FM-Farbstoff Radfahren an der Synapse: Vergleich hohen Kalium Depolarisation, elektrische und Channelrhodopsin Stimulation

Das übergeordnete Ziel dieses Experiments ist es, den Endo- und Exozytosezyklus von synaptischen Vesikeln an der Lebendpräparation der neuromuskulären Verbindung der Drosophila-Larve unter Verwendung von fluoreszierenden FM-Farbstoffen zu beobachten. Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Neurowissenschaften zu beantworten, z. B. welche Gene für die Funktion des synaptischen Vesikelzyklus entscheidend sind. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Sie den Vesikelzyklus in einem Lebendpräparat mit drei verschiedenen Arten von Reizen, hoher Kaliumdepolarisation, elektrischer Stimulation oder mit Hilfe der Optogenetik optisch verfolgen können.

Zu diesem Verfahren wird der Anti-HRP-Antikörper, der an ein Lexoflor 647 konjugiert ist, in die Präpariersalzlösung gegeben. Als nächstes fügen Sie der Dissektionskammer einen elastomerbeschichteten Deckglas hinzu und fügen Sie dann die Präparierlösung mit HRP-Antikörper zur Markierung des präsynaptischen NMJ-Terminals während der Dissektion hinzu. Übertragen Sie mit einem feinen Pinsel ein wanderndes drittes Instar aus dem Lebensmittelfläschchen auf ein elastomerbeschichtetes Deckglas.

Füllen Sie dann eine Mikropipettenspitze aus Glas mit einer kleinen Menge Klebstoff unter Verwendung eines vom Mund erzeugten Unterdrucks. Anschließend positionieren Sie die Larven mit der Rückenseite nach oben mit einer Pinzette und kleben den Kopf mit einem kleinen Tropfen Kleber unter Verwendung von positivem Luftdruck mit dem Mund auf den elastomerbeschichteten Deckglas. Wiederholen Sie diesen Vorgang mit dem hinteren Ende der Larven und achten Sie darauf, dass das Tier zwischen den beiden Klebeansätzen straff gespannt ist.

Machen Sie mit einer Schere einen Millimeter horizontalen Schnitt an der hinteren und einen vertikalen Schnitt entlang der dorsalen Mittellinie. Entfernen Sie dann vorsichtig die dorsale Luftröhre, den Darm, den Fettkörper und andere innere Organe, die die Muskulatur bedecken. Wiederholen Sie den Klebevorgang für die vier Korpuswandklappen und achten Sie darauf, den Korpus sowohl horizontal als auch vertikal sanft zu dehnen.

Heben Sie anschließend den VNC an und schneiden Sie vorsichtig mit der Schere die motorischen Nerven ab und entfernen Sie den VNC vollständig. Ersetzen Sie die Dissektionskochsalzlösung durch kalziumfreie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen. Bereiten Sie für die elektrische Stimulation eine Saugpipette mit dem Mikroelektrodenabzieher vor, um die erforderliche Verjüngung und Spitzengröße zu erhalten.

Anschließend polieren Sie die Mikroelektrodenspitze mit einer Mikroschmiede, um einen festen Sitz zu erzeugen, wenn ein einzelner motorischer Nerv aufgesaugt wird. Schieben Sie die Saugpipette auf den Elektrodenhalter eines Mikromanipulators, der an einem langen, flexiblen Kunststoffschlauch und einer Spritze befestigt ist. Geben Sie anschließend das Präparat mit FM-Farbstoff auf den Mikroskoptisch und heben Sie den Tisch an, bis die Larven und die Saugpipette scharf gestellt sind.

Saugen Sie dann eine Schleife aus durchtrenntem motorischen Nerv auf und innervieren Sie das ausgewählte Hemi-Segment mit negativem Luftdruck, der von der Spritze erzeugt wird, in die Saugelektrode. Stimulieren Sie anschließend den motorischen Nerv mit den ausgewählten Parametern, um die SV-Endozytose und die Aufnahme des FM 143-Farbstoffs zu steuern. Der kritischste Schritt an dieser Stelle des Verfahrens besteht darin, ein einzelnes Motoraxon fest in die Saugelektrode zu saugen.

Dies kann einige Versuche und Irrtümer erfordern. Sobald eine geeignete Saugelektrode gefunden wurde, verwenden Sie dieselbe für alle verglichenen Bedingungen, um eine konsistente Stimulationsbelastung zu gewährleisten. Für die Entladung des FM-Farbstoffs saugen Sie denselben motorischen Nerv in dieselbe Elektrode und stimulieren Sie dann den motorischen Nerv, um die SV-Exozytose und die Freisetzung des FM 143-Farbstoffs zu aktivieren.

Für die Stimulation von Kanalrhodopsin befestigen Sie eine blaue LED mit einem Koaxialkabel an einem programmierbaren Stimulator und platzieren Sie die LED in den Kameraanschluss. Fokussieren Sie den blauen LED-Lichtstrahl mit FM-Farbstoff auf das Präparat mit der Zoomfunktion des Mikroskops. Der wichtigste Schritt zu diesem Zeitpunkt des Verfahrens besteht darin, sicherzustellen, dass die LED-Einstellungen konstant bleiben und dass Sie unter allen verglichenen Bedingungen denselben Teil jedes Tieres beleuchten, um eine konsistente Stimulationsbelastung zu gewährleisten.

Starten Sie die Lichtstimulation und verfolgen Sie mit dem Timer für die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode. Wenn der Timer stoppt, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und ersetzen Sie sie durch kalziumfreie Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen. Starten Sie nach dem Entladen des FM-Farbstoffs die Lichtstimulation und verfolgen Sie mit einem Timer die vorgegebene Dauer der optogenetischen Stimulationsperiode.

Wenn die Timer-Periode abgelaufen ist, entfernen Sie schnell die FM-Farbstofflösung und geben Sie sie mit kalziumfreier Kochsalzlösung, um den SV-Zyklus zu stoppen. Um das fluoreszierende Bild zu quantifizieren, laden Sie es in Bild J und erstellen Sie eine Projektion mit maximaler Intensität, indem Sie auf Bild, Stapel, Z-Projekt klicken, dann mit dem Anti-HRP 647-Kanal zu Bild, Anpassen, Schwellenwert wechseln und die obere Symbolleiste verschieben, bis nur noch der NMJ hervorgehoben ist. Klicken Sie mit dem Zauberstab-Werkzeug auf den NMJ.

Wenn der NMJ unterbrochen ist, halten Sie die Umschalttaste gedrückt und wählen Sie alle Teile aus. Ändern Sie dann das Bild in den Färbekanal FM 143 und gehen Sie zu Analysieren, Messen, um die Fluoreszenzmessung zu erhalten. Wiederholen Sie diese Schritte für das entladene Bild aus demselben NMJ.

Die Fluoreszenz FM 143 kann zur Visualisierung über TEM in einen oxidierten DAB-Elektronendichtniederschlag photokonvertiert werden. Hier ist ein schematisches Diagramm der Photokonversionsmethode zur Markierung des Drosophila NMJ nach aktivitätsabhängiger FM 143-Farbstoffbeladung. Dies ist ein repräsentatives TEM-Bild eines synaptischen Boutons vom Wildtyp in Ruhe, das eine dichte Population von SVs in einheitlicher Größe zeigt.

Diese Bilder zeigen die synaptischen Boutons, die fünf Minuten lang ohne Photokonversion oder mit FM 143-Photokonversion mit hoher Kaliumsalzlösung stimuliert wurden. Hier sind die Bulk-End-Homo-Strukturen zu beobachten. Und diese Bilder zeigen die synaptischen Boutons, die mit der Nervensaugelektrode bei 20 Hertz für fünf Minuten ohne Photokonversion oder mit FM 143 Photokonversion elektrisch stimuliert wurden.

Beachten Sie, dass die mit Farbstoffen beladenen Vesikel viel dunkler erscheinen als benachbarte unbeladene Vesikel. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man eine Larvenleimdissektion sowie das Be- und Entladen von FM-Farbstoffen mit hoher Kaliumdepolarisation, elektrischer Stimulation und optogenetischer Kanalrhodopsinstimulation durchführt. Seit der ersten Synthese von FM-Farbstoffen durch Fei-Mao wurden diese vielseitigen Farbstoffe verwendet, um die aktivitätsabhängige Mobilisierung verschiedener Vesikelpools zu untersuchen, um den Unterschied zwischen und Clathrin-vermittelter Endozytose zu untersuchen, sowie evozierte, spontane und miniaturisierte synaptische Aktivitäten zu untersuchen.

Es gibt viele Faktoren, die bei diesem Experiment zu berücksichtigen sind. Um nur einige zu nennen, die externe Kalziumkonzentration, die Art der Stimulationsmethode, die Sie verwenden, sowie die Zeit, wie lange der FM-Farbstoff während der Aufnahme- und Freisetzungsschritte geladen und entladen werden muss. Bitte berücksichtigen Sie diese Faktoren sorgfältig, wenn Sie Ihr eigenes Experiment planen.

Viel Glück!