Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Der Hauptvorteil dieser Technologie ist, dass sie eine schnelle Bildgebung des Mausherzes ermöglicht. Und es kann verwendet werden, um das Vorhandensein von Luftkanälen nach der Gentherapie zu beobachten. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Entwicklungskardiologie geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Neurologie und Pulmonologie angewendet werden.

Im Allgemeinen werden Individuen mit dieser Technik kämpfen, weil die Montage einer Bildgebung des erwachsenen Mausherzes schwierig sein kann, und es unterscheidet sich von anderen, traditionellen Techniken, wie konfokale und invertierte Mikroskopie. Platzieren Sie einen kontinuierlichen Wellenlaser mit drei Wellenlängen von 405 Nanometern, 473 Nanometern und 532 Nanometern. Befestigen Sie dann spiegelbildeinen und richten Sie ihn bei 45 Grad am Balken aus.

Dadurch wird der Laser auf den Strahlteiler geleitet, der die beidseitige Beleuchtung bildet. Als nächstes passieren Sie den Strahl durch einen Neutraldichtefilter mit einem Durchmesser von 50 Millimetern, einen Strahlexpander und eine Lochbohrung mit einem Durchmesser von 25 Millimetern, die alle 150 Millimeter voneinander entfernt sind. Passieren Sie den Strahl durch einen 50-50 StrahlSplitter, 150 Millimeter vom Loch platziert.

Als nächstes legen Sie den Spiegel zwei 150 Millimeter vom Balkenteiler bei 90 Grad bis zum Vorwärtsstrahl auf und richten Sie ihn so aus, dass sich seine Spiegelebene in einem 45-Grad-Winkel zum Strahl befindet. Platzieren Sie dann den Spiegel drei 100 Millimeter von Spiegel zwei, und richten Sie ihn so aus, dass seine Spiegelebene in einem 45-Grad-Winkel zum Vom 2. Spiegel reflektierten Strahl ist. Verwenden Sie diesen reflektierten Strahl, um eine Seite der Doppeltenbeleuchtungslichtplatte zu bilden.

Platzieren Sie auf der anderen Seite des Strahlteilers den Spiegel fünf, sodass seine Spiegelebene bei 45 Grad zum Strahl liegt, der in Vorwärtsrichtung emittiert wird. Verwenden Sie den strahlemittierten Strahl von Spiegel fünf, um die zweite Seite der doppelten Beleuchtungsanzeige zu bilden. Als nächstes richten Sie das doppelseitige Beleuchtungssystem systemisch ein.

Platzieren Sie die zylindrische Linse zwei 150 Millimeter vom Spiegel drei entfernt und eine weitere identische zylindrische Linse 150 Millimeter vom Spiegel fünf entfernt, auf der anderen Seite des Dual-Beleuchtungs-Setups. Als nächstes platzieren Sie zwei Spiegel, die jeweils in Der Linie mit den zylindrischen Linsen sind, in Entfernungen von 50 Millimetern, um den Strahl bei 90 Grad zu reflektieren. Auf beiden Seiten des Lichtbogens bilden Sie aus einem Linsenpaar ein achromatisches Doublet, wobei die erste Linse 100 Millimeter vom vorherigen Spiegel entfernt platziert wird und einen Durchmesser von einem Zoll und eine Brennweite von 100 Millimetern hat.

Die zweite Linse sollte 160 Millimeter von Linse eins mit einem Durchmesser von einem Zoll und einer Brennweite von 60 Millimetern platziert werden. Platzieren Sie dann die Beleuchtungsziele ein und zwei 150 Millimeter von den vorherigen achromatischen Doublets, so dass sie dem Strahl entsprechen. Der von den Objektiven emittierte Strahl bildet die Lichtplatte für die Abbildung der Proben.

Bereiten Sie zunächst die fluoreszierende Perlenprobe vor, indem Sie eine 0,53 Mikrometer-Perlenlösung, eins bis 150.000, in einer vorgewärmten Brechungsindex-Matching-Lösung mit einem Prozent niedriger Schmelze zeigender Agarose verdünnen. Als nächstes verwenden Sie ein Stück Borosilikatglasschläuche mit einem Innendurchmesser von 12 Millimetern und einem Außendurchmesser von 18 Millimetern bis zu einer Länge von 30 Millimetern. Die Perlenagaroselösung in den Borosilikatschläuchen anpfeifen und die Agarose bei Raumtemperatur erstarren lassen.

Füllen Sie nun eine 3D-gedruckte ABS-Kammer mit einer 99,5-prozentigen Gylcerol-Lösung. Legen Sie die Borosilikatglasschläuche, die die Perlen enthalten, in die Kammer. Befestigen Sie eine motorisierte 3D-Übersetzungsstufe an den Borosilikatglasschläuchen, um die Bewegung und Ausrichtung der Probe innerhalb der ABS-Kammer zu steuern.

Verwenden Sie dann eine maßgeschneiderte Software, um Bilder mit der sCMOS-Kamera mit einer Rate von 30 Bildern pro Sekunde zu erfassen. Bewegen Sie die Probe mit dem Motorregler um einen Millimeter in seitliche Richtung, und erfassen Sie Bilder in jedem Schrittvon 1 Millimeter, bis die gesamte Probe abgebildet ist. Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungssoftware und messen Sie die Punktstreufunktion des Systems anhand dieser Perlenbilder.

Verwenden Sie eine Refractive Index Matching-Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 und lösen Sie ein Prozent Agarose in die passende Lösung auf. Legen Sie eine gelöschte Erwachsenenmaus-Herzprobe in die Brechungsindex-Matching-Lösung, wobei ein Prozent Agarose aufgelöst wird. Dann legen Sie die Probe in Borosilikatglasschläuche ein und lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur erstarren.

Befestigen Sie eine 3D-motorisierte Translationsstufe an den Borosilikatglasschläuchen, um die Bewegung und Ausrichtung der Probe in einer 3D-gedruckten ABS-Kammer zu steuern. Positionieren Sie die Probe so, dass sie sich in der Mitte des Gaußschen Strahls befindet, der durch das duale Beleuchtungssystem erzeugt wird. Legen Sie dann die Erfassungsrate der sCMOS-Kamera auf 30 Bilder pro Sekunde fest.

Bewegen Sie nun mit dem Motorregler die Probe um einen Millimeter in axiale Richtung und erfassen Sie Bilder in jedem Schrittschritt von einem Millimeter. Fahren Sie fort, bis das gesamte Beispiel abgebildet wurde. Stapeln Sie die erfassten Bilder mit einer Visualisierungssoftware.

Entwickeln Sie die 3D-Images mit diesen Bildstapeln. Um dies zu erreichen, dekonvolve die Punkt-Spread-Funktion zuvor bestimmt, und verwenden Sie es für die erworbenen Image-Stacks. Legen Sie schließlich einen Pixelschwellenwertfürstintensitätswert fest, um die Konturen des Herzens zu beobachten, und fügen Sie den Bildern basierend auf dieser Graustufenintensität Pseudofarbe hinzu.

Am ersten Tag nach der Geburt kann man unter anderem die Ventile, das Atrium, die Herzkammer, den Brustmuskel und die Trabeekulation visualisieren. Am siebten Tag nach dem Geburt sind die Merkmale noch definierter. Das Atrium, ventrikel, ventrikuläre Hohlraumabmessungen und VentrikelWanddicke sind alle offensichtlich.

Um die Kardiomyozytendifferenzierung im Herzen zu untersuchen, wurden heterozygote Knock-in-Mäuse mit der Kreide versehen, um Kardiomyozyten zu zeigen. Die beschrifteten Zellen werden hier in jeder Ebenenrichtung angezeigt. Die drei Ebenen wurden zusammengeführt, um eine 3D-Wiedergabe des Herzens zu erzeugen.

Der rot umkreiste Bereich innerhalb des Einsatzes zeigt zwei durchscheinende Mausherzen, nachdem sie sich der Klarheitstechnik unterzogen und in den Borosilikatglasschlauch eingeführt wurden. Neben der Untersuchung von postnatalen Mäusen kann das Bildgebungssystem auch verwendet werden, um das erwachsene Mausherz zu untersuchen. Hier werden GFP-markierte ROMK-Kanäle mit 7,5 Monaten angezeigt.

Diese fanden sich hauptsächlich in der ventrikulären Wand. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Minuten durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Blasen um die Probe im Rohr zu entfernen.

Andere Methoden, wie die automatische Segmentierung der Bildstapel, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Verletzungen und Regeneration zu beantworten. Nach seiner Entwicklung wurde diese Technik von Forschern verwendet, um die Herzarchitektur in postnatalen und erwachsenen Entwicklungsstadien bei Mäusen zu untersuchen.