Name: Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-20T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 18 s
Description: Lernen Sie die in situ Proximity Ligation Assay (PLA) zur Visualisierung von Protein-Interaktionen wie MST1/MST2-Heterodimerisierung in fixierten Zellen. Diese hochsensitive Methode ermöglicht die Detektion ohne transgene Expression.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Wir bedanken uns bei der gesamte Chernoff-Labor für Beitrag zur Optimierung und Validierung dieses Protokolls, insbesondere Maria Radu und Galina Semenova. Wir danken auch Andrey Efimov von Cell Imaging Facility am Fox Chase Cancer Center. Diese Arbeit wurde unterstützt durch einen Zuschuss aus dem NIH (R01 CA148805) an JC.

1. Vorbereitung der Lösungen
<ol><li>Bereiten Sie Fixativ Lösung: 4 % Paraformaldehyd (PFA) mit 1 X PBS-Puffer. Nehmen Sie für 10 mL, 2,5 mL 16 % PFA und 7,5 mL 1 X PBS. Gefahren: PFA ist in geringen Dosen krebserregend. Dämpfe und Hautkontakt sind gefährlich. Shop bei-20 ° C.</li>
	<li>Bereiten Sie Permeabilisierung Lösung: 0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer. Fügen Sie für 100 mL der Lösung 100 µL Triton x-100 in 100 mL 1 X PBS hinzu. Lagerung bei Raumtemperatur (RT).</li>
	<li>Waschpuffer vorbereiten: 1 X TBST. Nehmen Sie für 1 L 100 mL 10 X TBS, dH2O 890 mL und 10 mL Tween 20 (10 %).</li>
	<li>Bereiten Sie blockierende Lösung als Kit geliefert. Alternativ können Sie 1 X PBS-Lösung mit 2 % BSA.</li>
	<li>Bereiten Sie das Antikörper-Verdünnungsmittel wie Kit geliefert. Alternativ können Sie 1 X PBS-Lösung mit 1 % BSA.</li>
</ol>2. Beschichtung von Zellen
Hinweis: In dieser Studie verwendeten wir unsterblich menschlichen Schwann-Zellen (Royal) und menschliche embryonale Nieren-293-Zellen (HEK 293); Diese Methode ist jedoch für viele Arten von adhärenten Zellen einsetzbar.
<ol><li>Kultur HEK 293 in DMEM mit 10 % ergänzt FBS, 0,2 % Glucose, 2 mM L-Glutamin, 100 U/mL Penicillin G und 100 µg/mL Streptomycin auf Gewebekultur imprägnierte Platten bei 37 ° C in 5 % CO2. Pflegen Sie Royal in 10 % FBS/DMEM mit Pen/Strep und 2 µM Forskolin ergänzt. Routinemäßig testen Sie Zellen für Mykoplasmen. Keine Zelle Zeile Authentifizierung durchgeführt wurde.</li>
	<li>Bestreichen Sie eine 16-Well-Kammer-Folie mit 50 µL 10 µg/mL natürliche Maus Laminin oder 0,01 % Poly-L-Lysin-Lösung und inkubieren Sie für 30 min bei 37 ° C in 5 % CO2. Teilen von Zellen mit 0,04 % Trypsin-EDTA.</li>
	<li>Platte Royal und HEK-293 in 100 µL Medium bei 80 % Zusammenfluss (15.000-25.000 Zellen/na).</li>
	<li>Inkubation der Zellen für 12-24 Stunden bei 37 ° C in eine befeuchtete, 5 % CO2 Inkubator.</li>
</ol>(3) Fixierung und Permeabilisierung
<ol><li>Entfernen Sie das Medium aus den Brunnen und mit 100 µL 1 X PBS waschen. Aspirieren Sie mit einer Mikropipette zur Minimierung des Risikos die Probe zu entfernen.</li>
	<li>Zellen durch Zugabe von 50 µL 4 % PFA pro gut und inkubieren Sie für 10 min bei RT, ohne Unruhe zu beheben. Zellen reagieren empfindlich auf Distanz, so vermeiden pipettieren die Lösungen direkt auf die Zellen.</li>
	<li>Waschen Sie die Zellen mit 0,05 % TBST drei Mal für 5 Minuten. Aspirieren Sie mit einer Mikropipette zur Minimierung des Risikos die Probe zu entfernen.</li>
	<li>Behandeln der Zellen mit Permeabilisierung Lösung (0,1 % Triton x-100 mit 1 X PBS-Puffer) für 10 min ohne Agitation bei RT</li>
	<li>Waschen Sie Zellen mit TBST dreimal für jeweils 5 min. unter Rühren.</li>
</ol>4. Sperrung
<ol><li>Tippen Sie auf die TBST (sehr sanft mit einer Mikropipette). Visualisieren Sie die Folie in einem Mikroskop zu sehen, ob Zellen verbunden bleiben.</li>
	<li>Geben Sie einen Tropfen (50-60 µL) von 1 x Blocking Lösung zu jeder Probe.</li>
	<li>Eine Feuchte Kammer (leer Tip Box mit Wasser) bei 37 ° C vorheizen und die Folien in es für 1 h bei 37 ° c inkubieren</li>
</ol>5. primäre Antikörper
<ol><li>Die primären Antikörper (1: 100) in der Antikörper Verdünnungsmittel verdünnen (siehe Tabelle der Materialien). 40 µL Antikörperlösung pro Bohrloch vorzubereiten.</li>
	<li>Entfernen Sie blockierende Lösung durch Antippen die Flüssigkeit von den Folien. Lassen Sie nicht zu trocken Zellen.</li>
	<li>Wirbel und jedes gut 40 µL der Antikörper Lösungen hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C in einen vorgeheizten Feuchte Kammer.</li>
</ol>(6) Nähe Ligation Assay Sonden
Hinweis: PLA-Sonden als Teil eines Kits bereitgestellt werden (siehe Tabelle der Materialien). Die Wahl der Sonden richtet sich nach den Arten von primären Antikörper verwendet, um die Proteine des Interesses zu erkennen.
<ol><li>Verdünnen Sie die zwei PLA-Sonden (Anti-Maus-MINUS und PLUS Anti-Kaninchen) 1:5 in der Antikörper Verdünnungsmittel. Bereiten Sie für jede Probe 40 µL PLA-Sonde. Die Mischung für 20 min bei RT inkubieren</li>
	<li>Tippen Sie auf die primären Antikörper-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Folien zweimal für jeweils 5 min. mit waschen Puffer bei RT</li>
	<li>Sanft von Waschpuffer von den Folien tippen und Brunnen (40 µL/Well) die Verdünnungsmittel PLA Sonde Lösung hinzufügen.</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folien in eine vorgewärmte Feuchte Kammer für 1 h bei 37 ° c</li>
</ol>(7) Ligatur
Hinweis: Die in Situ Detektion Reagenzien rot, Ligase und Ligation Lösung dienen als Teil eines Kits (siehe Tabelle der Materialien).
<ol><li>Verwenden Sie das in Situ Detektion Reagenzien rot.</li>
	<li>Unmittelbar vor dem Gebrauch, Wirbel und die geforderten Mengen von 5 x Ligatur Lager 1:5 in hochreinem Wasser verdünnen. Hinweis: Bewahren Sie verdünnte Reagenzien.</li>
	<li>Tippen Sie auf die PLA-Sonde-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Folien in 1 x Waschpuffer zweimal für 5 min bei RT</li>
	<li>Unmittelbar vor der Zugabe zu Proben Wirbel und die Ligation Lösung bei 01:40 Ligase hinzufügen Verdünnung und Wirbel wieder.</li>
	<li>Tippen Sie auf aus der Waschpuffer von Folien und fügen Sie die Ligation/Ligase-Lösung in jede Vertiefung (40 µL/Well).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folien in eine vorgewärmte Feuchte Kammer für 30 min bei 37 ° c</li>
</ol>(8) Verstärkung
Hinweis: Die Verstärkung Lager als Teil eines Kits vorgesehen ist (siehe Tabelle der Materialien). Reagenzien sind lichtempfindlich; So vermeiden Sie die Folien zum Vorschein.
<ol><li>Wirbel und die geforderten Mengen von 5 x Verstärkung Lager 1:5 in hochreinem Wasser verdünnen und mischen.</li>
	<li>Tippen Sie auf die Unterbindung/Ligase-Lösung von den Folien. Waschen Sie die Folien in 1 x Waschpuffer zweimal für 2 min bei RT</li>
	<li>Wirbel und die Polymerase die Verstärkung-Lösung bei Verdünnung von 1: 80 und Vortex erneut hinzufügen.</li>
	<li>Tippen Sie auf Ausschalten Waschpuffer von Folien und fügen Sie die Verstärkung/Polymerase-Lösung in jede Vertiefung (40 µL/Well). Inkubieren Sie die Folien in eine vorgewärmte Feuchte Kammer für 100 min bei 37 ° c</li>
</ol>9. Vorbereitung für die Bildgebung
Hinweis: Diese sind leicht empfindlichen Reagenzien. Aufbewahren Sie die Folien vor Licht geschützt.
<ol><li>Tippen Sie die Verstärkung-Polymerase-Lösung von den Folien und waschen Sie zweimal für 10 min jeweils in 1 x Waschpuffer bei RT</li>
	<li>Entfernen Sie die Kammern und Silikon um die Brunnen aus der Folie vollständig. Die restlichen Bits aus Silikon mit einem Rasiermesser abkratzen. Zeichnen Sie ein Raster auf der Folie trennt jeweils gut.</li>
	<li>~ 40 µL Eindeckmedium mit DAPI hinzufügen. Achten Sie darauf, um zu vermeiden, Überfüllen Luftblasen unter dem Deckglas. Die Kanten des Deckglases können mit Nagellack versiegelt werden.</li>
	<li>Warten Sie mindestens 20 Minuten vor der Durchführung Bildanalyse mit einem konfokalen Mikroskop. Hinweis: Das Protokoll kann hier angehalten werden.</li>
	<li>Nach dem Imaging, speichern Sie die Folien bei-20 ° C im Dunkeln.</li>
</ol>

<ol><li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nore1B%2FMst1+complex+restrains+antigen+receptor-induced+proliferation+of+na%C3%AFve+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">The Nore1B/Mst1 complex restrains antigen receptor-induced proliferation of naïve T cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105 (51), 20321-20326 (2008).</li>
<li>Praskova, M., Xia, F., Avruch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MOBKL1A%2FMOBKL1B+phosphorylation+by+MST1+and+MST2+inhibits+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">MOBKL1A/MOBKL1B phosphorylation by MST1 and MST2 inhibits cell proliferation.</a> Current Biology. 18 (5), 311-321 (2008).</li>
<li>Dan, I., Watanabe, N. M., Kusumi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20+group+kinases+as+regulators+of+MAP+kinase+cascades%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">The Ste20 group kinases as regulators of MAP kinase cascades.</a> Trends in Cell Biology. 11 (5), 220-230 (2001).</li>
<li>Rawat, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((H-ras+Inhibits+the+Hippo+Pathway+by+Promoting+Mst1%2FMst2Heterodimerization%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Biology%22%5BJournal%5D)">H-ras Inhibits the Hippo Pathway by Promoting Mst1/Mst2Heterodimerization.</a> Current Biology. 26 (12), 1556-1563 (2016).</li>
<li>Creasy, C. L., Ambrose, D. M., Chernoff, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ste20-like+protein+kinase%2C+Mst1%2C+dimerizes+and+contains+an+inhibitory+domain%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">The Ste20-like protein kinase, Mst1, dimerizes and contains an inhibitory domain.</a> Journal of Biological Chemistry. 271 (35), 21049-21053 (1996).</li>
<li>Buntru, A., Trepte, P., Klockmeier, K., Schnoegl, S., Wanker, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+Approaches+Toward+Quantitative+Mapping+of+the+Interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">Current Approaches Toward Quantitative Mapping of the Interactome.</a> Frontiers in Genetics. 74 (7), (2016).</li>
<li>Greenwood, C., Ruff, D., Kirvell, S., Johnson, G., Dhillon, H. S., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proximity+assays+for+sensitive+quantification+of+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecular+Detection+and+Quantification%22%5BJournal%5D)">Proximity assays for sensitive quantification of proteins.</a> Biomolecular Detection and Quantification. 4, 10-16 (2015).</li>
<li>Fredriksson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+detection+using+proximity-dependent+DNA+ligation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays.</a> Nature Biotechnology. 20 (5), 473-477 (2002).</li>
<li>Leuchowius, K. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+visualization+of+multiple+protein+complexes+in+individual+cells+in+tumor+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+%26+Cellular+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Parallel visualization of multiple protein complexes in individual cells in tumor tissue.</a> Molecular & Cellular Proteomics. 12 (6), 1563-1571 (2013).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
</ol>

Die Autoren erklären, dass sie keine finanziellen Interessenkonflikte.

Wir fanden es nützlich, Kammer Objektträger für dieses Experiment zu verwenden, wie es sehr praktisch zum Experiment mit mehreren (14-16) Zelllinien durchführen ist und es keine Notwendigkeit gibt, die Probe jedes Mal während der Mikroskopie Analyse ändern. Ein paar Komplikationen auftreten, wie ein erhöhtes Risiko für Cross-Kontamination mit Antikörpern. Daher empfehlen wir waschen jeden gut einzeln anstatt Kanope Coplin, trotz der erhöhten während des Experiments. Darüber hinaus Entfernen von Silikon-Einlage ist eine h...

Störung der MST1/Hippo-Signal wurde mit Entwicklungsstörungen und Karzinogenese1verbunden. Bei Säugetieren, die Kinasen MST1 und MST2 aktivieren (phosphorylieren) MOB1 und LATS1/2, von denen die letztere dann phosphorylates und inaktiviert die transkriptionelle Coaktivator ja-assoziierten Protein (YAP)2. In seiner aktiven Form (unphosphorylated) hat YAP Onkogenen Aktivität, Verbesserung der Transkription von Genen Zelle Verbreitung; umgekehrt, wenn YAP durch den Hippo-Weg inaktiviert, Zellproliferation wird unterdrückt und Apoptose gefördert3. In Geweben MST1 und MST2 gibt es hauptsächlich als aktive Homodimers aber Onkogenen Reize MST1/MST2 Heterodimere erhöhen können, und solche Heterodimere sind inaktive4. Wie MST1/MST2 Heterodimerization reguliert wird, bleibt jedoch schlecht verstanden. Homo- und Heterodimere sind vermittelte über Interaktionen zwischen C-terminale coiled-Coil Regionen MST1 und MST2 bekannt als SARAH Domänen5. Über ein in Situ nachgewiesen PLA in diesem Artikel zeigen wir die Anwesenheit von MST1/MST2 Heterodimere im menschlichen Schwann-Zellen (HSC) und menschliche embryonale Nieren-Zellen (HEK-293). PLA hat einen Vorteil gegenüber anderen Eiweiß/Protein-Interaktion-Nachweismethoden, weil dadurch die Erkennung von endogenen Protein-Protein-Wechselwirkungen, die identifiziert und quantifiziert werden, ohne die Notwendigkeit des Transgens Ausdrucks oder die Verwendung von Epitop Tags werden können 6.
Transduktion Signalwege sind weitgehend vom bedingte Verband der Komponente Proteine gesteuert. Zum Beispiel führt Stimulation der meisten Rezeptor-Tyrosin-Kinasen ihre Homo oder Hetero-Dimerisierung und anschließende Verbindung mit zusätzlichen intrazellulären Signalproteine, die ihrerseits weitere komplexe Form. Der PLA-Methode soll Nähe zwischen den Proteinen in den Zellen visualisieren unter der Voraussetzung, dass die Proteine weniger als 30-40 nm auseinander. Protein-Nähe in der Regel vom ersten Inkubation der Zellen mit entsprechenden Primärantikörper angehoben in verschiedenen Arten erkannt wird (zB., Hase und Maus) gegen jedes interagierenden Protein, dann Zugabe artspezifische Sekundärantikörper Pre-gekoppelte, kurze DNA-Sonden. Wenn die DNA-Sonden in der Nähe sind, kann eine bestimmte Verknüpfung DNA-Oligonukleotid gleichzeitig sowohl diese Sonden, bilden eine Plattform für die Verstärkung von in Situ PCR oder durch Walzen Kreis Mechanismus binden. Fluoreszierende Tags hinzugefügt, um die Verstärkung Reaktion ermöglichen Visualisierung der interagierenden Proteine, die erscheinen als fluoreszierende Punkte, die leicht zu quantifizieren und lokalisiert auf bestimmte Regionen in der Zelle7,8, 9 , 10.

<table><tbody><tr><td>Objektträger</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>178599</td><td>16 Well, Glasobjektträger</td></tr><tr><td>PLA-Sonde Anti-Maus Minus</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92004</td><td>Enthält 1x Blockierungslösung, 1x Antikörper Verdünnungsmittel</td></tr><tr><td>PLA Sonde Anti-Kaninchen PLUS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92002</td><td>Enthält 1x Blockierungslösung, 1x Antikörper Diluent</td></tr><tr><td>Wash Buffers, Flurescence</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82049</td><td>Enthält Waschpuffer A und Waschpuffer B</td></tr><tr><td>Eindeckmedium mit DAPI</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO82040</td><td></td></tr><tr><td>Detektionsreagenzien Rot</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DUO92008</td><td>Enthält 5x Ligation, 1x Ligase, 5x Amlifikationsrot, 1x Polymerase</td></tr><tr><td>p44/42 MAPK (Erk1/2) Antikörper</td><td>Zellsignalisierung</td><td>9102S</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-p44/42 MAPK (Erk1) (Tyr204)/(Erk2) (Tyr187)</td><td>Zelle Signalweg</td><td>5726s</td><td>pERK Antikörper</td></tr><tr><td>MST2 Antikörper</td><td>Cell Signaling</td><td>3952s</td><td></td></tr><tr><td>Krs-2 (RJ-5)</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-100449</td><td>MST1 Antikörper</td></tr><tr><td>16% Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie sciences</td><td>15710</td><td>Verdünnung auf 4% PFA in PBS zur Fixierlösung</td></tr><tr><td>Triton x100</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP 151-500</td><td>Zur Aufbereitung von 0,1 % Triton x-100 in 1xPBS für die Permeabilisierungslösung</td></tr><tr><td>Konfokale Mikroskopie</td><td>Leica TCS SP8, 63x</td><td></td><td>Bildanalyse mit der ImageJ-Software</td></tr></tbody></table>

erkennung von heterodimerization protein-isoformen, die mit einem in situ nähe ligation assay

Detection of Heterodimerization of Protein Isoforms Using an in Situ Proximity Ligation Assay

Regulierte Protein-Protein-Interaktionen sind ein leitendes Prinzip für viele Signalisierung Veranstaltungen, und die Erkennung solcher Ereignisse ist ein wichtiges Element für das Verständnis, wie solche Wege organisiert sind und wie sie funktionieren. Es gibt viele Methoden, um Protein-Protein-Interaktionen in den Zellen zu erkennen, aber relativ wenige können verwendet werden, um Interaktionen zwischen endogenen Proteinen zu erkennen. Eine solche Methode, Nähe Ligatur Assay (PLA), hat mehrere Vorteile, seine Verwendung zu empfehlen. Im Vergleich zu anderen gängigen Methoden der Proteinprotein Interaktionsanalyse, PLA hat relativ hohe Sensitivität und Spezifität, mit minimalen Zelle Manipulation und im Protokoll beschriebenen erfolgen kann, erfordert nur zwei gezielt Antikörper abgeleitet aus verschiedenen Arten (zB., von Mäusen und Kaninchen) und eine spezielle Reagenzien: eine Reihe von sekundären Antikörper, die kovalent verknüpfte spezifischer Oligonukleotide sind, wenn in unmittelbarer Nähe zueinander gebracht, erstellen ein amplifiable Plattform für in Situ PCR oder rollenden Kreis Verstärkung. In diesem Vortrag zeigen wir, wie die PLA-Technik, um Änderungen in MST1 und MST2 Nähe in festen Zellen visualisieren anwenden. Die Technik in diesem Manuskript beschrieben gilt vor allem für die Analyse der Zelle Studien.

Wir verwendet die PLA-Assay, um die Interaktion zwischen MST1 und MST2 in HEK-293 und Royal zu testen. Die Zellen wurden behoben, permeabilized und befleckt mit verschiedenen Antikörpern, gefolgt von in Situ Verstärkung nach dem PLA-Protokoll (Abbildung 1). Um das Niveau der MST1/MST2 Heterodimerization zu dokumentieren, wurden Zellen mit MST1 und MST2 Antikörper (Abb. 1A, 1 C und 1 G) gebeizt. Als Posit...

Hier zeigen wir, wie eine Nähe Ligation Assay (PLA) verwenden, um MST1/MST2 Heterodimerization in festen Zellen mit hoher Empfindlichkeit zu visualisieren.

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Regulated protein-protein interactions are a guiding principle for many signaling events, and the detection of such events is an important element in ...

Der in situ Proximity Ligation Assay oder PLA ist eine Technologie, die in der Lage ist, Wechselwirkungen zwischen Proteinen, anbefestem Gewebe und Zellen zu erkennen. Die Assoziationen zwischen Proteinen können identifiziert und quantifiziert werden, ohne dass eine transgene Expression oder zusätzliche Technologien erforderlich sind. Die einzige Voraussetzung ist die Verfügbarkeit spezifischer hocheffizienter Antikörper, die mit DNA-Oligonukleotiden modifiziert werden können.In Geweben existieren MST1 und MST2 hauptsächlich als aktive Homodimere, aber onkogene Reize können den MST1-MST2-Heterodimer erhöhen und solche Heterodimere sind inaktiv. Nach der Inkubation mit spezifischen Primer-Antikörpern gegen die Proteine von Interesse werden spezielle spezifische sekundäre Antikörper, die jeweils mit einem einzigartigen, kurzen, kostenlosen DNA-Strang verbunden sind, dem Steckplatz hinzugefügt, um an die primären Antikörper zu binden. Wenn die in Frage stehenden Proteine heterodimerisiert sind, befinden sich sowohl die primären Antikörper als auch die an sie gebundenen sekundären Antikörper in unmittelbarer Nähe.In diesem Zustand können die angehängten DNA-Stränge an den zweiten Antik

detection-heterodimerization-protein-isoforms-using-an-situ-proximity

Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Hier zeigen wir, wie Proximity Ligation Assay (PLA), mit einer Kombination von Antikörpern zu verwenden, um Bone Morphogenetic Protein (BMP)-Signalisierung in fixierten Zellen sichtbar zu machen. Diese Technik erlaubt es uns, die nukleare Anreicherung von endogenen BMP aktivierten Effektor-Komplexe folgen und zu quantifizieren, ihre Werte im Laufe der Zeit unter BMP4 Stimulation.

Erkennung von Signaling Effektor-Komplexe Downstream von BMP4 Mit In situ PLA, einem Proximity Ligation Assay

Dieses Video beschreibt den Proximity-Ligation-Assay zur Untersuchung von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Nematodenzellen. Die unmittelbare Nähe der interessierenden Proteine erzeugt das zirkuläre DNA-Template mit Hilfe einer PLA-Sonde, die an einen Sekundärantikörper gebunden ist. Die Sonde wird mit der Amplifikationslösung weiter amplifiziert, die eine lange einzelsträngige DNA erzeugt, gefolgt von der Hybridisierung der Detektorsonde, die die Lokalisierung von...

Proximity-Ligationsassay zur Untersuchung von In-situ-Protein-Wechselwirkungen

In diesem Video demonstrieren wir den modifizierten Hefe-Ein-Hybrid-Assay, der mehrere Proteine nachweist, die mit der Ziel-DNA interagieren. Die transformierten Hefezellen enthalten die Ziel-DNA-Sequenz stromaufwärts des Reportergens. Zusätzlich exprimieren sie Transkriptionsfaktor-Proteine. Wenn die Proteine Komplexe bilden und an die Ziel-DNA binden, wird das Reportergen exprimiert und kann enzymatisch nachgewiesen werden.

Modifizierter Hefe-One-Hybrid-Assay zum Nachweis von heteromeren Proteinkomplex-DNA-Wechselwirkungen

Dieses Video demonstriert die Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkungen an der neuromuskulären Verbindung (NMJ) von Drosophila mit Hilfe des Proximity Ligation Assay (PLA). Nach der Isolierung der Körperwände werden interagierende Proteine mit Primärantikörpern und PLA-konjugierten Sekundärantikörpern untersucht. Die Nähe der interagierenden Proteine erleichtert die Ligation von Sonden mit Konnektor-Oligonukleotiden, wodurch zirkuläre DNA gebildet wird, die dann durch...

Nachweis von Protein-Protein-Wechselwirkungen in Drosophila-Larven mit Hilfe eines Proximity-Ligationsassays

Dieses Protokoll zeigt, wie Proximity Ligation Assay kann verwendet werden, um in situ Protein-Protein-Wechselwirkungen an der Drosophila Larvenneuromuskulären Verbindung nachzuweisen. Mit dieser Technik werden Discs großen und Hu-li tai Shao gezeigt, um einen Komplex an der postsynaptischen Region, eine Vereinigung die vorher durch Co-Immunpräzipitation identifiziert bilden.

Detektion In-situ- Protein-Protein-Komplexe bei der Drosophila Larven Neuromuskuläre Junction Mit Proximity Ligation Assay

Hier beschreiben wir ein Verfahren zur Visualisierung und mit hoher Empfindlichkeit die endogenen Wechselwirkungen zwischen dem endoplasmatischen Retikulum und Mitochondrien in fixierten Zellen zu quantifizieren. Das Protokoll verfügt über eine optimierte In - situ - Proximity Ligation Assay Inositol - 1,4,5-triphosphat Rezeptor / Glucose-regulierte Protein 75 / spannungsabhängige Anionenkanals / Cyclophilin D - Komplex an der Mitochondrien-assoziierte Membran Schnittstelle Targeting.

Studie des endoplasmatischen Reticulum und Mitochondria Wechselwirkungen durch<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay in fixierten Zellen

Protein-Wechselwirkungen können sowohl im Zellkern als auch im Zytoplasma einer Zelle auftreten. Um diese Wechselwirkungen zu untersuchen, werden die traditionelle Co-Immunpräzipitation und der moderne Proximity-Ligationsassay eingesetzt. In dieser Studie vergleichen wir diese beiden Methoden, um die Verteilung der NF90-RBM3-Wechselwirkungen im Zellkern und im Zytoplasma sichtbar zu machen.

Visualisierung von Protein-Protein-Wechselwirkung in Kern- und Cytoplasma-Fraktionen durch Co-Immunpräzipitation und<em&gt; In Situ</em&gt; Nähe Ligatur Assay

Hier wird gezeigt, wie der in situ Proximity Ligation Assay (PLA) verwendet werden kann, um die direkten Protein-Protein-Wechselwirkungen zwischen ATM und p53 in Suspensionszellkulturen, die genotoxischen Stress ausgesetzt sind, zu detektieren und zu visualisieren.

Nachweis und Visualisierung von DNA-schadeninduzierten Proteinkomplexen in Suspensionszellkulturen unter Verwendung des Proximity Ligation Assays

Dieses Protokoll beschreibt einen Kalibrierung-freie Ansatz zur Quantifizierung der Protein Homo-Oligomerisierung in Vitro basierend auf Fluoreszenzspektroskopie Fluktuation mit kommerziellen Licht Rasterelektronenmikroskopie. Die richtige Übernahme Einstellungen und Analysemethoden werden angezeigt.

Kalibrierung-kostenlose In-vitro- Quantifizierung von Protein Homo-Oligomerisierung mit kommerziellen Instrumentierung und kostenlose Open Source-Helligkeit-Analyse-Software

Cognate J-Domain-Proteine arbeiten mit dem Hsp70-Chaperon zusammen, um eine Vielzahl biologischer Prozesse zu unterstützen, die von der Proteinfaltung bis zum Abbau reichen. Hier beschreiben wir einen in situ-Näheligationstest, der die Überwachung dieser vorübergehend gebildeten Chaperon-Maschinen in Bakterien-, Hefe- und menschlichen Zellen ermöglicht.

In Situ-Überwachung von transient gebildeten molekularen Chaperon-Baugruppen in Bakterien, Hefe und menschlichen Zellen

Dieses Protokoll demonstriert die Verwendung des Proximity Ligation Assays zur Sonde für Protein-Protein-Wechselwirkungen in situ in der C. elegans Keimbahn.

In Situ Detektion von Ribonucleoprotein Complex Assembly in der C. elegans Germline mit Proximity Ligation Assay

Lernen Sie die in situ Proximity Ligation Assay (PLA) zur Visualisierung von Protein-Interaktionen wie MST1/MST2-Heterodimerisierung in fixierten Zellen. Diese hochsensitive Methode ermöglicht die Detektion ohne transgene Expression.

Erkennung von Heterodimerization Protein-Isoformen, die mit einem in Situ Nähe Ligation Assay

Weitere Videos entdecken