Name: Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 18 s
Description: Lernen Sie die Kartierung enzymatischer Aktivität von Laktat-Dehydrogenase direkt in Gewebeschnitten. Diese Methode ermöglicht die räumliche Analyse von NAD(P)H-bildenden Enzymen in der Biochemie.

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HAC war der Milton E. Cassel Gelehrte von der Rita Allen Foundation (http://www.ritaallenfoundation.org). Diese Arbeit wurde durch Zuschüsse zu HAC vom nationalen Institut der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM081686, R01 AR070245, National Institute der allgemeinen medizinischen Wissenschaften R01 GM0866465, Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research (finanziert. Rose Hügel und Hal Gaba awards), die Iris Cantor Frauen Gesundheitszentrum/UCLA CTSI NIH Grant UL1TR000124, die Leukämie-Lymphom-Gesellschaft Auswirkungen vergibt aus dem Jonsson Comprehensive Cancer Center an WEL und HAC. Forschung berichtet in dieser Publikation wurde von der National Cancer Institute der National Institutes of Health unter Preis Anzahl P50CA092131 unterstützt. Die Geldgeber hatten keine Rolle beim Studiendesign, Datenerhebung und Analyse, Entscheidung, zu veröffentlichen oder der Manuskripterstellung. HAC ist Mitglied der Eli & Edythe Breite Zentrum für Regenerationsmedizin & Stem Cell Research, dem UCLA-Molekularbiologie-Institut und der UCLA Bioinformatik ressortübergreifenden Programm.

Alle beschriebenen Experimente stimmten die Animal Care Committee an der University of California, Los Angeles.
1. erzeugen Sie Dias von gefrorenen Maus Haut
<ol><li>Mäuse im Einklang mit Institution Politik einschläfern. Hinweis: Führen Sie institutionelle Politik für Schutzkleidung. Alle Protokolle, bei denen Tiere müssen durch die institutionelle Animal Care Committee genehmigt werden.</li>
	<li>Entfernen Sie die Maus Haare mit einem Tier Haarschneider.</li>
	<li>Stellen Sie Einschnitte in der Haut mit einer Schere. Mit Pinzette, heben Sie die Haut von der Maus. Mit Schere, Abschnitt Haut wegschneiden.</li>
	<li>Füllen Sie die Cryomold mit dem Reagenz zusammengesetzte Einfrieren (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Ort Hautpartien in gefüllten Cryomolds mit Nadelzange Pinzette. Haut zu orientieren, so dass Gewebe Scheiben werden einen Querschnitt durch die Haut aus der Epidermis, Lederhaut, Unterhaut und Muskulatur (Abbildung 2) zu generieren. Hinweis: Wenn möglich, montieren Sie experimentell zu und Steuern Sie Mäuse zusammen in der gleichen Cryomold, so dass sie auf derselben Folie geschnitten und zusammen verarbeitet werden können. Achten Sie darauf, keine um Luftblasen zu erstellen.</li>
	<li>Legen Sie Cryomold auf die flache Oberfläche aus einem Block von Trockeneis in einem Eiskübel und Einfrieren zu lassen. Weiterhin die Ausrichtung der Haut zu beobachten. Passen Sie bei Bedarf. Hinweis: Kryogene Handschuhe beim Umgang mit Trockeneis.</li>
	<li>Cryomolds in einem-80 ° C Gefrierschrank für die Lagerung zu übertragen. Proben können in den Gefrierschrank für ca. 3 Monate ohne erheblichen Verlust der Enzymaktivität gepflegt werden. Lassen Sie sich nicht Gefrierschnitte austrocknen.</li>
	<li>Verwenden einen Kryostaten bei-20 ° C, Stück Gewebe Abschnitte 7 bis 10 µm Dicke für die beste Haut Morphologie21erstellen.</li>
</ol>2. Vorbereitung Folien zum Beizen
<ol><li>Den Satz von Folien zu prüfenden zu etablieren. Gehören ein Steuerschieber auf dem NAD einbehalten und schieben Sie ein anderes Steuerelement auf dem Substrat, Laktat, einbehalten. Gehören Sie einer Positivkontrolle Folie aus einem gefrorenen Gewebe vorher untersucht.</li>
	<li>Kurz fix Folien mit Hautpartien mit 4 % Formalin für 5 min entweder durch pipettieren 1 mL 4 % Formalin auf der Folie oder, wenn mehrere Folien Verarbeitung durch Eintauchen in ein Behälter, 4 % Formalin schiebt. Hinweis: Die Fixierung wird sichergestellt, dass die Haut nicht von den Folien während der folgenden Verfahren und bewahren die Haut Morphologie abziehen. Achtung: Formalin ist ein Karzinogen und gefährlich; tragen Sie Handschuhe, lassen Sie es Ihre Haut berühren und führen Sie diesen Schritt in einem chemischen Abzug nicht.</li>
	<li>Waschen Folien mit mindestens 1 mL Phosphat gepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4, pro Folie entweder durch pipettieren oder eintauchen.</li>
</ol>3. Vorbereitung der Färbelösung
<ol><li>Wirbel zusammen Reagenzien für Laktat-Dehydrogenase Aktivität Färbung (50 mM Tris pH 7.4, 750 µM NADP, 80 µM phenazinderivat Methosulfate (PMS), 600 µM Nitrotetrazolium blaue Chlorid und 30 mM Laktat) in einem entsprechend großen Rohr abhängig von der Menge der Färbung Lösung benötigt. Hinweis: 1 mL ist ausreichend um eine Folie vollständig zu bedecken.</li>
	<li>Bereiten Sie eine zweite Lösung, in der alle Reagenzien außer NAD vorhanden sind. Bereiten Sie eine dritte Lösung, in der alle Reagenzien außer Laktat vorhanden sind.</li>
</ol>(4) inkubieren Sie Folien in Färbelösung
<ol><li>Sanft die Färbelösung pipettieren oder Control-Lösungen auf die vorbereiteten Folien, die im Abschnitt in seiner Gesamtheit (1 mL ist ausreichend für eine Folie). Wenn mehrere Folien zusammen verarbeitet werden, Tauchen alle Folien in der Färbelösung gleichzeitig (stellen Sie sicher, der Container hat genug Lösung Abschnitt Gewebe vollständig bedecken).</li>
	<li>Inkubieren Sie die Folien in eine feuchte Umgebung bei 37 ° C im Dunkeln. Wenn Färbelösung oben auf der Folie ist, legen Sie die Folie in eine feuchte Umgebung, um Verdunstung zu verhindern.</li>
</ol>5. Monitor Folien
<ol><li>Die Umwandlung von der Färbelösung von klar bis blau durch Sichtkontrolle zu überwachen. Wenn die Proben das gewünschte Maß an Bläue erreicht haben, stoppen Sie die Reaktion durch das Entfernen der Färbelösung. Hinweis: Für die Haut ist 10 Minuten ausreichend. Die Zeit hängt von der Orgel und die enzymatische Aktivität.</li>
	<li>Spülen Sie Folien mit Phosphat gepufferte Kochsalzlösung durch pipettieren (1 mL ist ausreichend für jede Folie) oder Tauchen. Hinweis: Alle Beispiele, die mit einander verglichen werden in Färbelösung für die gleiche Menge an Zeit einzuhalten.</li>
</ol>6. gegenfärbung und montieren
<ol><li>Pipettieren eine gegenfärbung auf den Objektträger, wenn die Folien ein angemessenes Maß an Bläue erreicht haben. Hinweis: Counterstains, die die Kerne rot oder Grün verwandeln bieten guten Kontrast mit dem Blau durch die Formazan Fällungsmittel erstellt.</li>
	<li>Mit wässrigen und nichtwässrigen Montage mittlerer22montieren. Ein bis drei Tropfen (40-50 µL) Eindeckmedium reicht je nach Größe des Deckglases.</li>
</ol>7. Bild Folien und quantifizieren
<ol><li>Bildfolien unter einem Lichtmikroskop. Nehmen Sie Fotos von experimentellen und Kontrollproben und alle negativen Kontrollen an 10 X, 20 X und 40 X Vergrößerung.</li>
	<li>Bestimmen Sie die Intensität der Bläue in verschiedenen Regionen mit Bildanalyse-Software.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren haben keine Interessenskonflikte offenzulegen.

Die hier beschriebene Methode kann verwendet werden, zur Überwachung der Tätigkeit des Laktat-Dehydrogenase oder andere metabolische Enzyme, die NADH oder NADPH, in verschiedenen Zelltypen innerhalb eines Gewebes oder verschiedene Teile eines Gewebes im Laufe der Zeit zu generieren. Laktat-Dehydrogenase ist ein wichtiges Enzym für das Verständnis der Biologie der Stammzellen und Tumoren, und die Fähigkeit, Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in einzelnen Zellen überwachen wird voraussichtlich wichtige Einblicke in die Funktio...

Die Standorte in den Geweben, in denen Enzyme hohe oder Niedrige Aktivität haben, zu verstehen ist wichtig für Verständnis Entwicklung und Physiologie. Abschrift oder Protein Ebenen dienen oft als Surrogate für enzymatische Aktivität. Während solche Studien informativ sein können, bieten sie keine Informationen, die entscheidend für die Bestimmung einer Enzym-Aktivität, wie Post-translationalen Modifikationen, die Anwesenheit von Protein-komplexe oder das Enzym subzelluläre Lokalisation sein können. Wenn die enzymatische Aktivität direkt gemessen wird, wird es oft in homogenisierte Protein Lysates überwacht, die nicht mehr Informationen über einzelne Zellen innerhalb der Mischung oder die räumliche Verteilung der Zellen mit hoher oder niedriger Aktivität innerhalb eines Gewebes enthalten.
Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatischen Aktivität innerhalb einer Gewebeprobe. Die Methodik basiert auf früheren Studien, die zeigen, dass tetrazoliumsalz Salze verwendet werden können, um die Aktivität der Dehydrogenases, Reduktasen und oxidasen in tiefgefrorenem Gewebe1zu lokalisieren. Mit diesen Methoden wird ein wasserunlösliches Formazan gebildet, wenn eine Tetrazolium Salz2,3Protonen übertragen werden. Glukose-6-phosphat Dehydrogenase NADPH und ein Proton generiert und mit tetrazoliumsalz Aktivität erkannt wurde. Glukose-6-phosphat-Dehydrogenase ist in Flunder Hepatozyten4, im alveolären Typ-2-Zellen der Lunge5 und Nephrone der Niere5überwacht worden. Tetrazoliumsalz Salze wurden auch zur Transketolase-Aktivität in tiefgefrorenem Gewebe6zu überwachen. Ein ähnlicher Ansatz wurde kürzlich verwendet, um die Aktivität von mehreren Dehydrogenases im gleichen Gewebe auf angrenzenden Folien7überwachen.
Wir beschreiben hier eine Methode um tetrazoliumsalz Salze verwenden, um die räumliche Verteilung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität (Abbildung 1) zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase wandelt Pyruvat durch Glykolyse, Laktat und die umgekehrte Reaktion erzeugt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist daher eine wichtige Determinante der Pyruvat Eingang in der Tricarboxylic Säure Zyklus gegen seine Sekretion wie Laktat. Laktat-Spiegel im Blut werden oft zur diagnose einer Reihe von Krankheiten, einschließlich Krebs8,9,10, denn es signalisieren kann, dass Krankheit oder Verletzung Zellen beschädigte hat und das Enzym freigegeben wurde.
Es gibt vier Laktat-Dehydrogenase Gene: LDHA, LDHB, LDHC und LDHD11. LDHA und LDHB werden gedacht, um aus der Duplizierung von einer frühen LDHA Gen12entstanden sind. LDH ist als ein Tetramer aktiv und LDHA und LDHB bilden Homotetramers und Heterotetramers mit einander. LDHA wird berichtet, haben höheren Affinität für Pyruvat, während LDHB haben höheren Affinität für Laktat und bevorzugt Laktat in Pyruvat13konvertieren berichtet wird. Der Projektträger LDHA enthält verbindliche Aufstellungsorte für die HIF1α, cMYC FOXM1 Transkription Faktoren11. Darüber hinaus kann wie viele andere glykolytischen Enzyme14,15, LDH durch Post-translationalen Modifikationen verändert werden. Fibroblasten-Wachstumsfaktor-Rezeptor 1 phosphorylieren kann LDHA Y10, das Tetramer Bildung fördert, oder Y83, die NADH Substrat Bindung16fördert. LDHA kann auch schimmelpilzschäden17. Aus diesen Gründen erfordert ein umfassendes Verständnis der LDH-Aktivität nicht nur LDH-Protein-Ebene, sondern auch die Enzym-Aktivität sowie Überwachung.
Neben der Methode, die wir hier präsentieren, wurden andere Ansätze zur Laktat-Dehydrogenase-Aktivität zu überwachen. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität kann spektralphotometrisch lysate homogenisierte Protein überwacht werden. Die Erzeugung von NADH wie Laktat in Pyruvat umgewandelt gemessen werden basierend auf Absorption bei 340 nm, während das Verschwinden von NADH überwacht werden kann, wie Pyruvat in Laktat18umgewandelt. Laktat-Dehydrogenase-Aktivität ist auch mit Magnetresonanz-Bildgebung (MRI) überwacht worden. 13 C-Pyruvat kann verabreicht werden, und die Umwandlung von Pyruvat zu Laktat kann überwacht werden, als das Verhältnis von [1 -13C] Laktat / [1 -13C] Pyruvat. Erhöhte Verhältnisse von [1 -13C] Laktat / [1 -13C] Pyruvat in Krebs Gewebe19eingehalten worden. Während MRT-basierte Ansätze über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in Normal und Krankheit Gewebe informieren können, haben die Methoden nicht die Auflösung benötigt, um die Aktivität in bestimmten Zellen zu bestimmen. Die Methodik, die hier zur Verfügung gestellten kann Informationen über Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Bereichen Gewebe und sogar in einzelnen Zellen.
Verwendung von in Situ Aktivität Assays, fanden wir, dass die Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den Haarfollikel Stammzellen der Maus Haut20ist. Wir nutzten auch die Methode zu überwachen die Aktivitäten der Laktat-Dehydrogenase in kultivierten Stammzellen und fand, dass die Aktivität in den Stammzellen über die Feeder-Schicht liegt. Schließlich überwacht die Tätigkeit der Laktat-Dehydrogenase in frischen Maus Aorta und Färbung in glatten Muskelzellen beobachtet. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in gefrorenen Maus Haut.

<table><tbody><tr><td>Chirurgische Instrumente</td><td></td><td></td><td>Zum Sammeln von Haut von euthanasierten Mäusen</td></tr><tr><td>Tissue-tek cryomold 25 mm x 20 mm x 5</td><td>mm Fisher Scientific</td><td>NC9511236</td><td>Zum Einfrieren von Mäusehaut</td></tr><tr><td>Tissue-Tek O.C.T. Compound</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9638938</td><td>Zur Montage von Kryoformen</td></tr><tr><td>Eiskübel</td><td>Fisher Scientific</td><td>07-210-106</td><td></td></tr><tr><td>Trockeneis</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Polysin-Adhäsionsfolie</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-78</td><td></td></tr><tr><td>4% Formalin</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td>In Wasser verdünnt</td></tr><tr><td>phosphatgepufferte Kochsalzlösung, pH 7,4</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Wirbel</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-245-684</td><td></td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7004</td><td></td></tr><tr><td>Phenazinmethosulfat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Nitrotetrazoliumblauchlorid</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Lithium-L-Laktat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2250</td><td>Substrat</td></tr><tr><td>37&deg; C-Inkubator (oder Gewebekultur-Inkubator)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Braziliant! Gegenbeize</td><td>Anatech</td><td>861</td><td>Gegenbeize</td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-5000&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Deckgläser für Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544D</td><td></td></tr><tr><td>Lichtmikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mapping-stoffwechsel: laktat-dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im gewebe

Mapping Metabolism: Monitoring Lactate Dehydrogenase Activity Directly in Tissue

Mapping enzymatische Aktivität in Raum und Zeit ist von entscheidender Bedeutung für das Verständnis der molekularen Grundlagen der Zelle Verhalten im normalgewebe und Krankheit. In Situ Stoffwechselaktivität Tests liefern Informationen über die räumliche Verteilung der metabolischen Aktivität innerhalb eines Gewebes. Wir bieten hier ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Aktivität des Enzyms Lactat Dehydrogenase direkt in Gewebeproben. Laktat-Dehydrogenase ist eine wichtige Determinante für ob konsumierten Glukose in Energie durch aerobe oder anaerobe Glykolyse umgewandelt wird. Eine Lösung mit Laktat und NAD ist ein gefrorenes Gewebe Abschnitt zur Verfügung gestellt. Zellen mit hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität konvertiert die bereitgestellten Laktat in Pyruvat, während gleichzeitig konvertieren, vorausgesetzt, Nicotinamid-adenin-Dinucleotide (NAD), NADH und ein Proton, die erkannt werden können auf die Reduzierung der Basis Nitrotetrazolium blau, Formazan, die als ein blauer Niederschlag visualisiert wird. Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll zur Überwachung der Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in der Maus Haut. Die Anwendung dieses Protokolls, fanden wir, dass Laktat-Dehydrogenase-Aktivität hoch in den ruhenden Haarfollikel Stammzellen in der Haut ist. Umsetzung des Protokolls zu embryonalen Stammzellen gezüchteten Maus zeigte höhere Färbung in kultivierten Stammzellen als Maus embryonalen Fibroblasten. Analyse der frisch isolierte Maus Aorta ergab Färbung in glatten Muskelzellen senkrecht zu der Aorta. Die Methodik zur Verfügung gestellt lässt sich räumlich zugeordnet werden die Aktivität von Enzymen, die ein Proton im gefrorenen oder frischen Gewebe erzeugen.

Wir haben bereits Ergebnisse für in Situ Aktivität Assays in Maus Haut20berichtet. Wie in Abbildung 3dargestellt, haben wir beobachtet, dass hoher Laktat-Dehydrogenase-Aktivität in den Haarfollikel Stammzellen an der Basis des Haarfollikels, wenn die Verfahren oben beschrieben befolgt wurden. Diese Ergebnisse wurden durch Fluoreszenz aktiviert Zelle Sortierung der Haut für Stammzellen Haarfollikel und bestätigt hohe Laktat-Deh...

Wir beschreiben ein Protokoll für die Zuordnung der räumlichen Verteilung der enzymatische Aktivität von Enzymen, die generieren Nicotinatmide Adenin Dinucleotide Phosphat (NAD(P)H) + H + direkt in Gewebeproben.

Mapping-Stoffwechsel: Laktat-Dehydrogenase Überwachungstätigkeit direkt im Gewebe

Mapping enzymatic activity in space and time is critical for understanding the molecular basis of cell behavior in normal tissue and disease. In situ ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der Biologie zu beantworten, wie z. B. die Aktivität von Enzymen an verschiedenen Stellen im Gewebe. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es dem Forscher ermöglicht, die enzymatische Aktivität direkt in den Gewebeproben nachzuweisen. Um diesen Vorgang zu starten, entfernen Sie die Haare der Maus mit einem Tierhaarschneider.Machen Sie mit einer Schere einen Schnitt in die Haut des Rückens. Heben Sie dann die Haut an und schneiden Sie sie ab. Füllen Sie anschließend den Cryomold mit Gefrierreagenzmasse.Legen Sie die Hautabschnitte mit einer Nadelzange in den Cryomold des Feldes. Richten Sie die Hautpartien so aus, dass der Querschnitt der Haut von der Epidermis bis zur Dermis, Unterhaut und zum Muskel sichtbar ist. Wenn möglich, montieren Sie die Versuchs- und Kontrollmäuse zusammen in demselben Cryomold, damit sie auf demselben Objektträger geschnitten und gemeinsam bearbeitet werden können.Achten Sie darauf, keine Blasen zu bilden. Legen Sie den Cryomold auf eine ebene Fläche aus einem Block Trockeneis in einem Eiskübel. Zur Lagerung stellen Sie den Cryomold in einen Gefrierschrank mit minus 80 Grad Celsius.Die Proben können etwa drei Monate lang im Gefrierschrank aufbewahrt werden, ohne dass es zu einem signifikanten Verlust der enzymatischen Aktivität kommt. Für die Schnitte schneiden Sie das Gewebe mit einem Kryostaten, der auf minus 20 Grad Celsius eingestellt ist, um sieben bis 10 Mikrometer dicke Schnitte für die beste Hautmorphologie zu erstellen. Bei diesem Verfahren wird der Satz von Objektträgern, die getestet werden sollen, festgelegt, der einen Kontrollobjektträger umfasst, auf dem NAD zurückgehalten wird, einen weiteren Kontrollobjektträger, auf dem das Substratlaktat zurückgehalten wird, und einen positiven Kontrollobjektträger aus einem zuvor untersuchten gefrorenen Gewebeblock.Fixieren Sie die Objektträger mit den Hautabschnitten fünf Minuten lang kurz mit 4 % Formalin. Waschen Sie dann die Objektträger mit PBS. Als nächstes werden die Reagenzien, einschließlich NADP, PMS, Nitrotetrazoliumblauchlorid und Laktat, für die Färbung der Laktatdehydrogenase-Aktivität in einem Röhrchen geeigneter Größe miteinander verfüttert.Bereiten Sie als Nächstes eine zweite Lösung vor, in der alle Reagenzien außer NAD vorhanden sind. Bereiten Sie anschließend eine dritte Lösung vor, in der alle Reagenzien außer Laktat vorhanden sind. Um die Objektträger und die Färbelösung oder Kontrolllösungen zu inkubieren, tauchen Sie sie gleichzeitig in die Lösung.Inkubieren Sie sie dann in einer befeuchteten Umgebung bei 37 Grad Celsius im Dunkeln. Überwachen Sie die Umwandlung der Färbelösung von klar in blau. Wenn die Proben den gewünschten Blaugrad erreicht haben, stoppen Sie die Reaktion, indem Sie die Färbelösung entfernen und mit PBS spülen.Anschließend wird eine Gegenfärbung auf die Objektträger aufgetragen, wenn die Objektträger einen angemessenen Blaugrad erreicht haben. Gegenfärbungen, die das Kernrot oder -grün färben, bieten einen guten Kontrast zu dem Blau, das durch den Formosan-Fällstoff erzeugt wird. Montieren Sie dann die Objektträger mit wässrigem oder nichtwässrigem Einbettmedium.Ein bis drei Tropfen Eindeckmedium sind je nach Größe des Deckglases ausreichend. Anschließend werden die Objektträger unter einem Lichtmikroskop abgebildet. Machen Sie Fotos von Versuchs- und Kontrollproben sowie allen Negativkontrollen mit 10-facher, 20- und 40-facher Vergrößerung.Die Intensität der Färbung nimmt mit der Zeit zu, wenn diese mit der Färbelösung inkubiert wird. Wie hier gezeigt, wurde eine hohe Laktatdehydrogenase-Aktivität in den Haarfollikel-Stammzellen an der Basis des Haarfollikels beobachtet. Kontrollproben, die das Laktatsubstrat nicht erhielten, zeigten keine Färbung.Diese Ergebnisse wurden durch eine fluoreszenzaktivierte Zellsortierung der Haut nach Haarfollikel-Stammzellen und die Bestätigung einer hohen Laktat-Dehydrogenase-Aktivität im Stammzellkompartiment mit der Aktivität auf sortierten Zellen bestätigt. Basierend auf den Erkenntnissen, dass Haarfollikel-Stammzellen eine hohe Laktat-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen, wurden kultivierte embryonale Stammzellen getestet. Embryonale Fibroblasten der Maus, die als Feeder-Schicht dienen, wurden in Gegenwart von embryonalen Stammzellen oder allein analysiert.Eine hohe Laktatdehydrogenase-Aktivität wurde in den embryonalen Stammzellen im Vergleich zu den embryonalen Fibroblasten der Maus beobachtet, wie zu verschiedenen Zeitpunkten gezeigt wurde. Das Färbeprotokoll wurde auch auf frisch isoliertes Gewebe angewendet. Aorten von Mäusen wurden präpariert.Die Proben wurden 10 Minuten lang mit Hanks ausgewogener Salzlösung mit 0,5 % Triton X inkubiert. Dann mit der Laktat-Dehydrogenase-Färbelösung für 10 Minuten. Die Bilder hier zeigen Laktatdehydrogenase-Lösung mit und ohne Laktat.Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, gefrorene Gewebescheiben mit intakter enzymatischer Aktivität zu verwenden, und die gefrorenen Blöcke sollten nicht zu alt sein. Wenn vorbereitete Abschnitte gelagert werden, sollten die Abschnitte nicht austrocknen. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die Laktatdehydrogenase-Aktivität in der Maushaut visualisieren können.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemie

Dieses Video beschreibt einen kolorimetrischen Assay zur Laktatmessung in Zelllysaten unter Verwendung des Enzyms Laktatdehydrogenase. Dieses Enzym wandelt Laktat in Pyruvat um, zusammen mit der Umwandlung von NAD in NADH, das mit Tetrazoliumfarbstoffen reagiert und ein farbiges Produkt ergibt, das spektrophotometrisch gemessen werden kann, um das Laktat zu quantifizieren.

Kolorimetrischer Assay zur Quantifizierung von Laktat in Testproben

Dieses Video zeigt den Laktatdehydrogenase, LDH-Assay zur Messung der zytotoxischen Wirkung einer Testsubstanz und ihrer Wirkung auf die Membranintegrität in menschlichen präzisionsgeschnittenen Lungenschnitten. Der Assay liefert ein quantitatives Maß für den Zelltod oder die Zellschädigung in der Probe.

Bewertung der Zytotoxizität und Membranintegrität in Lungenschnitten mittels Laktatdehydrogenase-Assay

Die dynamische Kernpolarisation mit anschließender Probenauflösung hat Echtzeitstudien des Stoffwechsels in biologischen Systemen ermöglicht. Hyperpolarisiertes [1-13C]pyruvat wurde verwendet, um die Laktatdehydrogenase-Aktivität in einer Prostatakarzinom-Zelllinie in vitro zu untersuchen.

hyperpolarisiertem 13 C Metabolic Magnetic Resonance Spectroscopy and Imaging

Hier präsentieren wir ein Protokoll, das verwendet werden kann, zu mikroskopisch visualisieren und Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben und die Kinetik, Funktion und subzelluläre Lokalisation zu quantifizieren.

Metabolische Mapping: Quantitative Enzym Cytochemistry und Histochemie die Aktivität des Dehydrogenases in Zellen und Geweben zu bestimmen

Hier ist eine einfache und gut validierte Protokoll zur Messung der Masse selbstverdauende Sequestrierung Aktivität in Säugetierzellen beschrieben. Die Methode basiert auf der Quantifizierung des Anteils der Laktat-Dehydrogenase (LDH) im Sedimentable Zelle Fraktionen gegenüber dem gesamten zellulären LDH Niveau.

Laktat-Dehydrogenase Sequestrierung Assay – Eine einfache und zuverlässige Methode zur Bestimmung Bulk Selbstverdauende Sequestration Aktivität in Säugerzellen

Hier teilen wir Methoden zur Messung der mitochondrialen Sauerstoffverbrauch, eine definierende Konzept der ernährungsphysiologischen Energetik und Proton Leck, die primäre Ursache der Ineffizienz im mitochondrialen Erzeugung von ATP. Diese Ergebnisse können entfallen 30 % der Energie verloren Nährstoff Auslastung zu helfen, mitochondriale Funktion ausgewertet werden soll.

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Hier präsentieren wir eine Zusammenstellung von Assays zur direkten Messung der mitochondrialen Funktion in Säugetierzellen, unabhängig von ihrer Fähigkeit, molekularen Sauerstoff zu verbrauchen.

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Hier stellen wir ein Protokoll vor, um den Transport von Monocarboxylaten, Glukose und ATP in Gliazellen und Neuronen unter Verwendung genetisch kodierter Förster-Resonanzenergietransfer-basierter Sensoren in einer ex-vivo-Drosophila-Larvenhirnpräparation zu visualisieren.

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Analyse des ex vivo metabolischen Flusses in Milz- und Herzmakrophagen und Knochenmarkmonozyten

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