et al. Herstellung von konjugationsinduzierten fluoreszierenden PEGylierten Virus-ähnlichen Partikeln mittels Dibrommaleimid-Disulfid-Chemie. J. Vis. Exp. (2018)In diesem Video wird die Methode zur kontrollierten Expression des Kapsidproteins des Bakteriophagen Qβ in modifizierten E. coli demonstriert. Die resultierenden Proteine lagern sich selbst zu virusähnlichen Partikeln zusammen, die für die nachgeschaltete Biokonjugation gewonnen werden.

Produktion von virusähnlichen Partikeln in modifizierten E. coli

Quelle: Chen, Z., et al. Herstellung von konjugationsinduzierten fluoreszierenden pegylierten Virus-ähnlichen Partikeln mittels Dibromomaleimid-Disulfid-Chemie. J. Vis. Exp. (2018)In diesem Video wird die fluoreszente Funktionalisierung von virusähnlichen Partikeln durch das Wiedervernetzen reduzierter Disulfide mit einem Polyethylenglykol (PEG)-Linker gezeigt, wodurch stabile, verfolgbare Konjugate entstehen, die für die zelluläre Bildgebung und gezielte Abgabe in biomedizinischen Anwendungen...

Fluoreszierende Funktionalisierung von virusähnlichen Partikeln durch Disulfid-Re-Bridging

Hier wird ein schnelles und modulares Protokoll zur Erzeugung rekombinanter Impfstoffviren beschrieben, die fluoreszierend markierte Proteine gleichzeitig mit der Methode der transienten dominanten Selektion exezieren.

Methodik zur effizienten Erzeugung fluoreszierender Vaccinia-Virusproteine

Wir veranschaulichen hier einen in vitro Membranbindungsassay, in dem Wechselwirkungen zwischen HIV-1 Gag und Lipidmembranen visuell analysiert werden, unter Verwendung von YFP-tagged Gag, synthetisiert in einem weizenkeimbasierten in vitro Translationssystem und GUVs, die durch eine Elektroformationstechnik hergestellt wurden.

Visualisierung von HIV-1 Gag Bindung an Riesen unilamellare Vesikeln (GUV) Membranes

Wir haben das Kapsid Protein von Hepatitis E Virus als Theranostik Nanopartikel (HEVNP) entwickelt. HEVNP montiert selbst in einen stabilen ikosaedrischen Käfig in Schleimhaut Lieferung. Hier beschreiben wir die Änderung des HEVNPs für Tumor gezielt durch Mutationen Oberfläche ausgesetzt Rückstände, Cysteine, die synthetische Liganden konjugieren, die Tumorzellen gezielt zu binden.

Oberfläche Funktionalisierung der Hepatitis E Virus Nanopartikel chemische Konjugation Methoden

Lernen Sie die fluoreszierende Funktionalisierung von virusähnlichen Partikeln mit Disulfidbindungen durch Dibromomaleimid-Chemie. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Einführung neuer funktioneller Gruppen und die Bildung konjugationsinduzierter Fluorophore.

Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen

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