Calorespirometry: Eine starke, nicht-invasive Ansatz zur zellulären Energiestoffwechsel untersuchen

Das übergeordnete Ziel dieses Verfahrens besteht darin, die metabolische Aktivität einer biologischen Probe zu analysieren und zu bestimmen, inwieweit anaerobe Signalwege zur zellulären Energieproduktion in der Probe beitragen. Diese Methode kann dazu beitragen, zentrale Fragen im pharmazeutischen Bereich über das Ausmaß der mitochondrialen Toxizität während der Arzneimittelentwicklung zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die gleichzeitige Messung des Sauerstoffverbrauchs und der Wärmeerzeugung in einer interessierenden Zellprobe ermöglicht.

So kann diese Methode einen Einblick in die Behandlungsplanung während der pharmazeutischen Entwicklung geben. Es kann auch auf andere Bereiche angewendet werden, wie z. B. die Kyrobiologie, in denen die Auswirkungen der metabolischen Präkonditionierung auf die Kryokonservierung bewertet werden können. Um das Respirometer vorzubereiten, geben Sie zunächst zwei Komma zwei Milliliter DMEM in jede Respirometerkammer und setzen Sie die Stopper vollständig ein.

Stellen Sie die Stopfen mit einem Stopfen-Abstandshalter-Werkzeug ein, um eine optimale Sauerstoffdiffusion zum Medium zu ermöglichen, und stellen Sie die Kammern so ein, dass die Proben kontinuierlich bei 750 U/min bei 37 Grad Celsius gerührt werden, bis die Sauerstoffkonzentration und der Sauerstofffluss stabil sind. Vergewissern Sie sich, dass die Respirometer-Software so programmiert ist, dass sie die Sauerstofflöslichkeit des im Experiment verwendeten Mediums berücksichtigt. Wählen Sie dann einen stabilen Teil der Sauerstoffkonzentrationsspur aus und kalibrieren Sie diesen Teil auf 100 % Luftsättigung.

Schließen Sie nun die Stopfen und achten Sie darauf, dass sich keine Blasen in den Kammern befinden. Nach ca. 10 Minuten sollte ein stabiler Sauerstofffluss beobachtet werden. Um sich auf die Kalorimetrie vorzubereiten, geben Sie zuerst zwei Komma fünf Milliliter entionisiertes Wasser in die Referenzampulle und ziehen Sie dann die Kappe fest.

Entfernen Sie mit einer Luftpumpe externe Ablagerungen aus der Ampulle und senken Sie die Ampulle dann langsam auf Position eins im Referenzkanal des Kalorimeters ab. Die Ampulle verbleibt an Position eins, bis die Ampulle mit der Zellprobe vorbereitet wurde. DMEM, das für die Kalorimetrie verwendet wird, sollte in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator mit einer befeuchteten Atmosphäre und 5 % CO2 äquilibriert werden.

Beginnen Sie das Experiment, indem Sie für jede zu verwendende kalorimetrische Ampulle drei Milliliter DMEM auf eine 100-Milliliter-Platte geben und die Platte in den Inkubator legen, bis die Probe für die Kalorimetrie bereit ist. Während sich das Medium im Gleichgewicht befindet, verwenden Sie ein inverses Mikroskop, um eine Platte mit HepG2-Zellen auszuwählen, die zwischen 60 und 80 % konfluent und homogen verteilt sind. Entfernen Sie zunächst das Zellkulturmedium und waschen Sie die Zellen zweimal mit 10 Millilitern PBS.

Fügen Sie drei Milliliter vorgewärmtes Trypsin bei 37 Grad Celsius hinzu und inkubieren Sie die Platte bei 37 Grad Celsius. Nach sieben bis 10 Minuten Inkubation neutralisieren Sie die enzymatische Reaktion mit den drei Millilitern 37 Grad Celsius heißem DMEM und dissoziieren die Zellen mit einer Fünf-Milliliter-Pipette vorsichtig in eine Einzelzellsuspension. Übertragen Sie die Zellen zur Zentrifugation in ein steriles konisches 15-Milliliter-Röhrchen und suspendieren Sie die Palette in etwa fünf Millilitern frischem DMEM.

Pipettieren Sie die Zellen gründlich, um alle Zellcluster zu disaggregieren, und konzentrieren Sie die Zellen nach der Zählung auf etwa zwei Millionen Zellen pro 50 Mikroliter Medium. Die Reproduzierbarkeit dieser Methode hängt von konsistenten und genauen Zellzählungen ab. Es ist wichtig sicherzustellen, dass die Probe homogen ist und dass die Zellen zu keinem Zeitpunkt während der Analyse verklumpen.

Lagern Sie die Zellen dann auf Eis, bis sie für die Durchführung respirometrischer und kalorimetrischer Messungen bereit sind. Vergewissern Sie sich vor der kalorimetrischen Messung, dass das Kalorimeter an den Computer angeschlossen ist und dass das kalorimetrische Signal stabil und in Mikrowatt ist. Verdünnen Sie die Zellen auf 100.000 Zellen pro Milliliter in dem äquilibrierten Medium, das vor der Probenvorbereitung in den Inkubator gegeben wurde.

Geben Sie dann zwei Komma fünf Milliliter Zelllösung in jede Ampulle und bestätigen Sie, dass zwischen den Deckeln der Ampullen und dem Medium ein ausreichendes Luftvolumen aufrechterhalten wird, um eine Gasdiffusion zu ermöglichen. Ziehen Sie sofort die Verschlüsse fest und reinigen Sie die versiegelten Ampullen mit Luft, um äußere Rückstände zu entfernen. Senken Sie dann die verschlossene Ampulle mit der Zellprobe langsam ab, um eines der Kalorimeter zu positionieren.

Mischen Sie die Probe gründlich, um eine homogene Lösung zu erhalten, und injizieren Sie zwei Millionen Zellen unter ständigem Rühren in jede geschlossene Kammer des Respirometers. Nach 15 Minuten an Position eins im Kalorimeter senken Sie sowohl die Referenzampulle als auch die Ampulle mit den Zellen langsam auf Position zwei ab und notieren Sie den Zeitpunkt der Absenkung. 10 bis 15 Minuten nachdem die Zellen in das Respirometer injiziert wurden, sollte eine Stabilisierung des Sauerstoffflusses und eine stetige Abnahme der Sauerstoffkonzentration beobachtet werden.

Um die Leckatmung zu bestimmen, injizieren Sie einen Mikroliter von vier Milligramm pro Milliliter Oligomycin in jede Kammer und lassen Sie den Sauerstofffluss etwa 10 Minuten lang stabilisieren, wobei Sie die stabile Leckatmungsrate aufzeichnen, wie gerade gezeigt. Um dann den maximalen Fluss zu bestimmen, injizieren Sie zwei Mikroliter FCCP mit null Komma und zwei Millimolaren in die Kammer, damit sich der Sauerstofffluss nach jeder Injektion stabilisieren kann, und setzen Sie die Titrationen fort, bis der maximale Fluss erreicht ist. Zeichnen Sie die stabile Atemfrequenz während des maximalen Flusses auf.

Wenn die Respirometerkammer vor der Probenmessung in Betrieb ist, sollten sowohl die Sauerstoffkonzentration als auch die Sauerstoffflussspuren stabil sein. Nachdem die Ampulle auf Position zwei abgesenkt wurde, kann ein Zeitraum identifiziert werden, in dem die Wärmeabgabe stabil ist, und ein entsprechender Zeitpunkt, in dem der Sauerstofffluss stabil ist, um die Berechnung des kalorespirometrischen Verhältnisses zu ermöglichen. Wenn die HepG2-Zellen in Abwesenheit von Glukose kultiviert werden und Galaktose supplementiert wird, um die mitochondriale Beteiligung zu erhöhen, vermehren sich die Zellen nicht im Kalorimeter, sondern verringern ihre Stoffwechselaktivität nach etwa 30 Minuten in der Ampulle, wodurch die kalorespirometrische Berechnung auf den frühesten Zeitpunkt beschränkt wird, zu dem die Wärmeabgabe gemessen wurde.

Es ist wichtig, die Zeit zu erfassen, zu der die Zellen in die Ampulle pipettiert werden, damit die Messungen der Wärmeproduktion und des Sauerstoffverbrauchs zu identischen Zeitpunkten erfasst werden, da es etwa 15 Minuten dauert, bis sich der Sauerstofffluss stabilisiert und die Sauerstoffkonzentration stetig abnimmt. Da der stabilisierte Sauerstofffluss der Zellen als Surrogat für den Sauerstoffverbrauch bei der Berechnung des kalorespirometrischen Verhältnisses dient, können zusätzliche Titrationen durchgeführt werden, um die Leckatmung zu beurteilen, was durch einen Abfall des Sauerstoffflusses und die maximale ungekoppelte Atmung angezeigt wird, was durch ein Versagen der Erhöhung der Atmung durch aufeinanderfolgende FCCP-Titrationen angezeigt wird. Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als vier Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, sich daran zu erinnern, dass andere Zelllinien andere metabolische Eigenschaften haben können. Daher muss jede neue Zelllinie sowohl für ihre kalorimetrischen als auch für ihre respirometrischen Messungen optimiert werden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie HepG2-Zellen für die Kalorespirometrie vorbereiten, um eine korrekte instrumentelle Kalibrierung sicherzustellen und ein kalorespirometrisches Experiment ordnungsgemäß durchzuführen.