Visualisierung der Mikrobiota in Tick Mut durch ganze-Mount In Situ Hybridisierung

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen der Zeckenentomologie zu beantworten, wie z. B. die räumliche und zeitliche Beurteilung des Vorhandenseins lebensfähiger Bakterien in der Zecke. Die Hauptvorteile dieser Technik bestehen darin, dass sie kein Schneiden der Zecken oder teure Geräte erfordert und dass sie eine räumliche und zeitliche Visualisierung von Gentranskripten ermöglicht. Im Allgemeinen werden Personen, die mit dieser Technik noch nicht vertraut sind, Schwierigkeiten haben, da sie mehrere Schritte und Reagenzien umfasst.

Diese Technik ist jedoch nicht mühsam. Obwohl es etwa drei Tage dauern kann, beträgt die praktische Zeit nur wenige Stunden pro Tag. Füttern Sie die gesammelten Zecken zur Vorbereitung 48 bis 72 Stunden vor der Darmentnahme.

Um den Darm von der Zecke zu trennen, geben Sie 20 bis 30 Mikroliter MEMFA-Lösung in einen sauberen Objektträger. Platzieren Sie dann das Häkchen in der MEMFA und stellen Sie den Fokus auf den Kopf des Häkchens ein. Schneide nun mit einem Paar steriler Rasierklingen aus kohlenstoffreichem Stahl die Kopfregion am Scutum ab, so dass der Körper der Zecke in Takt bleibt.

Drücken Sie anschließend sanft auf den Körper, um die Darmdivertikel und die Speicheldrüsen aus der Körperkutikula herauszudrücken. Trennen Sie sie dann, ohne die Eingeweide zu beschädigen, vorsichtig von den Speicheldrüsen und schöpfen Sie die Schnitte vorsichtig auf eine Rasierklinge. Sammeln Sie alle geernteten Eingeweide in einem 1,5-Milliliter-Röhrchen in 500 Mikrometern MEMFA.

Dann inkubieren Sie das Röhrchen bei Raumtemperatur unter leichtem Schaukeln eine Stunde lang. Am nächsten Tag entwässern Sie das Gewebe wie im Textprotokoll angegeben und lagern Sie es bei minus 20 Grad Celsius. Um einen Netzkorb vorzubereiten, schneiden Sie zunächst mit einer erhitzten einschneidigen Klinge an einem Skalpell die Böden eines Zentrifugenröhrchens mit zwei Millilitern oder fünf Millilitern mit Schnappverschluss ab.

Es kann sein, dass die Klinge mehrmals erhitzt werden muss, bevor der Schnitt abgeschlossen ist. Schneiden Sie als Nächstes ein Quadrat aus einem 110 Mikron großen Nylonnetz aus, das etwas größer ist als die neuen Öffnungen. Verkleben Sie dann das Netz mit der Öffnung, indem Sie das Rohr auf einer auf mittlere/niedrige Hitze eingestellten Kochplatte leicht in das Netz drücken, bis eine gute Versiegelung entsteht.

Schneiden Sie nach dem Abkühlen das überschüssige Netz ab und stellen Sie sicher, dass keine Lücken vorhanden sind. Stellen Sie 24 dieser Körbe her, die zu einer 24-Well-Platte passen. Schneiden Sie anschließend Löcher in die Abdeckung einer 24-Well-Platte, so dass die Lippe des Probenkorbs das Loch greift und nicht durchfällt.

Wenn sie fertig sind, sollten die zusammengebauten Probenkörbe ganz in die Vertiefungen hineinsitzen. Verwenden Sie nun diesen passenden Korbhalter, um Körbe während der gesamten In-situ-Hybridisierung relativ einfach von einer Platte auf eine andere zu übertragen. Verwenden Sie zwei solcher Platten, damit die Probe in einer Platte inkubiert wird, während die andere für den nächsten Waschgang vorbereitet werden kann.

Dieser Abschnitt behandelt bestimmte Schritte der in situ Hybridisierung. Eine vollständige Beschreibung finden Sie im Textprotokoll. Übertragen Sie zunächst jede fixierte Gewebeprobe in einen beschrifteten Probenkorb.

Ordnen Sie die Platte nach Versuchsbedingungen und färben Sie mindestens fünf Eingeweide pro Zustand. Rehydrieren Sie die Proben zunächst vorsichtig. Vermeiden Sie das Einbringen von Luftblasen, indem Sie das Verhältnis von PBS-T zu Ethanol bei jeder Wäsche schrittweise erhöhen.

Am ersten Tag, nach dem zweistündigen Vorhybridisierungsschritt, sollten Sie den Hybridisierungspuffer nicht verwerfen, sondern ihn für die zukünftige Verwendung während des Assays aufbewahren. Später, wenn Sie die Proben mit Sondenhybridisierungslösung behandeln, decken Sie die Platte eng mit Aluminiumfolie ab, um ein Verdampfen der Lösung zu verhindern. Laden Sie am zweiten Tag den reservierten Hybridisierungspuffer in die 24-Well-Platte und erwärmen Sie die Platte auf bis zu 60 Grad Celsius.

Um alle Spuren von Sonde und Hybridisierungspuffer zu entfernen, waschen Sie die Proben später am Tag zweimal mit 2x SSC für drei Minuten pro Waschgang. Anschließend waschen Sie die Proben dreimal mit 2x SSC für 20 Minuten pro Waschgang bei 60 Grad Celsius. Bereiten Sie dann den primären Antikörper in einem Blockpuffer vor.

Laden Sie 500 Mikroliter dieser Mischung in jede Vertiefung. Nach dem Blockierungsschritt etwa vier Stunden bei Raumtemperatur oder über Nacht bei vier Grad Celsius inkubieren. Führen Sie am dritten Tag die Farbreaktion in chromogenem Substrat durch.

Decken Sie die Probenplatte mit Alufolie ab. Und während der Reaktion mit dem Dissektionsmikroskop regelmäßig auf Überfärbung prüfen. Am vierten Tag ist es wichtig, auf einem Leuchtkasten zu inkubieren und zu bleichen, da dies die Entfernung von Pigmentflecken in den Proben oder Färbungen durch die Bouin-Lösung ermöglicht und das Sondensignal für eine klare Visualisierung verbessert.

Übertragen Sie die Darmproben nach dem Waschen mit SSC vorsichtig, indem Sie den Korb in eine neue 24-Well-Platte umdrehen. Spülen Sie die Körbe in den Vertiefungen gründlich mit 70 % Ethanol ab. Gehen Sie dann mit der Abbildung der Proben voraus.

Es ist wichtig, die Qualität der RNA-Sonden abzuschätzen, bevor sie verwendet werden. Die Sonden können auf einem Formaldehyd-Gel überprüft werden. Wenn sie als helle, diskrete Bänder erscheinen, sind sie von guter Qualität.

Bei der Färbung ist eine gewisse Variation in der Verteilung sowohl bei biologischen Replikaten als auch bei den sieben Divertikelpaaren der einzelnen Eingeweide normal. Daher ist es am besten, mindestens fünf Eingeweide pro Zustand zu färben, um eine Vorstellung vom durchschnittlichen Färbemuster zu bekommen. Der Gesamterfolg lässt sich am besten messen, indem die Färbung von Sense- und Antisense-Proben für jede Erkrankung verglichen wird.

Beide müssen für die gleiche Zeit entwickelt werden. Die Sense-Proben sollten nur eine minimale bis keine violette Farbe aufweisen, während die Antisense-Proben eine robuste Färbung mit minimalem Hintergrund aufweisen sollten. Entscheidend ist, dass das Gewebe vollständig in den Fleck emersiert ist, um eine gleichmäßige Belichtung zu gewährleisten.

Es ist wichtig, eine Überentwicklung der Farbreaktion zu vermeiden. Dies kann zu einer hohen Menge an Hintergrundfärbung führen, und die Sense-Proben können beginnen, wie Antisense-Proben auszusehen. Ein weiterer Faktor, der die Ergebnisse beeinflusst, ist, wie viel die Zecken vorher gefüttert werden.

Zecken, die nicht oder nur 24 Stunden gefüttert werden, sind schwer zu handhaben. Ihr Darm wird leichter beschädigt und färbt nicht gut. Einmal gemeistert, kann diese Technik in zweieinhalb bis drei Tagen durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird.

Wenn Sie dieses Verfahren ausprobieren, ist es wichtig, daran zu denken, alle in der Tabelle der Reagenzien und Materialien aufgeführten Vorräte bereit zu halten, bevor Sie mit dem Experiment beginnen. Vielen Dank fürs Zuschauen und viel Glück bei Ihren Experimenten.