Konjugation-induzierte fluoreszierende pegylierten virusähnliche Partikel durch Dibromomaleimide-Disulfid Chemie zu machen
27. Mai 2018
Hier präsentieren wir Ihnen eine Prozedur zum eindringmittel Funktionalisieren Disulfides auf Qβ VLP mit Dibromomaleimide. Wir beschreiben Qβ Ausdruck und Reinigung, die Synthese von Molekülen Dibromomaleimide funktionalisiert und die Konjugation-Reaktion zwischen Dibromomaleimide und Qβ. Das daraus resultierende gelbe fluoreszierende konjugierte Teilchen kann als Fluoreszenz Sonde innerhalb der Zellen verwendet werden.
Das übergeordnete Ziel dieser Bio-Konjugationsmethode besteht darin, disulfidhaltige virusähnliche Partikel fluoreszenzmarkiert funktionalisieren. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen zur Bio-Konjugationsreaktion bei virusähnlichen Partikeln zu beantworten, die nur eine begrenzte Anzahl von Aminosäureresten aufweisen, die funktionalisiert werden können. Der Hauptvorteil dieser Technik liegt darin, dass durch eine einzige Reaktion neue funktionelle Gruppen eingeführt und konjugationsinduzierte Fluorophore gleichzeitig gebildet werden können. Neben Q-Beta glauben wir, dass diese Reaktion auf beliebige virusähnliche Partikel angewendet werden kann, die Disulfidbindungen enthalten.
Bevor mit dem Verfahren zur Expression des Q-Beta-Bakteriophagen begonnen wird, sollte die Arbeitsfläche mit einer 1:1-Bleichmittel:Ethanol-Lösung abgewischt werden. In einer aseptischen Umgebung zwei Starterkulturen mit je drei Milliliter herstellen, indem einzelne Kolonien von E. coli BL21 in SOB-Medium gegeben werden. Die Kulturen über Nacht bei 37 Grad Celsius und 0 % relativer Luftfeuchtigkeit bei 250 U/min schütteln. Am folgenden Tag beide dreimilliliter Starterkulturen vom Schüttler nehmen und in einer aseptischen Umgebung jeweils in einen zweiliterfassenden Erlenmeyerkolben mit Baffeln, der ein Liter frisches SOB-Medium enthält, umfüllen. Die beiden Kolben mit dem beimpften Medium auf einen Schüttler bei 250 U/min im Raum mit 37 Grad Celsius und 0 % relativer Luftfeuchtigkeit stellen. Die Bakterienkulturen wachsen lassen, bis eine optische Dichte bei 600 Nanometern (OD 600) von 0,9 bis 1,0 erreicht ist. Dies dauert gewöhnlich etwa fünf Stunden. Sobald die Kulturen den gewünschten OD 600-Wert erreicht haben, mit einer P1000-Pipette je einen Milliliter einer einmolaren IPTG-Lösung zu jedem Kolben hinzufügen, um die Proteinexpression zu induzieren. Die Kolben über Nacht im Brutschrank auf dem Schüttler belassen.
Am folgenden Morgen die Kolben vom Schüttler nehmen, den Inhalt jedes Kolbens in eine Ein-Liter-Flasche überführen und bei vier Grad Celsius eine Stunde lang mit 20.621 ×g zentrifugieren, um die Zellen zu gewinnen. Nach Beendigung der Zentrifugation das Überstandsvolumen abgießen und in einen Kolben mit etwa fünf Milliliter Bleiche geben, um die Bakterien abzutöten.
Um das Zellpellet zu sammeln, verwenden Sie einen Spatel, um das Zellpellet vom Boden der Zentrifugenflasche abzukratzen, und überführen Sie das Pellet in ein 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen.
Um mit der Q-Beta-Reinigung zu beginnen, resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 20 bis 30 Milliliter 0,1-molarer Kaliumphosphatpufferlösung, pH 7. Stellen Sie sicher, dass die Suspension keine Klumpen enthält. Lyse die Zellen mithilfe eines Mikrofluidisierers gemäß dem Herstellerprotokoll. Führen Sie die Zelllyse mindestens zweimal durch, um die Ausbeute an Partikeln zu erhöhen. Überführen Sie die Lysate in 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen und zentrifugieren Sie bei 20.621 × g bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Messen Sie das Volumen des Überstandes in Milliliter. Multiplizieren Sie diesen Wert mit 0,265 und geben Sie die entsprechende Menge an Ammoniumsulfat in Gramm zum Überstand hinzu. Fügen Sie einen Rührstab hinzu und rühren Sie mindestens eine Stunde lang auf einer Rührplatte bei 200 Umdrehungen pro Minute und vier Grad Celsius, um das Protein auszufällen. Zentrifugieren Sie in 250-Milliliter-Röhrchen bei 20.621 × g bei vier Grad Celsius für eine Stunde. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in etwa 40 Milliliter 0,1-molarer Kaliumphosphatpufferlösung, pH 7. Geben Sie zum rohen Probengemisch gleiche Volumina von 1:1-Chloroform:n-Butanol hinzu und mischen Sie durch mehrsekündiges Wirbelmischen. Überführen Sie die Mischung in ein 38-Milliliter-Röhrchen. Zentrifugieren Sie bei 20.621 × g bei vier Grad Celsius für 30 Minuten. Verwenden Sie eine Pipette, um die obere wässrige Phase zu gewinnen. Achten Sie darauf, keine Bestandteile der gelartigen Schicht zwischen der wässrigen und der organischen Phase mit aufzunehmen.
Als Nächstes tauen Sie vorgefertigte Saccharosegradienten von 65 auf 40 % auf. Geben Sie etwa zwei Milliliter des Extrakts auf jeden Gradienten.
Ultrazentrifugieren Sie bei 99.582 × g bei vier Grad Celsius für 16 Stunden mit freier Verzögerung. Sobald die Ultrazentrifugation abgeschlossen ist, leuchten Sie mit einem LED-Licht unter jedes Reagenzglas, um zu überprüfen, ob ein blauer Band sichtbar ist. Verwenden Sie eine Spritze mit langem Nadel, um diese Partikel zu gewinnen. Ultrazentrifugieren Sie die Partikel erneut bei 370.541 × g bei vier Grad Celsius für 2,5 Stunden. Das resultierende Pellet aus gereinigten Partikeln sollte transparent sein. Entsorgen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Pellet in 0,1-molarer Kaliumphosphatpufferlösung, pH 7.
Dieses Schema zeigt die Konjugation, die demonstriert wird. 10 Äquivalente Tris(2-carboxyethyl)phosphin oder TCEP bezogen auf die Disulfide in einem Milligramm Q-Beta werden verwendet, um alle Disulfide bei Raumtemperatur innerhalb einer Stunde zu reduzieren und die reduzierten Q-Beta-Kapside zu erzeugen. Unmittelbar vor der Reduktion der Disulfide auf Q-Beta eine frische TCEP-Lösung herstellen.
Lösen Sie 0,002 Gramm TCEP und ein Milliliter ultra-reines Wasser zur Herstellung einer 100X-Stammlösung auf. Geben Sie 200 Mikroliter einer fünf Milligramm pro Milliliter Q-Beta-Lösung in ein Mikrozentrifugenröhrchen. Fügen Sie anschließend 20 Mikroliter der 100X-TCEP-Stammlösung dem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur.
Bereiten Sie derweil die Lösung des Dibrom-maleimid-Polyethylenglykols (DB-PEG) für die spätere Re-Brückung reduzierter Disulfide vor. Lösen Sie 0,0017 Gramm DB-PEG in 100 Mikrolitern Dimethylformamid. Geben Sie 680 Mikroliter einer 10-Millimolar-Natriumphosphatlösung, pH 5, hinzu. Anschließend wird das reduzierte Q-Beta in die DB-PEG-Lösung gegeben, und der Mischvorgang unter einer handgehaltenen 365-Nanometer-UV-Lampe beobachtet. Unmittelbar nach dem Mischen sollte eine intensive gelbe Fluoreszenz sichtbar werden. Lassen Sie die Reaktion über Nacht bei Raumtemperatur auf einem Rotisserie-System ablaufen.
Am folgenden Morgen die Reaktionsmischung durch einen Zentrifugalfilter unter Verwendung von 1X PBS bei 3.283 × g und vier Grad Celsius über 20 Minuten reinigen. Abschließend die Konjugation mittels nichtreduzierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und nativer Agarose-Gelelektrophorese überwachen.
Die Konjugation von DB-PEG an Q-Beta wurde mittels nichtreduzierender SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter UV- und Coomassie-Blau-Färbung bestätigt. Alle fluoreszierenden Banden zeigten eine räumliche Übereinstimmung mit der Coomassie-Blau-Färbung, was auf eine erfolgreiche Konjugation hinweist. Die Integrität der Q-Beta-PEG-Konjugate wurde durch native Agarose-Gelelektrophorese und Transmissionselektronenmikroskopie bestätigt.
Das obere Mikrofoto zeigt Q-Beta-Maleimid oder Q-Beta-M und das untere Mikrofoto zeigt Q-Beta-PEG. Die Fluoreszenzspektroskopie von Q-Beta-M und Q-Beta-PEG in 0,1 molarer Kaliumphosphatpufferlösung zeigte ein Anregungsmaximum bei etwa 400 Nanometern und ein Emissionsmaximum bei etwa 540 bis 550 Nanometern. Nach Inkubation von Q-Beta-PEG mit Maus-Makrophagenzellen in serumfreiem DMEM-Medium gefolgt von einer Kernanfärbung zeigen Aufnahmen der Kolokalisation, dass gelb fluoreszierende Partikel von den Zellen aufgenommen wurden und nach vierstündiger Inkubation verfolgt werden können.
Im Gegensatz dazu weisen die nicht funktionalisierten Q-Beta virusähnlichen Partikel vernachlässigbare Fluoreszenz auf.
Dieses Protokoll kann Forschern dabei helfen, Q-Beta innerhalb von vier Tagen zu reinigen, und ermöglicht die Durchführung der Übernacht-Re-Brückungs-Konjugationsreaktion. Bei der Durchführung dieses Verfahrens ist es wichtig zu beachten, dass die Konjugationsreaktion unter sauren Bedingungen, wie einem pH-Wert von 5, am besten funktioniert.
Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man Q-Beta-VLPs reinigt und die Disulfidbrücken mit Dibrom-maleimid-Verbindungen erneut verknüpft, um ein fluoreszenzmarkiertes VLP herzustellen. Nach ihrer Entwicklung bot diese Technik den Forschern einen zusätzlichen funktionellen Angriffspunkt, der verwendet werden kann, um die Außenoberfläche des Bakteriophagen Q-Beta doppelt zu funktionalisieren.
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Übersicht
In diesem Artikel wird eine Bio-Konjugationsmethode zur fluoreszenzmarkierten Funktionalisierung von Disulfid enthaltenden virusähnlichen Partikeln, insbesondere Qβ VLPs, vorgestellt. Das Verfahren ermöglicht die Einführung neuer funktioneller Gruppen sowie die Bildung von Konjugations-induzierten Fluorophoren in einer einzigen Reaktion.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Bio-Konjugation
- Virusähnliche Partikel
- Fluoreszenzmarkierung
Hintergrund
- Disulfidbrücken in virusähnlichen Partikeln beschränken die Funktionalisierungsmöglichkeiten.
- Fluoreszenzsonden sind für zelluläre Untersuchungen unerlässlich.
- Der Qβ-Bakteriophage dient als Modell für diese Methode.
- Aseptische Techniken sind entscheidend für den Erfolg der Experimente.
Zweck der Studie
- Entwicklung einer Methode zur Funktionalisierung von Disulfiden an Qβ-VLPs.
- Ermöglichung der Untersuchung von Bio-Konjugationsreaktionen in virusähnlichen Partikeln.
- Herstellung fluoreszierender Sonden für zelluläre Anwendungen.
Verwendete Methoden
- Expression und Reinigung von Qβ-Bakteriophagen.
- Synthese von dibromomaleimid-funktionalisierten Molekülen.
- Konjugationsreaktion zwischen Dibromomaleimid und Qβ.
- Anwendung aseptischer Techniken bei der Herstellung von Anzuchtkulturen.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche fluoreszente Funktionalisierung von Qβ VLPs.
- Bildung gelb fluoreszierender konjugierter Partikel.
- Mögliche Anwendung der Methode auf andere virusähnliche Partikel.
- Nachweis einer Einzelreaktion, die mehrere funktionelle Gruppen einführt.
Schlussfolgerungen
- Die Methode markiert disulfidhaltige, virusähnliche Partikel effektiv mit Fluoreszenzfarbstoffen.
- Diese Technik kann die Untersuchung der Bio-Konjugation in der Virologie verbessern.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf verschiedene virusähnliche Partikel mit Disulfidbindungen erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Ausschlaggebende Bedeutung für die Industrie
Diese Methode ermöglicht die duale Funktionalisierung von virusähnlichen Partikeln, indem synthetische Liganden eingeführt und intrinsische Fluoreszenz in einem einzigen Schritt erzeugt werden, wodurch die begrenzten Optionen für Bio-Konjugation an disulfidreichen VLPs überwunden werden. Die resultierenden fluoreszierenden Sonden unterstützen Untersuchungen zum zellulären Uptake und die Echtzeit-Verfolgung in vitro, wodurch die Zielvalidierung und die Entwicklung von Assays verbessert werden. Durch die Erweiterung des chemischen Werkzeugsatzes für die Modifikation von VLPs erhöht die Methode die Vorhersagegenauigkeit in der frühen Entdeckungsforschung und verringert mechanistische Unklarheiten in der Forschung zur Wirkstoffabgabe.
Strategische Anwendungen in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die Überprüfung therapeutischer Hypothesen durch gezielte funktionelle Modifikation lösungsmittelzugänglicher Disulfidbrücken an VLPs.
- Operationaler Wert: Kombiniert Ligandenankopplung und Fluorophorerzeugung in einer Reaktion und vereinfacht so die Sonden-Synthese für Untersuchungen zur Zielstrukturnbindung.
- Predictive Value: Erzeugt verfolgbare fluoreszierende VLPs, die Zellaufnahmetests und die Modellierung der Biodistribution unterstützen.
Screening und Assay-Entwicklung
- Wissenschaftlicher Wert: Erzeugt standardisierte, fluoreszenzmarkierte VLP-Batches, die für High-Content-Screenings und Bindungsassays geeignet sind.
- Operativer Wert: Nutzt kommerziell erhältliche Filtersätze (Anregung ~400 nm, Emission 540–550 nm) für eine einfache Detektion ohne spezielle Messgeräte.
- Skalierbarkeit: Ermöglicht die Herstellung von Sondenbibliotheken für Struktur-Wirkungs-Beziehungsstudien bei Ligand-Rezeptor-Wechselwirkungen.
Translationale und präklinische Forschung
- Translationaler Zusammenhang: Fluoreszierende VLPs zeigen einen zellulären Aufnahmevorgang in Makrophagenmodellen, was die Biodistribution und die Profilierung der Pharmakokinetik unterstützt.
- Risikominimierung: Ermöglicht die Bewertung von Oberflächenmodifikationen hinsichtlich der Stabilität von VLPs und deren immunologischer Erkennung vor In-vivo-Studien.
- Biomarker-Korrelation: Erleichtert die Korrelation der VLP-Lokalisation mit zellulären Markern in Arbeitsabläufen der Koinzidenz-Bildgebung.
Pipeline- und Workflow-Integration
Die Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der VLP-Produktion bis zur Identifizierung von Leitverbindungen ein und ermöglicht die schnelle Erzeugung funktionalisierter Sonden für nachgeschaltete Screening-Verfahren und mechanistische Untersuchungen.
- Entdeckungsbiochemie: Unterstützt die Hypothesenprüfung, indem sie die doppelte Modifizierung von VLPs mit Nachweis- und therapeutischen Gruppen ermöglicht.
- Screening: Erzeugt standardisierte fluoreszierende VLPs für quantitative Bindungs- und Internalisierungsassays.
- Analytik: Bietet fluoreszenzbasierte Messgrößen zur Quantifizierung von VLP-Zell-Wechselwirkungen und Konjugationseffizienz.
- Translationale Forschung: Knüpft an präklinische Arbeiten an, indem sie den Makrophagen-Uptake und die Stabilitätsbewertung nachweist.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Schafft eine modulare Plattform für die Funktionalisierung von VLPs, die auf verschiedene Systeme mit Disulfidbindungen übertragbar ist.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Erhöht das Vertrauen in die Zielvalidierung, indem präzise, nachverfolgbare VLP-Sonden für Wirkmechanismus-Studien ermöglicht werden.
- Operativer Wert: Standardisiert die Konjugation unter definierten sauren Bedingungen (pH 5), um die Reproduzierbarkeit zwischen Chargen sicherzustellen.
- Strategischer Wert: Verringert den Bedarf an separaten Markierungs- und Reinigungsschritten und verbessert so die Kapitalnutzung bei der Sondenentwicklung.
- Portfolio-Wirkung: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem frühe funktionelle Daten zu VLP-basierten Konstrukten bereitgestellt werden.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse in der Proteinausprägung, -reinigung und anaeroben Handhabung von Proteinen mit Disulfidbindungen.
- Benötigt Zugang zu Mikrofluidisierern, Ultrazentrifugen und Fluoreszenznachweissystemen mit geeigneten Filterkombinationen.
- Setzt aseptische Techniken und Kenntnisse über Endotoxine bei zellulären Anwendungen voraus.
- Kann eine Optimierung erfordern, wenn die Methode auf Virus-ähnliche Partikel (VLPs) mit unterschiedlicher Zugänglichkeit von Disulfidbindungen oder unterschiedlicher Oberflächenladung ausgedehnt wird.
- Praktische Einschränkung: Die Effizienz hängt davon ab, reduzierende Bedingungen während des erneuten Disulfid-Brückenschlusses aufrechtzuerhalten und oxidative Degradation zu vermeiden.
