Name: Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 58 s
Description: Erfahren Sie die Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalische Techniken wie Biolayer-Interferometrie. Diese Methoden ermöglichen strukturelle und thermodynamische Analysen für die Arzneimittelentwicklung.

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Röntgenbeugung Experimente, die in diesem Dokument beschriebenen wurden durchgeführt mit Strahllinien 08-ID und 08-BM am Canadian Light Source, die für Innovation, Naturwissenschaften und Engineering Research Council of Canada Kanada-Stiftung unterstützt wird, die Universität von Saskatchewan, die Regierung von Saskatchewan, westliche ökonomische Diversifikation Kanada, des National Research Council Canada und der Canadian Institute der Gesundheitsforschung. Wir möchten die Struktur- & biophysikalische Core Facility, The Hospital für kranke Kinder, für den Zugriff auf die ITC und BLI Instrumente erkennen. J.E.O. wurde von Banting Postdoctoral Fellowship BPF-144483 von Canadian Institutes of Health Research unterstützt. T.S ist ein Empfänger von Kanada Graduate Stipendium Master Award und einem Vanier Canada Graduate Stipendium Canadian Institutes of Health Research. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschuss PJT-148811 (J.-p.j.) von der Canadian Institutes of Health Research in Betrieb. Diese Forschung wurde unter anderem dank der Mittel aus dem Programm Kanada Forschung Stühle (J.-p.j.)durchgeführt.

Die Autoren erklären keinen Interessenkonflikt.

Membran verankerte Glykoproteine sind entscheidend für die Funktion der Zellen und sind attraktive therapeutische Ziele. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die strukturelle und biophysikalischen Charakterisierung des ECD Membran Glykoproteine, sowohl allein als auch in komplexen mit niedermolekularen Liganden und Fab-Fragmente. Wir haben erfolgreich dieses Protokoll verwendet, um festzustellen, die Kristallstruktur der drei N-Terminal-die meisten Ig Domänen der extrazellulären Teil des menschlichen CD2228, eine kritische ko-Rezeptor auf B-Zellen, die humorale Immunität Check79zu halten. Wir haben auch die Bindungsstelle des CD22 mit seiner natürlichen Liganden α2-6 Sialyllactose geprägt und definiert die Art der Anerkennung eines therapeutischen Antikörpers gegen menschliche CD22. Diese Ergebnisse geben Einblicke in die Struktur-Funktions-Beziehung der ein wichtiges Mitglied der Siglecs Familie, die Ausdruck auf B-Zellen und eine molekulare Roadmap für die Entwicklung von neuen CD22 gezielte niedermolekularer und Antikörper-basierten beschränkt hat Therapeutika. Während dieses Protokoll für ein Ig-haltigen B-Zell-Rezeptor erfolgreich eingesetzt wurde, schlagen wir vor, dass unser Ansatz für die strukturelle und biophysikalischen Charakterisierung von jede Membran Glykoprotein mit einer unterschiedlichen Domäne Organisation angewendet werden kann. In einem solchen Fall zu konstruieren Design und kombinatorische Glycan N verbunden, die Mutationen (entweder auf Gln oder Ala) ausgewertet werden können, um ein Konstrukt für Kristallzüchtung und hochauflösende Beugung zu finden.
Eine homogene und reine Glykoprotein-Probe ist von entscheidender Bedeutung für Kristallzüchtung und x-ray Diffraction sowie für nachgeschaltete biophysikalische Charakterisierung. N-linked Glykane auf Glykoproteine sind von Natur aus heterogen und kann Konformationsänderungen und chemischen Heterogenität innerhalb der Glykoprotein, das Kristallbildung abhalten kann. Um diese Mikro-Heterogenität zu reduzieren, können Strategien, die Punktmutationen entfernen Asn Rückstände Glykane N verbunden oder mit mutierten Zelllinien (z. B. HEK293S), gefolgt von der Behandlung mit Endoglycosidases (z. B. EndoH) Hafen voraussichtlich einführen erheblich Verbesserung der Kristallisation Erfolg15,21,22. In diesem Protokoll besprechen wir die Reinigung des löslichen Glykoproteine und Fabriken, die in die Zelle überstand abgesondert werden. Glykoprotein Absonderung bietet einen relativ einfachen Weg zur Reinheit, ohne die Notwendigkeit einer Zelle Lyse oder die Zugabe von Chemikalien oder Reinigungsmitteln. Die Zelle überstand, erhalten folgende Zelle Ernte läuft dann direkt über eine Spalte, die Affinität für das Protein des Interesses (z. B. Ni-NTA für sein-tagged Glykoproteine oder LC Affinität für Fab-Fragmente) hat. Jedoch kann abhängig von der Spalte und die Bedingungen der Zelle überstand (z. B. pH-Wert), die verbindliche Fähigkeit des Proteins des Interesses auf die Spalte beeinträchtigt werden. Wenn dies der Fall ist, ist es möglicherweise erforderlich, zu konzentrieren und Austausch der Zelle überstand zur Verbesserung der Bindung an die Spalte zu puffern. Darüber hinaus ist es dringend empfohlen, Qualitätskontrolle Schritte während der Reinigung eingesetzt werden, um Protein Reinheit zu beurteilen. Ausführung einer SDS-PAGE Gel oder Western-Blot aller Proben (vor, während und nach Reinigungsschritte) kann Ausbeute Einblicke, ob die vorgeschlagenen Reinigung-Schema für das Protein des Interesses geeignet ist. Wenn kontaminierenden Bands auf SDS-PAGE zu sehen sind, oder wenn mehrere Arten während der Reinigung erzielt werden (z. B. mehrere Peaks auf Größe Ausschluss), zusätzliche Reinigungsschritte sollte berücksichtigt werden, z. B. Ionenaustausch-Chromatographie, um zu gewinnen in Reinheit und Erhöhung der Chancen der nachgeschalteten Kristallisation80.
Für Makromolekulare Kristallisation ist es oft wichtig, des Proteins des Interesses zuzulassen für das Screening von eine große Anzahl von möglichen Kristallisation Bedingungen bei hoher proteinkonzentrationen geeignet Kristall Treffer finden hohe Erträge zu erzielen. In der Regel die HEK293 Zelllinien hier diskutiert (HEK293F und HEK293S) sind robuste Expressionssysteme, und können leicht ausgeweitet werden, um mehr von der Probe nach Bedarf zu produzieren. Es ist jedoch möglich, dass das Protein des Interesses innerhalb dieser Zelllinien nicht ausreichend Ausdrücken kann. In diesen Fällen andere Zelllinien, wie Expi293 Zellen81,82, übergeordneten Ebenen der Proteinexpression zeigen gefunden worden und sollte als Alternative in Betracht.
Wenn wohlgeordneten, interferenzgitters Kristalle nicht nach Prüfung der mehrere Konstrukte des Proteins des Interesses trotz hoher Reinheit erhalten werden, es möglicherweise notwendig, Kristallisation Techniken zur Förderung der Kristallbildung zu erweitern. Es hat sich gezeigt, dass Fab-Fragmente von Antikörpern und Nanobodies ausgezeichnete Kristallisation Enhancer werden und wohlgeordneten Kristall Verpackung83,84,85fördern können. Diese Fragmente können zum Ausdruck und zur Homogenität gereinigt und in einem Komplex mit dem Protein des Interesses zur Kristallisation zu fördern. Wichtig ist, können Fab-Fragmente produziert wie in Abschnitt 10 beschrieben haben eine Tendenz zu nicht-funktionale LC Dimere86bilden. Diese Dimere sind Verunreinigungen und sollte bei der Reinigung entfernt werden. Nach unserer Erfahrung LC Dimere oft haben eine unterschiedliche Retentionsvolumen Größe Ausschluss, oder als eine unterschiedliche Spitze auf Ionenaustausch-Chromatographie eluieren, und so können aus der Fab Reinigung - entfernt werden, dies ist jedoch nicht immer der Fall. Wenn diese Techniken nicht ausreicht, um LC Dimere aus der Fab Reinigung zu entfernen sind, können zusätzliche Reinigungsverfahren wie Eiweiß G Affinitätsreinigung, eingesetzt werden, um Reinheit zu verbessern.
Alternative zu co-Komplexierung mit Fab-Fragmente, können gut dokumentierte Techniken wie zufällige Matrix Microseeding Chancen auf geordnete Kristalle63,70verbessern. Bei dieser Methode wird der Zusatz von geringen Mengen von zerkleinerten, suboptimale Kristalle in der Kristallisation Zustand, Bereitstellung eines Kristalls blasensiedens Kristallwachstum zu fördern. Dies kann mit Kristallen des Proteins des Interesses oder mit ähnlichen Domain-Architektur und tertiäre Struktur durchgeführt werden. Darüber hinaus kann zufällige Matrix Microseeding versucht, das Protein allein kristallisieren oder im Komplex mit einem Fab-Fragment oder kleine Molekül des Interesses durchgeführt werden. Jüngste Fortschritte in der Kryo-Elektronenmikroskopie machen diese Technik auch eine attraktive Alternative zum Röntgen-Kristallographie für hochauflösende strukturelle Informationsbeschaffung für Moleküle mit entsprechenden Features87,88, 89,90,91.
Beim Ausstieg der Röntgenbeugung Datasets von Herrn fehlschlägt, kann HA Einweichen zur Lösung des Problems der Phase von anomalen Dispersion oder isomorphous Ersatz benötigt werden. Inspektion der Aminosäure-Sequenz des Proteins liefern Hinweise auf die Strategie für HA Derivatisierung, einschließlich der optimale pH-Wert für die Bindung. Insbesondere können ungepaarte Cysteine innerhalb des Proteins speziell HA Verbindungen binden, die Quecksilber enthalten. Einweichen native Kristalle mit HA-Verbindungen ist ein iterativer Prozess, die Identität der optimale HA Verbindung, seine Konzentration und die erforderlichen Inkubationszeit zu bestimmen. Wenn erste Einweichen Versuche gut diffracting Kristalle, enthält eine HA für den Ausstieg nicht nachgeben, ist es möglicherweise erforderlich, Aminosäure Auswechslungen um die Wahrscheinlichkeit der HA Bindung verbessern und anomale Signal einführen. Beispiele dafür sind Mutationen zu umfassen einen kostenlosen Cystein Rückstand um effizient Hg, Au, Pt oder Pb. Expression von Proteinen binden für anomale phasing-in einem Seleno-Methionin ergänzt Medien in E. Coli anomale Phasing, ausgiebig genutzt wird jedoch eine gleichwertiges System, das zuverlässig Seleno-Methionin enthält ist nicht verfügbar für Säugetier-Zellen in Suspension92,93, und ist ein Bereich der zukünftigen Entwicklung.
Sobald die Unliganded Struktur der das Glykoprotein Interesse vorliegt, kann die Kristalle mit niedermolekularen Liganden Einweichen durchgeführt werden, um eine Struktur der immun-Rezeptor-Ligand-Komplex erhalten. Diese Daten liefern eine Blaupause für die rationale Gestaltung spezifischer und hoher Affinität Liganden, die eignet sich als kleine Molekül Therapeutika sowie hochauflösende Einblicke in die biologische Funktion von das Glykoprotein. Beim Versuch, Glykoprotein Kristalle mit niedermolekularen Liganden von Interesse zu genießen, kann Inspektion der Kristallstruktur Unliganded angeben, ob Einweichen sollte möglich sein. Wenn nahe Kristall-Verpackung Kontakte befinden sich rund um die Liganden-Bindungsstelle oder ganzen Regionen voraussichtlich Konformationsänderungen auf Liganden verbindlich zu unterziehen, einweichen dürfte problematisch sein. In diesem Fall sollten andere Methoden wie Co Kristallisation von der Protein-Ligand-komplex durchgeführt werden.

Oberflächenproteine spielen wichtige Rollen in zelluläre Funktion. Durch ihren extrazellulären Domänen können diese Membranproteine Zell-Zell-Interaktionen, Adhäsion, Transport und1,2Signalisierung modulieren. Die extrazelluläre Lokalisation dieser Proteine macht sie attraktive Ziele für die Entwicklung von Therapeutika zur Behandlung einer Vielzahl von Krankheiten, einschließlich Krebs und Autoimmunerkrankungen3,4,5 , 6 , 7. einer der häufigsten Falten der menschlichen Membrane Protein Ectodomains ist die Immunglobulin-ähnlichen (Ig) Falte, die von sieben oder mehr β-Stränge in zwei β-Blätter8,9angeordnet gebildet wird. In der Regel sind Ig-haltigen Glykoproteine Multidomain-Strukturen mit Ig Domains nacheinander auf den extrazellulären Teil der Membrane Protein10angeordnet. Post-translationalen Modifikationen dieser Zelle Oberfläche Proteine, besonders N und O verbunden Glykosylierung, wurden wesentliche Rollen in ihrer Regulation, Falten, Sekretion und Funktion11spielen gezeigt. Um zu einem besseren Verständnis ihrer Funktion und bessere Design-Therapeutika, die ihnen zugeordnet werden kann, Techniken erforderlich sind, mit denen für ihre genaue molekulare Charakterisierung. Hier präsentieren wir eine Kombination von Techniken, mit denen für die biophysikalischen (Biolayer Interferometrie (BLI) und Isotherme Titration Kalorimetrie (ITC)) und strukturelle (Röntgen-Kristallographie) Charakterisierung der extrazellulären Domäne des Ig-haltigen Membran Glykoproteine, allein und in Anlage mit ihrer biologisch relevante Liganden und therapeutische Moleküle (Abbildung 1).
N-linked Glykosylierung ist eines der am häufigsten verwendeten Post-Übersetzungen Änderungen auf Säugetier-Proteine und tritt während Protein Reifung im endoplasmatischen Retikulum und Golgi12,13. Zell-Linien, wie menschliche embryonale (HEK) 293 Nierenzellen, wurden für die rekombinante Expression von großen Mengen des glykosylierten Säugetier-Proteine14,15entwickelt. Diese Zelllinie wurde in einem Fahrwerk-Format entwickelt, die für die Leichtigkeit des Protein-Produktion in größeren Mengen im Vergleich zu adhärenten Zelllinien Skalierung ermöglicht. Hier nutzen wir zwei HEK293-Zell-Linien: HEK293F und HEK293 Gnt ich- / - (HEK293S), die durch das Fehlen von N-Acetylglucosaminyl-Transferase unterscheide ich mich (Gnt ich) in der letzteren. Wiederum, Herstellung von komplexen Glykoproteinen (wie gesehen in HEK293F) ist nicht möglich und stattdessen hohe Mannose-Typ Glykoproteinen (überwiegend Mann5GlcNAc2) befinden sich in N-linked Glycan Seiten18,19,20 . Mit diesen beiden Zelllinien parallel ermöglicht die Untersuchung der Wirkung von Glycan Größe und Komplexität auf biologische Funktion und therapeutischen Zielen. Glykoproteine in HEK293F Zellen produziert haben sogar größere, komplexere Glykane im Vergleich zu den gleichen Glykoprotein in HEK293S Zellen produziert. Glykoproteine in HEK293S Zellen produziert sind zugänglicher, Kristallisation, wegen der reduzierten chemischen und Konformationsänderungen Heterogenität der ihre N-Verbindung handelt. Zur weiteren Verbesserung der Crystallizability in HEK293S (aber nicht HEK293F) Zellen produzierten Glykoproteine mit Enzym Endoglycosidase H (Endo H), die solche in der Spaltung der hohen Mannose Glykane Ergebnisse behandelt werden können, dass nur eine einzelne N-Acetylglucosamin (GlcNAc) Abstimmungsunterlagen bleibt bei jeder N-linked Glykosylierung Seite21,22. Andere Methoden können auch verwendet werden, um N-Glycan Verarbeitung innerhalb der Zellen, wie die Zugabe von Glycosyltransferase Inhibitoren während Glykoprotein Ausdruck, einschließlich Kifunensine23zu begrenzen. Alternative Ansätze beinhalten den Ausdruck von native Glykoproteinen (in HEK293F Zellen) gefolgt von enzymatischen Deglycosylation Peptid N-Glucosidase F (PNGaseF) verwenden. Deglycosylation mit PNGaseF ist jedoch nachweislich weniger wirksam unter heimischen Bedingungen und erhöht Aggregation in einigen Proteinen; in Fällen wenn das Protein lösliche nach der Behandlung bleibt erwirbt es negative Ladungen an der Oberfläche aufgrund der deamidierung des Rückstands Asparagin, Asparaginsäure24, die möglicherweise nachteilig für die Kristallisation. Vorhergesagten N-Glykosylierung Websites können auch mutiert, in den meisten Fällen zu Alanin und Glutamin Rückstände, N-linked Glycosylation an diesen Standorten zu verhindern und Glykoprotein Proben von hohe Homogenität zu generieren. Alternativ können Glykoproteine in anderen eukaryontischen Zellkulturen, einschließlich Hefe, Insekt, und Anlagensysteme oder anderen Säugetieren Zelllinien wie chinesische Hamster Eierstock (CHO) Zellen16,17hergestellt werden.
Viele Säugetiere Expressionsvektoren, einschließlich pHLsec, ermöglichen die Sekretion von rekombinantes Glykoprotein Ectodomains in die Zelle mittlere25. Sekretion von Glykoproteinen aus HEK293 Zellen ermöglicht eine schnelle und einfache Reinigung ohne die Notwendigkeit einer Zelle Lysis. Neben der Reinigung Tags (z.B. His-Tag, Strep-Tag, Flag-Tag, Myc-Tag, HA-Tag) an den N oder C-Terminus des Ziels Glykoprotein ermöglicht Reinigung durch einen einstufigen Affinitätschromatographie. Anschließend kann Größe Ausgrenzung Chromatographie verwendet werden, eine Monodisperse Probe für biophysikalische und strukturelle Charakterisierung liefern.
Eine sehr reine und homogene Glykoprotein-Probe unter geeigneten Bedingungen kann gut diffracting Kristalle führen. Sobald eine vollständige Röntgenbeugung Dataset aus solche Kristalle gewonnen worden sind, müssen Anfangsphase bestimmt werden, um die Elektronendichte an das Glykoprotein zu berechnen. Dank einer ständig wachsenden Anzahl von Strukturen in der Protein Data Bank (PDB) ist die am häufigsten verwendete Methode zur schrittweisen bei weitem Molekulare Ersatz (MR), geworden, die eine verwandte Protein-Struktur verwendet, um Anfangsphase26zu erhalten. Wenn Herr nicht zur Lösung des Problems Phase wie gelegentlich bei Multi-Ig Domäne Glykoproteine27,28,29der Fall gewesen ist, sind alternative Methoden jedoch erforderlich. In diesem Artikel zeigen wir eine Methode, um Kristalle mit schweren Atomen (HA) Einweichen auslaufen, die für die Struktur der CD22 ektodomäne28Lösung erforderlich war. Identifiziert das Recht HA für den schrittweisen ist ein iterativer Prozess, der HA Reaktivität zur Verfügung Atome in das Glykoprotein in einem gegebenen Kristallgitter und die Kristallisation Lösung30,31abhängt. Alternativ können natürlichen Schwefel Atome in Cystein und Methionin Rückstände verwendet werden, für den schrittweisen wenn anwesend in einem hoch genug Verhältnis zu anderen Atomen in das Glykoprotein und x-ray Diffraction Daten mit ausreichender Redundanz32gesammelt werden können, 33.
Die biologische Funktion der Membran Glykoproteine wird oft von Protein-Protein-Wechselwirkungen oder Protein-Ligand-Interaktionen, wie z. B. mit Kohlenhydraten vermittelt. Wenn die Liganden klein genug ist, um aus der Lösung an die Glykoprotein-Bindungsstelle im Kristallgitter zu verbreiten, kann das Einweichen Experimente erfolgreich, eine Glykoprotein-Liganden Co Kristallstruktur um besser zu verstehen, Liganden Anerkennung zu erhalten sein.
Die hier vorgestellten Protokolle sind auch relevant für das Verständnis der Wechselwirkungen der Oberfläche Glykoproteine mit synthetischen therapeutische Liganden34,35 und Antikörper Therapeutika36,37. In Kombination mit Strukturinformationen kann verbindliche Kinetik und Thermodynamik werden stark, um zu verstehen und zu verbessern ihre Wirkmechanismen. Eine Technik, die für die kinetische Analyse der therapeutische Antikörper binden an ein Glykoprotein ermöglicht ist BLI38,39. BLI verwendet Biosensoren mit einem immobilisierten Liganden, um die Assoziation und Dissoziation Kinetik mit einen Bindungspartner, bestimmen letztlich ein Gleichgewicht Dissoziationskonstante (KD) zu messen. BLI ist ein attraktiver Ansatz, da geringe Mengen von Glykoproteinen erforderlich sind (< 100 µg), Experiment ist schnell (~ 10-15 min pro Durchlauf), und es kann automatisiert werden. ITC eignet sich auch für das Studium Affinitäten zwischen Glykoproteine und verbindliche Partner40,41,42,43. ITC mehr Zeit und intensive Reagenz ist, erhalten Sie wertvolle Informationen über die Thermodynamik der Interaktion (ΔG, ΔH, ΔS und Stöchiometrie). ITC ist auch sehr nützlich für das Studium der schwachen Wechselwirkung, die oft mit der vorübergehenden Bindung Oberfläche Glykoproteine, Liganden verbunden sind. Darüber hinaus können diese Techniken in Verbindung verwendet werden, um die Bindung von verschiedenen Konstrukte und bewerten die Auswirkungen der verschiedenen N-linked Glycoforms erhalten das Glykoprotein in verschiedenen Zelllinien zu äußern. Durchführung von BLI und ITC mit Glykoproteine produziert in HEK293F, HEK293S und behandelt mit Endo H bieten einen tiefen Einblick in die Rolle von Glykoproteinen in biologische Aktivität und therapeutisches Engagement.
Wir erfolgreich diese Protokolle zur Charakterisierung der extrazellulären Domäne (ECD) des menschlichen CD2228, ein Glykoprotein Mitglied der Sialinsäure Säure bindenden Ig-ähnliche Lektine (Siglecs) Familie, die unerlässlich für die Aufrechterhaltung der Homöostase der B-Zelle44 . Wir eingehende Konstrukt-Konzept für Kristallisation durchgeführt und das Röntgen-Dataset durch Einweichen mit Hg HA abgebaut. Wir auch getränkt CD22 Kristalle mit ihrer Liganden Sialinsäure Säure (α2-6 Sialyllactose), eine Struktur von der immun-Rezeptor-Ligand-Komplex zu erhalten und somit die Baupläne für das Struktur-geführte Design von Glycan Mimetika45,46vorgesehen. Darüber hinaus wir die Fragment Antigen-Bindung (Fab) von Anti-CD22 therapeutische Antikörper Epratuzumab - eine therapeutische Kandidaten derzeit in klinischen Phase-III-Studien für non-Hodgkin Lymphom47- generiert, um seine Bindungsaffinität von BLI bestimmen und ITC, differentiell glykosylierten baut CD22 ECD. Diese Studien zeigten eine entscheidende Rolle für N-linked Glykosylierung Epratuzumab Engagement, mit möglichen Folgen für die CD22 Anerkennung auf dysfunktionale B-Zellen.

<table><tbody><tr><td>0,22 μm m Steritop-Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGPS02RE</td><td></td></tr><tr><td>10 Well 4-15% Gradient SDS-PAGE Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>4561084</td><td></td></tr><tr><td>10x Glykopuffer 3</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td>Kommt mit Endo H Reagenz</td></tr><tr><td>10x Kinetics Buffer</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td></td></tr><tr><td>10x Tris/Glycin/SDS-Puffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610732</td><td></td></tr><tr><td>1 mL 96-Well-Block mit rundem Boden</td><td>ThermoFisher</td><td>260251</td><td></td></tr><tr><td>22 mm Deckglas</td><td>Hampton research</td><td>HR3-231</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Probenpuffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1610747</td><td></td></tr><tr><td>96-3 Well INTELLIPLATE&nbsp; Low-Volume-Reservior</td><td>Art Robbins Instrumente</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>AgeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0552S</td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&Auml; KTA Start&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 15 Zentrifugalfiltrationsgerät 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC901008</td><td></td></tr><tr><td>Amicon Ultra 4 Zentrifugalfiltrationsgerät 10KDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td></td></tr><tr><td>Auto-iTC200</td><td>Malvern</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axygen MaxyClear Snaplock 1,5 mL Mikroröhrchen</td><td>Fisher Scientific</td><td>MCT150C</td><td></td></tr><tr><td>Countess Zellzählkammer</td><td>Objektträger Thermo Fisher Scientific</td><td>C10228</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,05-0,1 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-945</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,1-0,2 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-947</td><td></td></tr><tr><td>CryoLoop 18 x 0,2-0,3 mm</td><td>Hampton research</td><td>HR4-970</td><td></td></tr><tr><td>Digitales Trockenbad</td><td>Bio-Rad</td><td>1660562EDU</td><td></td></tr><tr><td>E. coli DH5&alpha;</td><td>Invitrogen</td><td>18258012</td><td></td></tr><tr><td>Endo H</td><td>New England Biolabs</td><td>P0702S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben (Prallboden), Polycarbonat, steril, 500 mL, DuoCAP</td><td>TriForest Labware</td><td>FBC05000S</td><td></td></tr><tr><td>Erlenmeyerkolben 125 mL (Prallboden), Polycarbonat, steril, 125 mL mit belüfteter Kappe</td><td>VWR</td><td>89095-258</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Sterile serologische Einwegpipette, nicht pyrogen, 10 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>607180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Sterile serologische Einwegpipette, nicht pyrogen, 25 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>760180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Sterile serologische Einwegpipette, nicht pyrogen, 5 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>606180</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Sterile serologische Einwegpipette, nicht pyrogen, 50 mL</td><td>Greiner Bio-One</td><td>768180</td><td></td></tr><tr><td>FectoPRO DNA-Transfektionsreagenz, Polyplus</td><td>VWR</td><td>10118-842</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle 293F Zellen</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R79007</td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Expression Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12338001</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens Au</td><td>Hampton research</td><td>HR2-444</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens</td><td>Hg Hampton research</td><td>HR2-446</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens M1</td><td>Hampton research</td><td>HR2-448</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens M2</td><td>Hampton research</td><td>HR2-450</td><td></td></tr><tr><td>Heavy Atom Screens</td><td>Pt Hampton research</td><td>HR2-442</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293S</td><td>ATCC</td><td>ATCC CRL-3022</td><td></td></tr><tr><td>HisTrap Affinitätssäule</td><td>GE Healthcare</td><td>17525501</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap KappaSelect Affinitätssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17545811</td><td></td></tr><tr><td>HiTrap LambdaSelect Affinitätssäulen</td><td>GE Healthcare</td><td>17548211</td><td></td></tr><tr><td>KpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0142S</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-1 Kristallsieb 1,7 mL</td><td>Block Anatrace</td><td>MCSG-1</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-2 Kristallsieb 1,7 mL</td><td>Block Anatrace</td><td>MCSG-2</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-3 Kristallsieb 1,7 mL Block</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-3</td><td></td></tr><tr><td>MCSG-4 Kristallsieb 1,7 mL Block</td><td>Anatrace</td><td>MCSG-4</td><td></td></tr><tr><td>Quecksilberchlorid</td><td>Sigma</td><td>1044170100</td><td></td></tr><tr><td>Mikrotiterplatte, 96 Well, Polypropylen, flacher Boden, schwarz&nbsp;</td><td>Greiner Bio-One</td><td>655209</td><td></td></tr><tr><td>Minstrel DT UV</td><td>Formulatrix</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Multitron Pro Shaker</td><td>Infors HT</td><td>MP25-TA-CO2HB</td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop 2000/2000c Spektralphotometer</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>ND-2000</td><td></td></tr><tr><td>Nanosep 3K Omega Zentrifugalgerät</td><td>PALL Life Science</td><td>OD003C33</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Biosensoren</td><td>PALL Fort&eacute; Bio</td><td>18-5102</td><td></td></tr><tr><td>Octet RED96</td><td>PALL ForteBio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oryx 4 Kristallisationsroboter</td><td>Douglas Instrument</td><td>ORY-4/1</td><td></td></tr><tr><td>Platinchlorid</td><td>Sigma</td><td>520632-1g</td><td></td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Standard</td><td>Bio-Rad</td><td>161-0374</td><td></td></tr><tr><td>PureLink HiPure Plasmid Maxiprep Kit</td><td>Invitrogen</td><td>K210006</td><td></td></tr><tr><td>Quick Coomassie Stain</td><td>Protein Ark</td><td>GEN-QC-STAIN-1L</td><td></td></tr><tr><td>Steriflip Steril 50 mL Einweg-Vakuumfiltrationssystem 0,22 & Mikro; m Millipore Express</td><td>EMD Millipore</td><td>SCGP00525</td><td></td></tr><tr><td>Superdex 200 Increase 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>28990944</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17517201</td><td></td></tr><tr><td>Tantalbromid Cluster</td><td>Jena bioscience</td><td>PK-103</td><td></td></tr><tr><td>Top96 Kristallisationssieb</td><td>Rigaku Reagenzien</td><td>1009846</td><td></td></tr><tr><td>Tryphan Blue</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>VDX 24-well mit Dichtstoff</td><td>Hampton research</td><td>HR3-172</td><td></td></tr><tr><td>&alpha; 2-6 Sialyllactose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8556-1mg</td><td></td></tr></tbody></table>

charakterisierung von glykoproteinen mit dem immunglobulin-falz durch röntgen-kristallographie und biophysikalischen techniken

Characterization of Glycoproteins with the Immunoglobulin Fold by X-Ray Crystallography and Biophysical Techniques

Glykoproteine auf der Oberfläche der Zellen spielen wichtige Rollen in zelluläre Funktion, einschließlich der Signalisierung, Haftung und Transport. Auf Leukozyten einige der diese Glykoproteine besitzen Immunglobulin (Ig) Falten und zentralen immun Anerkennung und Regulierung. Hier präsentieren wir Ihnen eine Plattform für Design, Ausdruck und biophysikalischen Charakterisierung der extrazellulären Domäne des menschlichen B-Zell-Rezeptors CD22. Wir schlagen vor, dass diese Ansätze bis hin zur Charakterisierung von Säugetieren Glykoprotein Ectodomains Ig Domänen mit breit anwendbar sind. Zwei menschliche embryonale Nieren (HEK) Zelle Fangleinen, HEK293F und HEK293S, werden verwendet, um Glykoproteine mit komplexen und hoch-Mannose Glykoproteinen bzw. zum Ausdruck bringen. Diese rekombinanten Glykoproteine mit verschiedenen Glycoforms ermöglichen Untersuchung der Wirkung von Glycan Größe und Zusammensetzung für Ligand-Bindung. Wir besprechen Sie Protokolle für die Untersuchung der Kinetik und Thermodynamik Glykoprotein Bindung an biologisch relevante Liganden und therapeutische Antikörper Kandidaten. Rekombinanten Glykoproteine produziert in HEK293S Zellen sind Kristallisation durch Glycan Homogenität, geringere Flexibilität und Anfälligkeit für Endoglycosidase H Behandlung zugänglich. Wir präsentieren Ihnen Methoden zum Einweichen Glykoprotein Kristalle mit schweren Atome und kleine Moleküle für Phase-Ermittlung und Analyse der Ligand-Bindung, beziehungsweise. Die experimentelle Protokolle diskutiert versprechen hier zur Charakterisierung von Säugetieren Glykoproteine geben Einblick in ihre Funktion und den Wirkmechanismus von Therapeutika zu untersuchen.

Verschiedene Konstrukte des CD22 ECD waren erfolgreich in der pHLsec Ausdruck Vektor kloniert und überexprimiert in Säugetieren HEK293F und HEK293S Zelllinien (Abbildung 2 und 3A). Alle Konstrukte wurden zur Größe Homogenität durch Größe Ausgrenzung Chromatographie gereinigt und ergab ein hochreines Muster zur Kristallisation Studien (Abb. 3 b und 3 C). Die CD22 Konstrukt, das zu gut diffracting Kristalle geführt war die d1-d3 abschneiden (Rückstände 20-330), mit fünf der sechs vorhergesagten N verbunden Glykosylierung Seiten mutierte vom Asn, Ala (N67A, N112A, N135A, N164A und N231A), in den HEK293S Zellen, so dass nur produziert die Glykosylierung Seite an Position N101 wurde beibehalten (dieses Konstrukt heißt CD2220-330, 5A). Kristalle wurden in mehreren Bedingungen des Bildschirms MCSG-1 dünnbesetzte Matrix erhalten, aber die besten Kristalle wurden von einem Zustand mit 30 % (w/V) Polyethylenglykol 4000, Lithiumchlorid 0,2 M und 0,1 M Tris, pH 8,5. Diese nativen kristalle gebeugt auf 2,1 Å Auflösung; mit bekannten Strukturen der Ig Domänen des zugehörigen Siglec-Proteine Ausbeute nicht keine Lösungen in den Herrn suchen.
Phasenabgleich Informationen erwerben, getränkt wir native Kristalle mit einem Panel von HA-Verbindungen, die Hg, Pt, Os, Ta und Br bei Konzentrationen von 1-20 mM HA Verbindung für eine Inkubationszeit von 5 min bis 1 d (Abbildung 4) enthalten. Wir Kristalle für Änderungen in der Morphologie überwacht, und fanden, dass Kristalle mit zusammengesetzten bei 20 mM HA getränkt führte die schnelle Rissbildung und Auflösen des Kristalls. Wir froren insgesamt 63 Kristalle, die ihrer Form nach festgelegten Inkubationszeiten, die mit Tantal Bromid Cluster, Platin chlorid, Quecksilberoxid Acetat und Quecksilberchlorid getränkt wurden beibehalten. Kristalle mit 7 mM von Quecksilberchlorid für 30 min zeigte anomale Signal auf einem Fluoreszenz-Scan bei der Canadian Light Source (CLS) 08-BM-Strahlrohr (Saskatoon, Kanada) getränkt und erlaubt für Multi-Wellenlänge anomalen Dispersion Röntgen Datenerhebung auf einer einzigen Kristall. Diese Datasets erlaubt uns, die Quecksilber-Unterkonstruktion der CD22 lösen20-330, 5A, die eine einzelne Quecksilber-Atom gebunden, eine kostenlose Cystein an Position C308 und letztendlich konnten wir die Struktur der CD22 bauen ergab20-330, 5A in der stufenweisen Elektron-Dichte-Karte mit AutoBuild78.
Sobald die Unliganded Struktur gelöst war, interessierte uns die Struktur der CD22 verpflichtet, seinen Liganden, α2-6 Siallylactose zu lösen. Wir berechnet zuerst die Affinität der CD22 α2-6 Sialyllactose mit ITC die Bindung Thermodynamik der Interaktion zu charakterisieren. Wir beobachteten eine Affinität von ~ 280 µM und verwendet diese Informationen, um eine Ausgangskonzentration identifizieren (~ 100 x KD) Liganden, zum Einweichen von unseren einheimischen CD2220-330, 5A -Kristalle zu verwenden. Wir CD2220-330, 5A Kristalle mit 25 mM Siallylactose für 5 min, 2 h, 14 h, 40 h und 5D getränkt und auf Änderungen im Kristall Morphologie überwacht. Insgesamt 75 ~ Kristalle wurden von verschiedenen Zeitpunkten eingefroren und an die CLS Synchrotron Strahlrohr 08-ID (Saskatoon, Kanada) für remote-Datenerfassung. Insgesamt sechs Röntgen-Datensätze wurden von gut diffracting Kristalle gesammelt. Die Struktur von jedem x-ray Dataset wurde durch Herrn mit Unliganded CD2220-330, 5A Struktur als eine anfängliche Suche Modell gelöst. Die daraus resultierende Elektronendichte für alle Datensätze wurde dann für positive Dichte in der Fo-Fc-Karte inspiziert, die α2-6 Sialyllactose innerhalb der Bindungsstelle des CD22 gebunden entsprechen würde. Bemerkenswert ist, alle Datensätze gesammelt, auch die von Kristallen getränkt nach nur 5 min von Inkubationszeit enthaltenen positiven Dichte entspricht der Liganden in die Bindungsstelle. Allgemeine Strukturen des Unliganded und der liganded CD22 waren sehr ähnlich mit minimalen Konformationsänderungen, die was den Erfolg der durchnässten Experimente mit α2-6 Sialyllactose erklären könnte.
Wir zeichnen als nächstes die Antigene Oberfläche der CD22 von therapeutischen Antikörpern Epratuzumab in BLI und ITC Experimente (Abbildung 5) anerkannt. Kinetik und Thermodynamik profile Epratuzumab Fab Bindung an CD22 Konstrukte mit verschiedenen Glycoforms offenbart eine zunehmende Affinität zu CD22 mit reduzierten N verbunden Glycan Größe mit bis zu einer 14-fold Verbesserung der Affinität für kleinere Glykoproteinen (327 nM Vs 24 nM in BLI; 188 nM Vs 58 nM im ITC). Die CD22 N verbunden Glycan Beschränkung des Zugangs des Antikörpers zu sein Epitop wurde durch BLI mit Einpunkt-Mutanten der CD22 und lösen die Epratuzumab Fab-CD22 d1-d3 Co Kristall Struktur28gekennzeichnet.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig1.jpg"> Abbildung 1 . Übersicht der Glykoprotein Charakterisierung von Konstrukt Design auf biophysikalische und strukturelle Charakterisierung. (1) primäre Sequenzanalyse der repräsentativen Glykoprotein. In grau, der extrazellulären Domäne (ECD); in grün, Segment transmembranen (TM); und blau, die cytosolische Domäne das Glykoprotein. Vorhergesagten N verbunden Glykane sind beschriftet. (2) Klonen ECD Konstrukte. (3) Ausdruck der ECD-Konstrukte in Säugerzellen. (4) Glykoprotein Reinigung. Während Proteine in HEK293F komplexen Glykoproteinen enthalten werden, werden Proteine in HEK293S hohe Mannose Glykanen haben. Enzymatische Behandlung von Glykoproteinen in HEK293S Zellen mit Endo H Ergebnisse in Glykoproteinen mit nur GlcNAc Glyko-an N-linked Glykosylierung Standorten produziert. (5a) Glykoproteine sind für ihre Bindung an Antikörper von Biolayer Interferometrie (BLI) und Isotherme Titration Kalorimetrie (ITC) getestet. Affinität zu kleinen Liganden kann auch durch ITC gemessen werden. (5 b) Kristallisation Studien von Glykoproteinen mit homogenen N verbunden Glykane, wie die in HEK293S und Deglycosylated mit Endo H. (6) In einigen Fällen ist Mutation des N-linked Glykosylierung Seiten notwendig, Kristalle zu erhalten. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig2.jpg"> Abbildung 2 . Gestaltung von CD22 ektodomäne DNA für Ausdruck in Säugetierzellen baut. A) Darstellung des pHLsec Plasmids für Transiente Transfektion von CD22 ECD Konstrukte verwendet. AgeI und KpnI Sites zum Klonen verwendet werden mit roten Kästchen angezeigt. B) The CD22 ECD enthält sieben Ig Domänen (d1-d7) und 12 vorhergesagten N verbunden Glykosylierung Standorte (in blau). Vier Konstrukte wurden von CD22 ECD entwickelt. C) 1 % Agarose-Gel mit PCR Amplifikate der CD22 ECD baut für Klonen in der Säugetier-Expressionsvektor pHLsec. Erste Spur enthält 1 kb DNA-Marker. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a> 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig3.jpg"> Abbildung 3 . Expression und Reinigung von Glykoproteinen. (A) Wirkung der Zelldichte Ausdruck Renditen. Glykoprotein Ausdruck in kleinen 25 mL Kultur HEK293F Aussetzung Zellen transfiziert mit drei unterschiedlichen Ausgangspunkt dichten von Zellen (0,5 x 106 Zellen mL-11.0 x 106 Zellen mL-1und 1, 5 x 106 Zellen mL -1). Quantifizierung von Densitometrie von SDS-PAGE im linken Panel und durch quantitative BLI im rechten Bereich durchgeführt. Werte sind repräsentativ für ein Glykoprotein Vorbereitung. B) Chromatogramm der ersten Reinigungsstufe für konstruieren CD2220-330, 5A von 600 mL überstand mit einer Ni-NTA-Affinität-Spalte. Das Glykoprotein war eluiert mit einem Farbverlauf von Imidazol (graue Linie), wo der Elution Puffer, der 500 mM Imidazol enthält 100 % entspricht. Gepoolte Brüche werden durch vertikale Linien dargestellt. C) Größe-Ausschluss Chromatogramm für konstruieren CD2220-330, 5A mit einem Hochleistungs-gel-Filtration-Spalte. Gepoolte Fraktionen aus der Elution Gipfel sind mit vertikalen Linien dargestellt. Einschub: Coomassie gefärbt SDS-PAGE Gel zeigt die Reinheit des das Glykoprotein. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig4.jpg"> Abbildung 4 . Einweichen mit schweren Atomen Crystal. (A) Probe Workstation zum Einweichen native Kristalle mit HA-Verbindungen. Alle erforderlichen Werkzeuge gekennzeichnet sind. (B) Schritte befolgt, um Kristalle von Tränken konstruieren CD2220-330, 5A mit HA-Verbindungen. Schritt 1, geöffnet auch mit Kristallen und Transfer-Kristalle mit einer Schleife zu einem Rückgang von 0,2 µL auf einem Deckglas mit HA-Lösung verdünnt in der Kristallisation Zustand, so dass die Endkonzentration von HA von 1-10 mM reicht. Schritt2, versiegeln den Rückgang der Kristallisation Platte und inkubieren Sie Kristalle mit zusammengesetzten für verschiedene Zeiträume HA. Schritt 3, montieren Sie die eingeweichten Kristall in der Schleife und zurück-Tränken für 30 s in drei aufeinander folgenden 0,2 µl Tropfen mit der Mutter-Alkohol-Lösung ergänzt mit 20 % (V/V) Glycerin auf einem Deckglas verzichtet. Schritt 4, Flash den Kristall montiert auf einer Schleife mit flüssigem Stickstoff eingefroren und legen Sie sie in ein Puck für den Versand in das Synchrotron-Strahlrohr. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig4large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57750/57750fig5.jpg"> Abbildung 5 . Biolayer Interferometrie und Isothermen Titration Kalorimetrie Messungen. (A) Vertreter BLI Experiment. Oberseite: Beispiel der Platte Setup für eine Kinetik-Experiment, wo sind die folgenden gekennzeichnet: 1 X Kinetik Puffer (B), seine6 X-tagged Glykoprotein laden (L), repräsentative Fab Konzentrationen (62,5, 125, 250, 500 nM), PBS + 500 mM Regeneration Puffer-Puffer (R) und 1 x Kinetik Neutralisation (B). Jedes enthält gut 200 µL der Lösung. Schritt wird für die Kinetik-Experiment am oberen Rand der Platte angezeigt. Mitte-Panel: Repräsentative Rohdaten von BLI Experiment mit Ni-NTA Biosensoren durchgeführt und die Platte im oberen Feld beschrieben. Schritt Zahlen entsprechen Grundlinie (1),6 X Glykoprotein laden (2), Basislinie (3), Verband in serielle Verdünnung der Fab (4) und Dissoziation (5). Regeneration-Schritte sind nicht vertreten (Schritte 6 und 7). Bodenplatte: Repräsentative Analysierte Daten zeigen rohen Assoziation und Dissoziation (blaue Linie) mit den entsprechenden 1:1 passen (rote Linie). B) Oberseite: repräsentative Platte Setup für eine einzelne ITC ausführen auf einem automatisierten ITC-Instrument mit sieben Experimente in einer 96-Well Runde Unterflasche. Jedes Experiment besteht aus drei Brunnen. Der erste Brunnen (rot) entspricht Probe für die Zelle (400 µL), der zweite Brunnen (grün) entspricht zum Beispiel für die Spritze (120 µL). Die dritte ist nun leer, und der Mischproben werden dazu auch nach dem Experiment Abschluss zurückgegeben werden. Experimente 1, 2 und 7 sind Puffer in Puffer Steuerelemente. Experimente von 3-5 sind dreifacher Experimente mit Glykoprotein (P) in der Zelle und Fab oder Liganden (L) in der Spritze. Experiment 6 stellt eine Ligand Wärme der Verdünnung Kontrolle und sollte während der Datenanalyse aus Experimenten 3-5 subtrahiert werden. Bodenplatte: Repräsentative roh (oben) und verarbeiteten (unten) ITC Daten zeigen Fab (Epratuzumab) binden an CD22 ECD produziert in HEK293F Zellen. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57750/57750fig5large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Ansätze für die biophysikalischen und strukturelle Charakterisierung von Glykoproteinen präsentieren wir mit der Immunglobulin-Falte Biolayer Interferometrie, Isothermen Titration Kalorimetrie und Röntgen-Kristallographie.

Charakterisierung von Glykoproteinen mit dem Immunglobulin-Falz durch Röntgen-Kristallographie und biophysikalischen Techniken

Glycoproteins on the surface of cells play critical roles in cellular function, including signalling, adhesion and transport. On leukocytes, several of ...

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Glykoproteine zu beantworten. Wir geben Einblicke in die Funktion des Proteins, die Rolle von N-verknüpften Glykanen sowie den Mechanismus und die Wirkung von Antibiotika, die auf das Glykoprotein abzielen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie auf jedes Glykoprotein von Interesse angewendet werden kann.Erleichterung der strukturellen und biophysikalischen Charakterisierung einer Vielzahl von Glykoproteinzielen. Dieses Verfahren wird von Hong Cui, einem Koordinator eines Forschungsprojekts in unserem Labor, demonstriert. Bereiten Sie zunächst die Zellen vor und transfizieren Sie sie, wie im Textprotokoll beschrieben.Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 6.371 g und vier Grad Celsius für 20 Minuten. Halten Sie den Überstand zurück und verwenden Sie dann einen 0,22-Mikron-Filter, um ihn zu filtern. Laden Sie den gefilterten Überstand mit vier Millilitern pro Minute auf eine Ni-NTA-Säule in einem Tischchromatographiesystem.Waschen Sie danach die Säule mit drei bis vier Volumina Waschpuffer. Verdünnen Sie das gereinigte Glykoprotein aus der Säule mit einem Elutionspuffergradienten, während Sie Fraktionen sammeln. Die Fraktionen, die den umgangenen Peak enthalten, werden in eine Zentrifugalfiltrationsvorrichtung mit einem nominalen Molekulargewicht von 10 Kilodalton gezogen.Zentrifugieren Sie dann 15 Minuten lang bei 4.000 G und vier Grad Celsius oder bis die Probe ein Volumen von 500 Mikrolitern erreicht. Injizieren Sie das konzentrierte Glykoprotein in eine 500-Mikroliter-Probenschleife. Laden Sie das Glykoprotein bei vier Grad Celsius auf eine voräquilibrierte Hochleistungs-Größenausschlusssäule auf einem FPLC-System, während Sie Fraktionen sammeln.Führen Sie anschließend ein SDS-PAGE-Gel durch, um zu identifizieren, welche entgangenen Fraktionen das Glykoprotein enthalten, und ziehen Sie diejenigen, die dies tun. Unter Verwendung einer Zentrifugalfiltrationsvorrichtung mit einer nominalen Molekulargewichtsgrenze von 10 Kilodalton wird reines deglykosyliertes ECD bei 4.000 mal G und vier Grad Celsius konzentriert, bis die gewünschte Konzentration erreicht ist. Nach der Bestimmung der Proteinkonzentration zentrifugieren Sie die Probe fünf Minuten lang bei 12.000 G und vier Grad Celsius, um Staub und andere Verunreinigungen zu entfernen.Geben Sie als Nächstes 80 Mikroliter Kristallisationslösung aus einem kommerziellen Kristallisationssieb in jede Reservoirvertiefung in einer 96 Bohrlöcher fassenden Tropfkristallisationsplatte. Verwenden Sie einen Kristallisationsroboter, um Proteintropfen in die Vertiefungen der Kristallisationsplatte zu dosieren. Unter Verwendung eines Gesamttropfenvolumens von 200 Nanolitern bei einem Verhältnis von gereinigtem Protein zu Kristallisationslösung von eins zu eins.Verschließen Sie danach die Platte mit Klebeband. Übertragen Sie die versiegelte Platte in einen Platten-Imager zur Inspektion durch sichtbares und ultraviolettes Licht. Identifizieren Sie die Bedingungen, die anfängliche Glykoprotein-Kristallköpfe ergeben, und optimieren Sie diese Kristalle weiter, wie im Textprotokoll beschrieben.Kryoschützen Sie die Kristalle, indem Sie sie in einer Lösung aus Mutterlauge einweichen, die mit 20% Glycerin versetzt ist. Montieren Sie dann die Kristalle in CryoLoops. Mit flüssigem Stickstoff die montierten Kristalle vor der Datenerfassung schockfrosten.Nach der Herstellung von gut beugenden Kristallen in einer 24-Well-Kristallisationsplatte wird eine Stammlösung aus 50 millimolaren Liganden und 20 millimolaren Tris bei einem pH-Wert von 9,0 mit 150 millimolarem Natriumchlorid hergestellt. Geben Sie verschiedene Konzentrationen dieser Ligandenlösung zu dem zuvor vorbereiteten Tropfen, der die ECD-Kristalle enthält. Versiegeln Sie den Tropfen für eine Inkubationszeit zwischen fünf Minuten und fünf Tagen.Verfolgen Sie die Kristalle mit einem Lichtmikroskop visuell, um mögliche Veränderungen in der Morphologie zu identifizieren. Nach der Inkubation montieren Sie die Kristalle mit CryoLoops und kryoschützen Sie sie in Mutterlaugelösung, die mit 20 % Glycerin versetzt ist. Um mit der Bioschicht-Interferometrie zu beginnen, bereiten Sie 50 Millimeter 1X Kinetics Buffer aus 10X Kinetics Buffer vor, wie im Textprotokoll beschrieben.Geben Sie 200 Mikroliter dieses Puffers in eine Vorbenetzungsplatte. Übertragen Sie sechs Ni-NTA-Biosensoren auf die Platte und lassen Sie sie 10 Minuten lang im Puffer hydratisieren. Als nächstes verdünnen Sie His-markiertes ECD in einem Milliliter 1X Kinetics Buffer bei einer Endkonzentration von 25 Nanogramm pro Mikroliter.Und bereiten Sie serielle Verdünnungen des gereinigten FAB vor. Aquatisieren Sie nun die Reagenzien in einer 96-Well-Mikroplatte, wie hier zu sehen. Dabei steht B für den 1X-Kinetikpuffer, L für die His-markierte Glykoproteinbeladung, die numerischen Einträge für die verdünnten FAB-Konzentrationen und R für den Regenerationspuffer.Übertragen Sie die hydratisierten Biosensoren für 60 Sekunden in Vertiefungen mit 1X Kinetics Buffer, um sie als Ausgangswert zu verwenden. Laden Sie dann das Glykoprotein in einer Konzentration von 25 Nanogramm pro Mikroliter für 240 Sekunden bei 1.000 U/min. Setzen Sie die Biosensoren wieder für 60 Sekunden in die Vertiefungen mit 1x Kinetics Buffer ein, um eine zweite Baseline zu erhalten.Übertragen Sie die Sensoren für 180 Sekunden in die Vertiefungen, die die seriellen Verdünnungen von FAB enthalten. Nach dieser Assoziationsphase übertragen Sie die Biosensoren für einen 180-sekündigen Dissoziationsschritt zurück in den 1X Kinetics Buffer. Öffnen Sie anschließend die Analysesoftware.Importieren Sie auf der ersten Registerkarte die Daten, und wählen Sie sie dann aus. Wählen Sie unter Registerkarte zwei, Schritt eins Datenauswahl, Sensorauswahl aus. Markieren Sie die Referenz-Wells, und klicken Sie dann mit der rechten Maustaste, um die Referenz-Wells festzulegen.Wählen Sie im zweiten Schritt, Subtraktion, Referenzwells aus. Wählen Sie anschließend unter Schritt drei Y-Achse ausrichten die Option Basislinie aus, und legen Sie einen Zeitbereich zwischen 0,1 Sekunden und 59,8 Sekunden fest. Wählen Sie im vierten Schritt die Inter-Step-Korrektur und die Ausrichtung auf Dissoziation aus.Verarbeiten Sie dann in Schritt fünf die Savitzky-Golay-Filterung und klicken Sie auf Daten verarbeiten. Das Tor zur dritten Registerkarte. Im zweiten Schritt analysieren Sie mit einem Eins-zu-Eins-Modell, wählen Sie Assoziation und Dissoziation aus, wählen Sie globale Anpassung und Gruppieren nach Farbe aus.Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Kurven, klicken Sie auf Farbe festlegen und stellen Sie alle Kurven auf die gewünschten Farben ein. Wählen Sie anschließend Kurven einpassen. Wenn die Daten gut angepasst sind, exportieren Sie das Ergebnis, indem Sie auf Bericht speichern klicken.Wiederholen Sie den Versuch für alle gewünschten Bedingungen. In dieser Arbeit wurden mehrere Konstrukte der extrazellulären CD22-Domäne erfolgreich in den pHL-sec-Expressionsvektor kloniert. Diese Konstrukte werden dann in den Säugetierzelllinien HEK293-F und HEK293-S überexprimiert.Während die Kulturen, die etwa eine Million und eineinhalb Millionen Zellen pro Milliliter enthielten, sehr ähnliche Konzentrationen von Glykoproteinen exprimierten. Kulturen von nur einer halben Million Zellen pro Milliliter exprimierten deutlich weniger. Danach werden die Kulturen geerntet und das ECD-Glykoprotein durch Affinitäts- und Größenausschlusschromatographie isoliert, um alle Konstrukte auf Größenhomogenität zu reinigen.So entsteht eine hochreine Probe für die Kristallisation und biophysikalische Studien. Im Anschluss an diese Verfahren können weitere Methoden wie die Elektronenmikroskopie einzelner Teilchen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur dreidimensionalen Struktur der extrazellulären Domäne in voller Länge oder von Proteinkomplexen zu beantworten. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Glykoproteine, ihre Liganden und Targeting-Antikörper exprimiert, gereinigt und strukturell und biophysikalisch charakterisiert werden.

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Forschung

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Biochemistry

Biochemie

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