Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Glykoproteine zu beantworten. Wir geben Einblicke in die Funktion des Proteins, die Rolle von N-verknüpften Glykanen sowie den Mechanismus und die Wirkung von Antibiotika, die auf das Glykoprotein abzielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf jedes Glykoprotein von Interesse angewendet werden kann.

Erleichterung der strukturellen und biophysikalischen Charakterisierung einer Vielzahl von Glykoproteinzielen. Dieses Verfahren wird von Hong Cui, einem Koordinator eines Forschungsprojekts in unserem Labor, demonstriert. Bereiten Sie zunächst die Zellen vor und transfizieren Sie sie, wie im Textprotokoll beschrieben.

Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.371 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Halten Sie den Überstand zurück und verwenden Sie dann einen 0,22-Mikron-Filter, um ihn zu filtern. Laden Sie den gefilterten Überstand mit vier Millilitern pro Minute auf eine Ni-NTA-Säule in einem Tischchromatographiesystem.

Waschen Sie danach die Säule mit drei bis vier Volumina Waschpuffer. Verdünnen Sie das gereinigte Glykoprotein aus der Säule mit einem Elutionspuffergradienten, während Sie Fraktionen sammeln. Die Fraktionen, die den umgangenen Peak enthalten, werden in eine Zentrifugalfiltrationsvorrichtung mit einem nominalen Molekulargewicht von 10 Kilodalton gezogen.

Zentrifugieren Sie dann 15 Minuten lang bei 4.000 G und vier Grad Celsius oder bis die Probe ein Volumen von 500 Mikrolitern erreicht. Injizieren Sie das konzentrierte Glykoprotein in eine 500-Mikroliter-Probenschleife. Laden Sie das Glykoprotein bei vier Grad Celsius auf eine voräquilibrierte Hochleistungs-Größenausschlusssäule auf einem FPLC-System, während Sie Fraktionen sammeln.

Führen Sie anschließend ein SDS-PAGE-Gel durch, um zu identifizieren, welche entgangenen Fraktionen das Glykoprotein enthalten, und ziehen Sie diejenigen, die dies tun. Unter Verwendung einer Zentrifugalfiltrationsvorrichtung mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 10 Kilodalton wird reines deglykosyliertes ECD bei 4.000 mal G und vier Grad Celsius konzentriert, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius, um Staub und andere Verunreinigungen zu entfernen.

Geben Sie als Nächstes 80 Mikroliter Kristallisationslösung aus einem kommerziellen Kristallisationssieb in jede Reservoirvertiefung in einer 96 Bohrlöcher fassenden Tropfkristallisationsplatte. Verwenden Sie einen Kristallisationsroboter, um Proteintropfen in die Vertiefungen der Kristallisationsplatte zu dosieren. Unter Verwendung eines Gesamttropfenvolumens von 200 Nanolitern bei einem Verhältnis von gereinigtem Protein zu Kristallisationslösung von eins zu eins.

Verschließen Sie danach die Platte mit Klebeband. Übertragen Sie die versiegelte Platte in einen Platten-Imager zur Inspektion durch sichtbares und ultraviolettes Licht. Identifizieren Sie die Bedingungen, die anfängliche Glykoprotein-Kristallköpfe ergeben, und optimieren Sie diese Kristalle weiter, wie im Textprotokoll beschrieben.

Kryoschützen Sie die Kristalle, indem Sie sie in einer Lösung aus Mutterlauge einweichen, die mit 20% Glycerin versetzt ist. Montieren Sie dann die Kristalle in CryoLoops. Mit flüssigem Stickstoff die montierten Kristalle vor der Datenerfassung schockfrosten.

Nach der Herstellung von gut beugenden Kristallen in einer 24-Well-Kristallisationsplatte wird eine Stammlösung aus 50 millimolaren Liganden und 20 millimolaren Tris bei einem pH-Wert von 9,0 mit 150 millimolarem Natriumchlorid hergestellt. Geben Sie verschiedene Konzentrationen dieser Ligandenlösung zu dem zuvor vorbereiteten Tropfen, der die ECD-Kristalle enthält. Versiegeln Sie den Tropfen für eine Inkubationszeit zwischen fünf Minuten und fünf Tagen.

Verfolgen Sie die Kristalle mit einem Lichtmikroskop visuell, um mögliche Veränderungen in der Morphologie zu identifizieren. Nach der Inkubation montieren Sie die Kristalle mit CryoLoops und kryoschützen Sie sie in Mutterlaugelösung, die mit 20 % Glycerin versetzt ist. Um mit der Bioschicht-Interferometrie zu beginnen, bereiten Sie 50 Millimeter 1X Kinetics Buffer aus 10X Kinetics Buffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben.

Geben Sie 200 Mikroliter dieses Puffers in eine Vorbenetzungsplatte. Übertragen Sie sechs Ni-NTA-Biosensoren auf die Platte und lassen Sie sie 10 Minuten lang im Puffer hydratisieren. Als nächstes verdünnen Sie His-markiertes ECD in einem Milliliter 1X Kinetics Buffer bei einer Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Mikroliter.

Und bereiten Sie serielle Verdünnungen des gereinigten FAB vor. Aquatisieren Sie nun die Reagenzien in einer 96-Well-Mikroplatte, wie hier zu sehen. Dabei steht B für den 1X-Kinetikpuffer, L für die His-markierte Glykoproteinbeladung, die numerischen Einträge für die verdünnten FAB-Konzentrationen und R für den Regenerationspuffer.

Übertragen Sie die hydratisierten Biosensoren für 60 Sekunden in Vertiefungen mit 1X Kinetics Buffer, um sie als Ausgangswert zu verwenden. Laden Sie dann das Glykoprotein in einer Konzentration von 25 Nanogramm pro Mikroliter für 240 Sekunden bei 1.000 U/min. Setzen Sie die Biosensoren wieder für 60 Sekunden in die Vertiefungen mit 1x Kinetics Buffer ein, um eine zweite Baseline zu erhalten.

Übertragen Sie die Sensoren für 180 Sekunden in die Vertiefungen, die die seriellen Verdünnungen von FAB enthalten. Nach dieser Assoziationsphase übertragen Sie die Biosensoren für einen 180-sekündigen Dissoziationsschritt zurück in den 1X Kinetics Buffer. Öffnen Sie anschließend die Analysesoftware.

Importieren Sie auf der ersten Registerkarte die Daten, und wählen Sie sie dann aus. Wählen Sie unter Registerkarte zwei, Schritt eins Datenauswahl, Sensorauswahl aus. Markieren Sie die Referenz-Wells, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um die Referenz-Wells festzulegen.

Wählen Sie im zweiten Schritt, Subtraktion, Referenzwells aus. Wählen Sie anschließend unter Schritt drei Y-Achse ausrichten die Option Basislinie aus, und legen Sie einen Zeitbereich zwischen 0,1 Sekunden und 59,8 Sekunden fest. Wählen Sie im vierten Schritt die Inter-Step-Korrektur und die Ausrichtung auf Dissoziation aus.

Verarbeiten Sie dann in Schritt fünf die Savitzky-Golay-Filterung und klicken Sie auf Daten verarbeiten. Das Tor zur dritten Registerkarte. Im zweiten Schritt analysieren Sie mit einem Eins-zu-Eins-Modell, wählen Sie Assoziation und Dissoziation aus, wählen Sie globale Anpassung und Gruppieren nach Farbe aus.

Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Kurven, klicken Sie auf Farbe festlegen und stellen Sie alle Kurven auf die gewünschten Farben ein. Wählen Sie anschließend Kurven einpassen. Wenn die Daten gut angepasst sind, exportieren Sie das Ergebnis, indem Sie auf Bericht speichern klicken.

Wiederholen Sie den Versuch für alle gewünschten Bedingungen. In dieser Arbeit wurden mehrere Konstrukte der extrazellulären CD22-Domäne erfolgreich in den pHL-sec-Expressionsvektor kloniert. Diese Konstrukte werden dann in den Säugetierzelllinien HEK293-F und HEK293-S überexprimiert.

Während die Kulturen, die etwa eine Million und eineinhalb Millionen Zellen pro Milliliter enthielten, sehr ähnliche Konzentrationen von Glykoproteinen exprimierten. Kulturen von nur einer halben Million Zellen pro Milliliter exprimierten deutlich weniger. Danach werden die Kulturen geerntet und das ECD-Glykoprotein durch Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie isoliert, um alle Konstrukte auf Größenhomogenität zu reinigen.

So entsteht eine hochreine Probe für die Kristallisation und biophysikalische Studien. Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Methoden wie die Elektronenmikroskopie einzelner Teilchen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur dreidimensionalen Struktur der extrazellulären Domäne in voller Länge oder von Proteinkomplexen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Glykoproteine, ihre Liganden und Targeting-Antikörper exprimiert, gereinigt und strukturell und biophysikalisch charakterisiert werden.