Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen
10. August 2018
Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der kardialen Mechanobiologie zu beantworten, wie z. B. die Modulation der Scherspannung auf die Herztrabekulation durch Kerbsignalisierung mit einem 4D-Lichtblattmikroskop. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einen dünnen Schnitt der Probe mit einer Fünf-Mikrometer-Ebene beleuchtet, was zu weniger Photobleichen und Lichtschäden führt. Darüber hinaus ermöglicht uns unser Rechenalgorithmus, ein schlagendes 4D-Zebrafischherz zu rekonstruieren.
Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose angeborener Herzfehler, da sie die sequentielle In-vivo-Visualisierung der Herztrabekulation in einem frühen Entwicklungsstadium bis hin zum späteren Phänotyp ermöglicht. Im Allgemeinen werden Menschen, die neu in dieser Technik sind, feststellen, dass es schwierig ist, sich im Laufe der Zeit das Denken in drei Dimensionen vorzustellen. Darüber hinaus braucht es Zeit, das System zu erstellen und genau auszurichten.
Zu Beginn trennen Sie den männlichen und den weiblichen Zebrafisch in den Aufzuchtbecken mit einer Trennwand. Heben Sie dann die Trennwand an und lassen Sie den männlichen und weiblichen Zebrafisch brüten. Entnehmen Sie die Zebrafischembryonen und injizieren Sie Morpholino-Oligo in den Embryo, um die Trabekulation zu hemmen.
Bereiten Sie als Nächstes ein einprozentiges Agarose-Gel vor, indem Sie ein Gramm Agarose in 100 Milliliter destilliertes Wasser geben und erhitzen, bis sich die gesamte Agarose aufgelöst hat. Lassen Sie die Agarose abkühlen und befüllen Sie dann mit einer 20-Mikroliter-Pipette ein kleines Plastikröhrchen mit einem der vorbereiteten Embryonen und Agarose. Befestigen Sie den Tubus auf dem Mikroskoptisch und verwenden Sie das ten x Objektiv.
Stellen Sie das Objektiv mit dem Drehknopf so ein, dass die Oberseite des Embryos scharf ist. Nehmen Sie Bilder des gesamten Fischembryos über mehrere Herzschlagzyklen mit einer leichten Blattdicke von fünf Mikrometern auf. Sammeln Sie 500 xy-Frames mit einer Belichtungszeit von zehn Millisekunden.
Verschieben Sie dann den Tisch um einen Mikrometer im z-Zugang auf eine neue Schicht und wiederholen Sie den Bildgebungsvorgang. Fahren Sie fort mit der Vorstellung von 500 Bildern pro Z-Ebene, bis das gesamte Herz vollständig abgebildet ist. Öffnen Sie als Nächstes die Bildverarbeitungssoftware und beginnen Sie, die Bilder in 3D zu stapeln.
Klicken Sie dazu zunächst auf Open Data. Wählen Sie hier alle Bilder aus, die in 3D gestapelt werden sollen, und wählen Sie dann Laden. Fügen Sie dann die Voxelgröße von 0,65 x 0,65 mal einem Mikrometer hinzu und klicken Sie auf OK.
Die Eingabe der richtigen Voxelgröße ist für eine genaue Analyse der 3D-Bilder von entscheidender Bedeutung. Klicken Sie nun auf das Multiplaner-Ansichtsfeld und visualisieren Sie das 3D-Bild. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das blaue Slice One Dot Tiff-Feld, wählen Sie Anzeige und klicken Sie dann auf Volran.
Wählen Sie im Bearbeitungsmenü Optionen und dann Farbkarte bearbeiten. Passen Sie die Farbe mithilfe der Kästchen an und klicken Sie dann auf OK. Klicken Sie noch in der Bildbearbeitungssoftware auf Datei und öffnen Sie die Zeitreihendaten.
Wählen Sie die 3D-Tiffs aus, die gerade erstellt wurden, indem Sie auf Laden klicken, und geben Sie die gleiche Voxelgröße wie zuvor ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf das blaue Scheiben-TIFF-Feld mit einem Punkt, und wählen Sie dann Anzeigen gefolgt von Volran aus. Klicken Sie nun auf Bearbeiten.
Wählen Sie Optionen aus. Wählen Sie dann Farbkarte bearbeiten aus. Passen Sie die Farbe mithilfe der Kästchen an und klicken Sie dann auf OK.
Klicken Sie anschließend mit der rechten Maustaste auf das Zeitreihensteuerelement, klicken Sie auf Movie Maker, und drücken Sie die Wiedergabetaste, um den Film anzusehen. Fügen Sie zum Schluss einen Dateinamen, eine Bildgröße, eine Bildrate und eine Qualität ein, die eins ist, und geben Sie monoskopisch ein. Klicken Sie dann auf Übernehmen.
Exportieren Sie abschließend das Video. Biomechanische Kräfte, wie z. B. hämodynamische Scherspannungen, sind eng an der kardialen Morphogenese beteiligt. Hier wurde die Lichtblattfluoreszenzmikroskopie verwendet, um die in das Ventrikellumen ragenden Trabekelleisten 75 Stunden nach der Befruchtung sichtbar zu machen.
100 Stunden nach der Befruchtung ist deutlich ein trabekuläres Netzwerk zu erkennen. Bei einem Embryo, der mit der gata1aMO-Mikroinjektion behandelt wurde, sind die Hämatopoese und die Viskosität um 90 Prozent reduziert. Diese verringerte Viskosität schwächte die hämodynamische Scherspannung, was zu einer verzögerten Initiierung und einem weniger dichten Trabekelnetzwerk führte.
Diese Verzögerung und Dichte des trabekulären Netzwerks konnte durch Hochregulierung der kerbbedingten Genexpression wiederhergestellt werden, wodurch die Trabekelbildung 75 Stunden nach der Befruchtung und 100 Stunden nach der Befruchtung gerettet wurde. So reduzierten gata1a-Morpholino-Oligonukleotide die hämodynamischen Kräfte, was zu einer Herunterregulierung des Notch-Signalwegs führte, während Nrg1-mRNA regulierte Notch-bezogene Gene rettete und die Trabekulation wieder in Gang setzte. Einmal gemeistert, kann diese bildgebende Technik in etwa zwei Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig durchgeführt wird.
Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Herzentwicklung, um die Faktoren im Kerb-Gen zu untersuchen, die für die korrekte Bildung der Trabekulation beim Zebrafisch verantwortlich sind. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie Bilder mit selektiver Ebenenbeleuchtungsmikroskopie aufnehmen und 4D-Bilddateien erstellen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Lasern äußerst gefährlich sein kann.
Und Vorsichtsmaßnahmen, wie z. B. das Tragen einer geeigneten Brille, sollten während dieses Eingriffs immer getroffen werden.
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Übersicht
Dieser Artikel stellt ein Protokoll zur Visualisierung sich entwickelnder Herzen in Zebrafischen mittels 4-D Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM) vor. Die Methode ermöglicht die Rekonstruktion der Herzentwicklung über die Zeit und zeigt die Rolle der Scherspannung bei der Aktivierung der endokardialen Notch-Signalübertragung während der Kammerentwicklung.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Entwicklungsbiologie
- Kardiale Mechanobiologie
- Bildgebungstechniken
Hintergrund
- Das Verständnis der Herzentwicklung ist entscheidend für die Diagnose angeborener Herzerkrankungen.
- Scherspannung beeinflusst die kardiale Trabekulierung durch Notch-Signalübertragung.
- 4-D-Bildgebung bietet Einblicke in dynamische biologische Prozesse.
- Lichtblattmikroskopie minimiert Photobleichung und Schäden.
Zweck der Studie
- Visualisierung der Herzentwicklung in Zebrafischen in Echtzeit.
- Untersuchung der Auswirkungen von Scherspannung auf die kardiale Trabekulierung.
- Entwicklung eines Computeralgorithmus für 4-D Herzrekonstruktion.
Verwendete Methoden
- 4-D Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie (LSFM).
- Rekonstruktion von schlagenden Zebrafischherzen unter Verwendung von Computeralgorithmen.
- Sequenzielle Visualisierung von Herzentwicklungsstadien.
- Analyse der Auswirkungen von Scherspannung auf die Notch-Signalübertragung.
Hauptergebnisse
- Scherspannung aktiviert die endokardiale Notch-Signalübertragung während der Herzkammerentwicklung.
- Die 4-D-Bildgebungstechnik ermöglicht eine detaillierte Beobachtung der kardialen Trabekulierung.
- Reduzierte Photobleichung und Schäden verbessern die Bildqualität.
- Die Methode hilft beim Verständnis der Mechanismen angeborener Herzerkrankungen.
Schlussfolgerungen
- Die 4-D LSFM-Technik ist ein leistungsfähiges Werkzeug zur Untersuchung der Herzentwicklung.
- Die gewonnenen Erkenntnisse könnten zu besseren Diagnosemethoden für angeborene Herzerkrankungen führen.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Bereiche der Entwicklungsbiologie erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
Understanding hemodynamic forces in cardiac development provides mechanistic insights into congenital heart disease pathways, supporting target validation in preclinical models. Light-sheet fluorescence microscopy enables quantitative, dynamic visualization of shear stress effects on Notch signaling, a pathway implicated in ventricular non-compaction. This approach enhances predictive confidence in early discovery by linking biomechanical inputs to molecular outputs in a disease-relevant system.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates the causal relationship between hemodynamic shear stress and Notch signaling in trabeculation formation.
- Operational Value: Enables phenotypic screening of genetic and pharmacological modulators of cardiac morphogenesis.
- Scientific Value: Supports mechanistic de-risking by visualizing how reduced shear stress down-regulates Notch target genes and attenuates trabeculation.
- Operational Value: Facilitates rescue experiments, such as Nrg1 mRNA co-injection, to confirm target pathway specificity and reversibility.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative 4-D readouts of trabecular density and initiation timing for dose-response analysis.
- Operational Value: Standardizes imaging protocols across experimental conditions using synchronized light-sheet acquisition and voxel-based reconstruction.
- Scientific Value: Enables shear stress modulation via gata1a-MO to create controlled hypodynamic conditions for assay validation.
- Operational Value: Produces scalable, reproducible 3D+time datasets suitable for high-content analysis pipelines.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Connects endothelial Notch gene expression under pulsatile flow to in vivo trabeculation phenotypes, strengthening translational continuity.
- Operational Value: Provides a preclinical zebrafish model for studying Left Ventricular Non-Compaction Cardiomyopathy mechanisms.
- Scientific Value: Enables risk-adjusted advancement decisions by correlating molecular rescue (e.g., Nrg1) with phenotypic recovery of trabeculation.
- Operational Value: Supports cross-functional collaboration through shared 4-D visualization platforms for cardiology, genetics, and bioengineering teams.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into early discovery workflows by enabling hypothesis testing of mechanotransduction pathways in cardiac development, bridging phenotypic screening to target validation.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by visualizing how shear stress modulates Notch signaling during ventricular chamber formation.
- Screening: Delivers assay-ready, quantitative outputs on trabecular network dynamics for compound or genetic modifier evaluation.
- Analytics: Generates synchronized 4-D image stacks with voxel-scale precision, enabling statistical comparison of hemodynamic conditions.
- Translational Research: Links in vivo trabeculation phenotypes to in vitro endothelial flow responses, supporting biomarker alignment studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable imaging platform for studying hemodynamic influences across developmental and disease models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanobiological pathway interpretation.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through synchronized 4-D acquisition and computational reconstruction.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by enabling early phenotypic assessment of cardiac morphogenesis modifiers.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of targets involved in shear stress-Notch-trabeculation axes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish embryology, microinjection techniques, and light-sheet microscopy alignment.
- Dependent on specialized instrumentation including selective plane illumination microscopy and high-speed sCMOS cameras.
- Necessitates cross-team standardization of image acquisition parameters, voxel sizing, and time-series synchronization.
- Involves adaptation considerations when translating protocols across different genetic backgrounds or disease models.
- Limited by the physical accessibility of the embryonic heart and the need for precise temporal sampling across cardiac cycles.
