Name: Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 42 s
Description: Erfahren Sie Licht-Blatt-Fluoreszenzmikroskopie für die Kardiologie mit optischer Klärung am murinen Herzen. Diese Methode ermöglicht schnelle Bildgebung und Beobachtung struktureller Veränderungen nach Gentherapie.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Die Autoren möchten Thao Nguyen und Atsushi Nakano von der UCLA danken für die Bereitstellung der Mäuse Probe Bild. Diese Studie wurde unterstützt durch Zuschüsse NIH HL118650 (um Tzung K. Hsiai), HL083015 (zu Tzung K. Hsiai), HD069305 (zu N. C. Chi Tzung K. Hsiai.), HL111437 (zum Tzung K. Hsiai und N. C. Chi), HL129727 (zu Tzung K. Hsiai) und University of Texas System STARS Mittel (für Juhyun Lee).

Alle Verfahren, die die Verwendung von Tieren wurden durch institutionelle Review Komitees (IACUC) an der University of California, Los Angeles, Kalifornien genehmigt.
(1) Imaging-System-Setup
Hinweis: Siehe Abbildung 1 und Abbildung 2.
<ol><li>Einen kontinuierliche Welle (CW)-Laser mit 3 Wellenlängen abrufen: 405 nm, 473 nm und 532 nm. Platz 2 Spiegel (M1 und M2) 150 mm auseinander und richten Sie sie mit ihren Spiegelebenen um 45° zum Strahl. Hinweis: Dieser Schritt wird durchgeführt, um den Laser entfernt das beidseitige Beleuchtung Setup umleiten. Der resultierende Strahl wird in die gleiche Richtung wie der erste Strahl sein.</li>
	<li>Übergeben Sie den Strahl durch ein 25-mm-Durchmesser Irisblende/Lochkamera (PH), einen Durchmesser von 50 mm Graufilter (NDF) mit einer optischen Dichte-Bereich von 0 - 4.0, ein Strahl-Expander (BE), 30 mm Schlitz (S) mit der Breite von ~ 0 - 6 mm und einem Spiegel (M3) , alle 150 mm voneinander positioniert. Platzieren Sie den Spiegel mit der Spiegelebene auf 45° zum Balken.</li>
	<li>Übergeben Sie den Strahl durch ein 50: 50 Strahlteiler platziert 150 mm vom M3. Setzen Sie einen Spiegel (M6) 150 mm von der Strahlteiler und richten Sie es so dass die Spiegelebene auf 45° zum Balken, die in Vorwärtsrichtung ausgegeben wird. Verwenden Sie den reflektierten Strahl, um der Dual-Beleuchtung-Licht-Blatt zu bilden.</li>
	<li>Setzen Sie einen Spiegel (M4) 150 mm von der Strahlteiler und richten Sie es so dass die Spiegelebene auf 45° zum Balken, die in einem 90 °-Winkel von der Strahlteiler emittiert wurde. Setzen Sie einen zweiten Spiegel (M5) 150 mm von der M4 und richten Sie es so aus, dass die Spiegelebene auf 45° zu den Strahl von M6 reflektiert wird. Verwenden Sie den Strahl emittiert von M5 auf der zweiten Seite des Dual-Beleuchtung Licht Bogens bilden.</li>
	<li>Die beidseitige Beleuchtungssystem in einer symmetrischen Weise einrichten (siehe Abbildung 1). Legen Sie eine Zylinderlinse (CL1) [Durchmesser (d) = 1; Brennweite (f) = 50 mm] 150 mm im Einklang mit den Strahl emittiert von M5 einerseits mit einer anderen identisch Zylinderlinse (CL2) 150 mm im Einklang mit der Strahl von M6 auf der anderen Seite des Dual-Beleuchtung Setu emittiert p. Platz 2 Spiegel (M7 und M8) jeweils im Einklang mit der Zylinderlinsen im Abstand von 50 mm bis den Strahl im 90 °-Winkel zu reflektieren.</li>
	<li>Bilden Sie eine achromatische Wams aus einem Paar von Linsen. Legen Sie das erste Objektiv, L1 (d = 1; f = 100 mm), 100 mm von M7 und die zweite Linse L2 (d = 1; f = 60 mm), 160 mm von L1. Wiederholen Sie dies auf der anderen Seite der Dual-Beleuchtung mit identischen Linsen (L3, L4) den gleichen Abstand von M8 platziert.</li>
	<li>Statt Spiegel, M9 und M10, 60 mm von Linsen L2 und L4, bzw., und im Einklang mit den Strahl. Legen Sie die Beleuchtung Ziele, OL1 und OL2 (d = 2; f = 150 mm), 150 mm M9 und M10 und im Einklang mit den Strahl. Der Strahl emittiert von den Zielen bildet das leichte Blatt für die Proben-Bildgebung.</li>
	<li>Verwenden Sie einen 3-d-Drucker zum Drucken der Probenhalter aus Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS). Eine Stück Deckglas einbetten [Brechungsindex (RI) = 1.4745] auf jeder Seite der Kammer, senkrecht zur Beleuchtung Strahl, Brechungsindex Fehlanpassungen zu minimieren. Platzieren Sie gleichmäßig die Kammer zwischen die Balken von der Objektivlinsen emittiert.</li>
	<li>Installieren Sie ein Stereo-Mikroskop mit 1 X Vergrößerung Objektive und eine wissenschaftliche komplementäre Metalloxid-Halbleiter (sCMOS) Kamera senkrecht bis hin zur Beleuchtung Flugzeug (siehe Abbildung 2).</li>
</ol>(2) Imaging System-Kalibrierung
<ol><li>Abrufen von fluoreszierenden Polystyrol-Kügelchen, die 0,53 µm im Durchmesser sind.</li>
	<li>Bereiten Sie die fluoreszierende Bead Probe durch Verdünnung der Wulst-Lösung im Brechungsindex passende Lösung (Felgen vor) mit 1 % niedrig schmelzend zeigenden Agarose, 1: 150, 000. Schneiden Sie ein Stück von Borosilikatglas Schläuche mit einem Innendurchmesser von 12 mm und einem Außendurchmesser von 18 mm auf einer Länge von 30 mm. Hinweis: Borosilikat-Glasröhren wird verwendet, um den Brechungsindex (1,47) übereinstimmen.</li>
	<li>Mischen Sie die verdünnte Bead Probe mit 1 % Agarose und pipette die Perle/Agarose-Lösung in den Borosilikat-Schlauch. Lassen Sie die Agarose, bei Zimmertemperatur (23 ° C) zu festigen.</li>
	<li>Füllen Sie die ABS-Kammer (aus Schritt 1,7) mit einer 99,5 % Glycerin-Lösung. Legen Sie die Borosilikatglas-Schläuche mit den Kügelchen im Inneren der Kammer. Legen Sie der ABS-Kammer in dem abbildenden System, so dass es in der Mitte des Gaußschen Strahls durch die doppelte Beleuchtungssystem geschaffen.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 3-d-motorisierte translationale Phase Borosilikat-Glasröhren zur Steuerung der Bewegung und Ausrichtung der Probe in der ABS-Kammer (siehe ergänzende Abbildung1).</li>
	<li>Bilder mit der Kamera sCMOS mit einer Rate von 30 Frames pro Sekunde (fps) zu erwerben. Mit der Motorsteuerung, die Probe 1 mm in seitlicher Richtung bewegen und Abrufen von Bildern bei jeweils 1 mm Inkrement sCMOS Kamera benutzen. Fortgesetzt, bis die gesamte Stichprobe abgebildet worden.</li>
	<li>Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). Messen Sie die Point-spread-Funktion (PSF) des Systems über diese Perle Bilder. Verwenden Sie diese PSF für Dekonvolution während der Bildverarbeitung in späteren Schritten.</li>
</ol>3. die Probenvorbereitung
<ol><li>Sezieren Herzen aus einem Wild-Typ P1-Maus und eine doppelte heterozygot Sarcolipin-Cre knockin Maus mit dem Rosa26-YFP-gen (SlnCre / +; R26YFP Reporter / +) auf P7. Hinweis: Euthanasie erfolgte mittels Pentobarbital und die Technik von Robbins Et Al. beschrieben 10. die Präparation erfolgte nach der Technik von der National Heart, Lung und Blood Institute (NHLBI)10,11beschrieben.</li>
	<li>Führen Sie eine chemische Reinigung der murinen Herzen wie von Kevin Sung Et Al. beschrieben 12. Hinweis: Die folgenden Schritte sollten in einem Abzug durchgeführt werden, da die verwendeten Chemikalien giftig sind.<ol>
<li>Spülen Sie die Herzen in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) 3 X 10 min. lang. Nach dem Spülen, legen Sie die Herzen in einen 4 % Paraformaldehyd Lösung und inkubieren Sie diese Proben bei 4 ° C über Nacht.</li>
		<li>Legen Sie die Proben in einer 4 % Acrylamid-Lösung mit 0,5 % w/V von 2, 2'-Azobis Dihydrochloride. Lassen Sie die Proben über Nacht bei 4 ° C inkubieren. Entfernen Sie nach der Übernachtung Inkubation die Proben und inkubieren sie bei 37 ° C für ca. 2-3 h.</li>
		<li>Spülen Sie die Proben mit PBS und dann legen Sie sie in einer Lösung von 8 % w/V Sodium Dodecyl Sulfat und 1,25 % w/V Borsäure. Inkubieren Sie die Proben bei 37 ° C, bis sie klar sind. Dies kann je nach der Dicke der Probe mehrere Stunden dauern. Entfernen Sie nach der Reinigung die Proben zu und legen Sie sie in 1 x Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung für 1 Tag.</li>
		<li>Bereiten Sie einen passende Lösung mit 40 g nichtionische Dichte Gradienten Medium Brechungsindex (siehe Tabelle der Materialien) in 30 mL 0,02 M Phosphatpuffer (PB), 0,1 % Tween-20 und 0,01 % Natriumazid. Bringen Sie die Lösung einen pH-Wert von 7,5 mit Natriumhydroxid.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie die gelöschte Probe in Felgen mit einem Brechungsindex von 1,46-1,48 und 1 % Agarose. Legen Sie die Probe in Borosilikat-Glasröhren und ermöglichen Sie die Agarose, bei Zimmertemperatur (23 ° C) zu festigen.</li>
	<li>Befestigen Sie eine 3-d-motorisierte translationale Phase Borosilikat-Glasröhren zur Bewegungskontrolle und Ausrichtung der Probe innerhalb der 3-d gedruckt ABS Kammer (siehe ergänzende Abbildung1).</li>
</ol>(4) Erwachsene Herz Imaging
<ol><li>Injizieren Sie 8,7 x 1012 -Viren des Typs Adeno-assoziierten Virus Vektor 9 (AAV9) mit einem Promotor der Herz-Kreislauf-spezifische Troponin T (cTnT) und grün fluoreszierendes Protein (GFP) in einem 100 μL Volumen in die Rute Vene Mausklick 2-monatigen Wildtyp (C57BL/6). Hinweis: Die AAV9 wurde nach der Technik von Yuan Et Al. beschrieben entwickelt. 13. dadurch GFP binden an die renale äußeren medulläre Kaliumkanal (ROMK) AAV9-cTnT-ROMK-GFP Produktion (siehe Tabelle der Materialien).</li>
	<li>Sezieren Sie die Erwachsenen Mäuseherzen 7,5 Monate alt nach der Technik von NHLBI11beschrieben. Bereiten Sie die Proben mit Schritten 3.1-3.3 vor.</li>
	<li>Verbinden Sie den motor Controller mit dem motorischen Antrieb. Borosilikat-Glasröhren zur Bewegungskontrolle den Aktor beimessen und Ausrichtung der Probe innerhalb der 3-d gedruckt ABS Kammer.</li>
	<li>Positionieren Sie die Probe, so dass es in der Mitte des Gaußschen Strahls durch die doppelte Beleuchtungssystem geschaffen. Abrufen von Bildern mit der sCMOS Kamera mit einer Rate von 100 fps.</li>
	<li>Mit der Motorsteuerung, die Probe 1 mm in axialer Richtung bewegen und Bilder bei jedem Inkrement 1 mm mit sCMOS Kamera erwerben. Fortgesetzt, bis die gesamte Stichprobe abgebildet worden. Hinweis: Das System wird durch einen eigens entwickelten Instrument-Steuerungs-Software gesteuert.</li>
	<li>Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungs-Software (siehe Tabelle der Materialien). 3-d-Bilder mit diesen Bild-Stacks und die Visualisierung Software14zu entwickeln. Deconvolve die PSF aus Schritt 2.6 mit den erworbenen Bildstapel. Legen Sie einen Pixel Intensität Schwellenwert zu beobachten die Konturen des Herzens und Pseudo-Farbe hinzufügen, um die Bilder anhand dieser Grauwert-Intensität.</li>
</ol>

<ol><li>Richardson, D. S., Lichtman, J. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4537058/">Clarifying tissue clearing.</a> Cell. 162 (2), 246-257 (2015).</li>
<li>Lee, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((4-Dimensional+light-sheet+microscopy+to+elucidate+shear+stress+modulation+of+cardiac+trabeculation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Investigation%22%5BJournal%5D)">4-Dimensional light-sheet microscopy to elucidate shear stress modulation of cardiac trabeculation.</a> Journal of Clinical Investigation. 126 (5), 1679-1690 (2016).</li>
<li>Huisken, J., Swoger, J., Del Bene, F., Wittbrodt, J., Stelzer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+sectioning+deep+inside+live+embryos+by+selective+plane+illumination+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Optical sectioning deep inside live embryos by selective plane illumination microscopy.</a> Science. 305 (5686), 1007-1009 (2004).</li>
<li>Huisken, J., Stainier, D. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+plane+illumination+microscopy+techniques+in+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Selective plane illumination microscopy techniques in developmental biology.</a> Development. 136 (12), 1963-1975 (2009).</li>
<li>Bakkers, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+as+a+model+to+study+cardiac+development+and+human+cardiac+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish as a model to study cardiac development and human cardiac disease.</a> Cardiovascular Research. 91 (2), 279-288 (2011).</li>
<li>High, F. A., Epstein, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+multifaceted+role+of+Notch+in+cardiac+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Genetics%22%5BJournal%5D)">The multifaceted role of Notch in cardiac development and disease.</a> Nature Reviews Genetics. 9 (1), 49-61 (2008).</li>
<li>Sachinidis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+specific+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovascular+Research%22%5BJournal%5D)">Cardiac specific differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Cardiovascular Research. 58 (2), 278-291 (2003).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-sheet+fluorescence+imaging+to+localize+cardiac+lineage+and+protein+distribution%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Light-sheet fluorescence imaging to localize cardiac lineage and protein distribution.</a> Scientific Reports. 7, 42209(2017).</li>
<li>Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+CLARITY+for+rapid+and+high-resolution+imaging+of+intact+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protocols%22%5BJournal%5D)">Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues.</a> Nature Protocols. 9 (7), 1682-1697 (2014).</li>
<li>Robbins, N., Thompson, A., Mann, A., Blomkalns, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+excision+of+murine+aorta%3B+a+versatile+technique+in+the+study+of+cardiovascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Isolation and excision of murine aorta; a versatile technique in the study of cardiovascular disease.</a> Journal of Visualized Experiments. (93), e52172(2014).</li>
<li>National Heart, L., Blood Institute, <a target="_blank" href="http://community.parentprojectmd.org/profiles/blogs/standard-operating-procedures-for-duchenne-animal-models">Standard Operating Procedures (SOP's) for Duchenne Animal Models</a>. , (2015).</li>
<li>Sung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+tissue+clearing+and+incorporation+of+colorimetric+phenotyping%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional tissue clearing and incorporation of colorimetric phenotyping.</a> Scientific Reports. 6, 30736(2016).</li>
<li>Yuan, Z., Qiao, C., Hu, P., Li, J., Xiao, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+versatile+adeno-associated+virus+vector+producer+cell+line+method+for+scalable+vector+production+of+different+serotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Therapy%22%5BJournal%5D)">A versatile adeno-associated virus vector producer cell line method for scalable vector production of different serotypes.</a> Human Gene Therapy. 22 (5), 613-624 (2011).</li>
<li>FEI, <a target="_blank" href="https://www.fei.com/software/amira-user-guide/">Amira User's Guide</a>. , Konrad-Zuse-Zentrum fur Informationstechnik. Berlin. 59-138 (2017).</li>
<li>Gao, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Noninvasive+imaging+of+3D+dynamics+in+thickly+fluorescent+specimens+beyond+the+diffraction+limit%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Noninvasive imaging of 3D dynamics in thickly fluorescent specimens beyond the diffraction limit.</a> Cell. 151 (6), 1370-1385 (2012).</li>
<li>Truong, T. V., Supatto, W., Koos, D. S., Choi, J. M., Fraser, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+and+fast+live+imaging+with+two-photon+scanned+light-sheet+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Deep and fast live imaging with two-photon scanned light-sheet microscopy.</a> Nature Methods. 8 (9), 757-760 (2011).</li>
<li>Ding, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+light-sheet+imaging+with+virtual+reality+to+recapitulate+developmental+cardiac+mechanics%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">Integrating light-sheet imaging with virtual reality to recapitulate developmental cardiac mechanics.</a> JCI Insight. 2 (22), (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Das LSFM System und die hier beschriebene Technik nutzt einen beidseitige Beleuchtung Strahl kombiniert mit einer optischen Ausgleich Bild Maus Herzen postnatale und Erwachsenen Stadium seiner Entwicklung. Ein traditionelle einheitliche Beleuchtung Strahl leidet Photon Streuung und Absorption durch dicker und größer Gewebe Proben1,3. Die beidseitige Träger bieten eine gleichmäßigere Ausleuchtung der Probe, so dass die Wirkung von Striping und andere Artefakte, di...

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie war eine Technik, die erstmals im Jahre 1903 entwickelt und dient heute als eine Methode, Genexpression zu studieren und auch 3-d- oder 4-D-Modelle von Gewebe Proben1,2,3zu produzieren. Dieses bildgebende Verfahren verwendet eine dünne Folie aus Licht um zu eine einzige Ebene einer Probe zu beleuchten, so dass nur das Flugzeug vom Detektor erfasst wird. Die Probe kann dann in axialer Richtung auf jeweils erfassen verschoben werden Schicht, einen Abschnitt in einer Zeit, und machen Sie ein 3-d-Modell nach der Nachbearbeitung der aufgenommenen Bilder4. Allerdings hat aufgrund der Absorption und Streuung von Photonen, LSFM Proben beschränkt, die entweder wenige Mikrometer dick sind oder optisch transparenten1.
Die Grenzen der LSFM führten zu umfangreichen Studien von Organismen, die Gewebe, die optisch transparent, wie dem Zebrafisch. Studien mit kardialen Entwicklung und Differenzierung werden häufig auf Zebrafisch durchgeführt, da gibt es konservierte Gene zwischen Mensch und Zebrafisch5,6. Obwohl diese Studien zu Fortschritten in der kardiologischen Forschung in Bezug auf Kardiomyopathien6,7geführt haben, muss es noch eine ähnliche forschen auf höherer Ebene Organismen wie Säugetiere.
Säugetier-Herzgewebe Herausforderung eine durch die Dicke und die Deckkraft des Gewebes, die Absorption durch Hämoglobin in den roten Blutkörperchen und das Striping, das durch einseitige Beleuchtung der Probe unter traditionellen LSFM Methoden1 auftritt , 8. um diese Einschränkungen zu kompensieren, haben wir vorgeschlagen, beidseitige Beleuchtung und eine vereinfachte Version der Klarheit Technik9 kombiniert mit einem Brechungsindex passende Lösung (Felgen) zu verwenden. Daher ermöglicht dieses System für die Darstellung einer Probe, die größer als 10 x 10 x 10 mm3 während Aufrechterhaltung eine gute Auflösung in den axialen und lateralen8Flugzeuge.
Dieses System wurde zunächst kalibriert mit fluoreszierenden Perlen in verschiedenen Konfigurationen innerhalb der Glasröhren angeordnet. Dann wurde das System verwendet, um nach der Geburt und Erwachsenen murinen Herzen Bild. Erstens war das postnatale Maus Herz 7 Tage (P7), offenbaren die ventrikuläre Hohlraum, die Dicke der Ventrikelwand, die Ventil-Strukturen und das Vorhandensein von Trabeculation abgebildet. Zweitens wurde eine Studie durchgeführt, um Zellen zu identifizieren, die in Kardiomyozyten differenzieren würde mithilfe einer postnatalen Maus Herz am 1 Tag (P1) mit Cre-Label Kardiomyozyten und gelb fluoreszierenden Proteins (YFP). Zu guter Letzt wurden Erwachsener Mäuse mit 7,5 Monaten abgebildet, um das Vorhandensein von renal äußeren medulläre Kalium (ROMK) Kanäle nach Gen Therapie8beobachten.

<table><tbody><tr><td>CW Laser</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LMM-GBV1-PF3-00300-05</td><td>Anregung von Fluorophoren</td></tr><tr><td>Neutraldichtefilter</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M</td><td>Steuert die Lichtmenge des einfallenden Lichts</td></tr><tr><td>Achromatischer Strahlaufweiter Thorlabs</td><td></td><td>GBE05-A</td><td>Erweitert den Lichtstrahl</td></tr><tr><td>Mechanischer Spalt</td><td>Thorlabs</td><td>VA100C</td><td>Steuert die</td></tr> <tr>Strahlbreite<td>Strahlteiler</td><td>Thorlabs</td><td>BS013</td><td>Bildet einen Strahl mit doppelter Beleuchtung</td></tr><tr><td>Stereomikroskop mit 1X Objektiv</td><td>Olympus</td><td>MVX10</td><td>Wird für die Beobachtung von Proben</td></tr><tr><td>verwendet ORCA-Flash4.0 LT sCMOS-Kamera</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>C11440-42U</td><td>Wird für die Aufnahme von Bildern</td></tr><tr><td>verwendet Acrylnitril-Butadien-Styrol (ABS)</td><td>Stratasys</td><td>uPrint</td><td>Material für den 3D-Druck eines Probenhalters</td></tr><tr><td>Fluoreszierende Polystyrolkügelchen</td><td>Spherotech Inc</td><td>PP-05-10</td><td>Wird für die Kalibrierung von Bildgebungssystemen verwendet</td></tr><tr><td>Borosilikatglasröhren</td><td>Corning</td><td>Pyrex 7740</td><td>Schläuche für die Probeneinbettung</td></tr><tr><td>Glycerin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP229-4</td><td>Füllung für Probenkammer</td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP39920</td><td>Spüllösung für Mäuseherzen</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>Elektronenmikroskopie Wissenschaft</td><td>RT-15700</td><td>Erste Inkubationslösung</td></tr><tr><td>Acrylamid</td><td>Wako Chemicals</td><td>AAL-107</td><td>Gemischt mit 2,2'-Azobisdihydrochlorid für die zweite Inkubationslösung für Mausherzen</td></tr><tr><td>2,2'-Azobis Dihydrochlorid</td><td>Wako Chemicals</td><td>VA-044</td><td>Gemischt mit Acrylamid für die zweite Inkubationslösung für Mausherzen</td></tr><tr><td>Natriumdodecylsulfat&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>71725</td><td>Gemischt mit Borsäure für die dritte Inkubationslösung für Mausherzen</td></tr><tr><td>Borsäure</td><td>Fischer Scientific</td><td>A74-1</td><td>Gemischt mit Natriumdodecylsulfat für die dritte Inkubationslösung für Mäuseherzen</td></tr><tr><td>Sigma D2158</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2158</td><td>Gemischt mit PB, Tween-20 und Natriumazid als Brechungsindex-Matching-Lösung</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>11332465001</td><td>Gemischt mit Sigma D2158, PB und Natriumazid als Brechungsindex-Matching-Lösung</td></tr><tr><td>Natriumazid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2002</td><td>Gemischt mit Sigma D2158, PB und Tween-20 als Brechungsindex-Matching-Lösung</td></tr><tr><td>Adeno-assoziierter Virusvektor 9 mit einem herzspezifischen Troponin-T-Promotor, markiert mit GFP</td><td>Vector</td><td>Biolabs VB2045</td><td>Exprimiert GFP, wenn es an ROMK</td></tr><tr><td>DC Servo Motor Actuator</td><td>Thorlabs</td> gebunden ist<td>Z825B</td><td>Wird für die Bewegung der Probe in axialer Richtung innerhalb des Lichtblechs</td></tr><tr><td>verwendet K-Cube Brushed DC Servomotor Controller</td><td>Thorlabs</td><td>KDC101</td><td>Verbindet sich mit dem Motorantrieb und steuert die Bewegung des Aktuators</td></tr><tr><td>Amira</td><td>FEI Software</td><td>N/A</td><td>Visualisierungssoftware zur Erstellung von 2D- und 3D-Bildern</td></tr></tbody></table>

licht-blatt fluoreszenzmikroskopie for the study of murine herzen

Light-sheet Fluorescence Microscopy for the Study of the Murine Heart

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie hat seit schnelle Bildakquisition mit eine hohe axiale Auflösung von Mikrometer, Millimeter-Skala weit verbreitet. Traditionelle Licht-Blatt Techniken beinhalten die Verwendung von einem einzigen Beleuchtung Strahl orthogonal auf Probe Gewebe gerichtet. Bilder von großen Proben, die mit einem einzigen Beleuchtung Balken hergestellt werden Streifen oder Artefakte enthalten und leiden unter einer reduzierten Auflösung aufgrund der Streuung und Absorption von Licht durch das Gewebe. Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Strahl und eine vereinfachte Klarheit optische clearing-Technik für das murine Herz. Diese Techniken ermöglichen tiefere Bildgebung durch Lipide aus dem Herzen entfernen und produzieren einen großen Bereich der Bildgebung, größer als 10 x 10 x 10 mm3. Als ein Ergebnis dieser Strategie ermöglicht es uns, quantifizieren die ventrikulären Dimensionen, die kardiale Abstammung zu verfolgen und die räumliche Verteilung der Herz-Kreislauf-spezifische Proteine und Ionenkanäle aus der postnatalen zu Erwachsenen Mäuseherzen mit ausreichendem Kontrast zu lokalisieren und Auflösung.

Die beschriebene Technik verwendet hier einen beidseitige Beleuchtung Strahl kombiniert mit einer optischen Ausgleich von Maus Herz Gewebeproben um zu einer tieferen bildgebenden Tiefe und ein größeres Volumen der Bildgebung mit ausreichender bildgebenden Auflösung (Abbildung 1) zu erreichen. Zur Kalibrierung des Systems wurden fluoreszierende Kügelchen im Inneren der Glasröhren und innerhalb des Systems der bildgebenden platziert. Die Perlen waren dann abgeb...

Diese Studie verwendet eine beidseitige Beleuchtung Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) Technik kombiniert mit optischen Ausgleich der murine Herz zu studieren.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Light-sheet fluorescence microscopy has been widely used for rapid image acquisition with a high axial resolution from micrometer to millimeter scale. ...

Der Hauptvorteil dieser Technologie ist, dass sie eine schnelle Bildgebung des Mausherzes ermöglicht. Und es kann verwendet werden, um das Vorhandensein von Luftkanälen nach der Gentherapie zu beobachten. Obwohl diese Methode Einen Einblick in die Entwicklungskardiologie geben kann, kann sie auch auf andere Systeme wie Neurologie und Pulmonologie angewendet werden.Im Allgemeinen werden Individuen mit dieser Technik kämpfen, weil die Montage einer Bildgebung des erwachsenen Mausherzes schwierig sein kann, und es unterscheidet sich von anderen, traditionellen Techniken, wie konfokale und invertierte Mikroskopie. Platzieren Sie einen kontinuierlichen Wellenlaser mit drei Wellenlängen von 405 Nanometern, 473 Nanometern und 532 Nanometern. Befestigen Sie dann spiegelbildeinen und richten Sie ihn bei 45 Grad am Balken aus.Dadurch wird der Laser auf den Strahlteiler geleitet, der die beidseitige Beleuchtung bildet. Als nächstes passieren Sie den Strahl durch einen Neutraldichtefilter mit einem Durchmesser von 50 Millimetern, einen Strahlexpander und eine Lochbohrung mit einem Durchmesser von 25 Millimetern, die alle 150 Millimeter voneinander entfernt sind. Passieren Sie den Strahl durch einen 50-50 StrahlSplitter, 150 Millimeter vom Loch platziert.Als nächstes legen Sie den Spiegel zwei 150 Millimeter vom Balkenteiler bei 90 Grad bis zum Vorwärtsstrahl auf und richten Sie ihn so aus, dass sich seine Spiegelebene in einem 45-Grad-Winkel zum Strahl befindet. Platzieren Sie dann den Spiegel drei 100 Millimeter von Spiegel zwei, und richten Sie ihn so aus, dass seine Spiegelebene in einem 45-Grad-Winkel zum Vom 2. Spiegel reflektierten Strahl ist. Verwenden Sie diesen reflektierten Strahl, um eine Seite der Doppeltenbeleuchtungslichtplatte zu bilden.Platzieren Sie auf der anderen Seite des Strahlteilers den Spiegel fünf, sodass seine Spiegelebene bei 45 Grad zum Strahl liegt, der in Vorwärtsrichtung emittiert wird. Verwenden Sie den strahlemittierten Strahl von Spiegel fünf, um die zweite Seite der doppelten Beleuchtungsanzeige zu bilden. Als nächstes richten Sie das doppelseitige Beleuchtungssystem systemisch ein.Platzieren Sie die zylindrische Linse zwei 150 Millimeter vom Spiegel drei entfernt und eine weitere identische zylindrische Linse 150 Millimeter vom Spiegel fünf entfernt, auf der anderen Seite des Dual-Beleuchtungs-Setups. Als nächstes platzieren Sie zwei Spiegel, die jeweils in Der Linie mit den zylindrischen Linsen sind, in Entfernungen von 50 Millimetern, um den Strahl bei 90 Grad zu reflektieren. Auf beiden Seiten des Lichtbogens bilden Sie aus einem Linsenpaar ein achromatisches Doublet, wobei die erste Linse 100 Millimeter vom vorherigen Spiegel entfernt platziert wird und einen Durchmesser von einem Zoll und eine Brennweite von 100 Millimetern hat.Die zweite Linse sollte 160 Millimeter von Linse eins mit einem Durchmesser von einem Zoll und einer Brennweite von 60 Millimetern platziert werden. Platzieren Sie dann die Beleuchtungsziele ein und zwei 150 Millimeter von den vorherigen achromatischen Doublets, so dass sie dem Strahl entsprechen. Der von den Objektiven emittierte Strahl bildet die Lichtplatte für die Abbildung der Proben.Bereiten Sie zunächst die fluoreszierende Perlenprobe vor, indem Sie eine 0,53 Mikrometer-Perlenlösung, eins bis 150.000, in einer vorgewärmten Brechungsindex-Matching-Lösung mit einem Prozent niedriger Schmelze zeigender Agarose verdünnen. Als nächstes verwenden Sie ein Stück Borosilikatglasschläuche mit einem Innendurchmesser von 12 Millimetern und einem Außendurchmesser von 18 Millimetern bis zu einer Länge von 30 Millimetern. Die Perlenagaroselösung in den Borosilikatschläuchen anpfeifen und die Agarose bei Raumtemperatur erstarren lassen.Füllen Sie nun eine 3D-gedruckte ABS-Kammer mit einer 99,5-prozentigen Gylcerol-Lösung. Legen Sie die Borosilikatglasschläuche, die die Perlen enthalten, in die Kammer. Befestigen Sie eine motorisierte 3D-Übersetzungsstufe an den Borosilikatglasschläuchen, um die Bewegung und Ausrichtung der Probe innerhalb der ABS-Kammer zu steuern.Verwenden Sie dann eine maßgeschneiderte Software, um Bilder mit der sCMOS-Kamera mit einer Rate von 30 Bildern pro Sekunde zu erfassen. Bewegen Sie die Probe mit dem Motorregler um einen Millimeter in seitliche Richtung, und erfassen Sie Bilder in jedem Schrittvon 1 Millimeter, bis die gesamte Probe abgebildet ist. Stapeln Sie die aufgenommenen Bilder mit einer Visualisierungssoftware und messen Sie die Punktstreufunktion des Systems anhand dieser Perlenbilder.Verwenden Sie eine Refractive Index Matching-Lösung mit einem pH-Wert von 7,5 und lösen Sie ein Prozent Agarose in die passende Lösung auf. Legen Sie eine gelöschte Erwachsenenmaus-Herzprobe in die Brechungsindex-Matching-Lösung, wobei ein Prozent Agarose aufgelöst wird. Dann legen Sie die Probe in Borosilikatglasschläuche ein und lassen Sie die Agarose bei Raumtemperatur erstarren.Befestigen Sie eine 3D-motorisierte Translationsstufe an den Borosilikatglasschläuchen, um die Bewegung und Ausrichtung der Probe in einer 3D-gedruckten ABS-Kammer zu steuern. Positionieren Sie die Probe so, dass sie sich in der Mitte des Gaußschen Strahls befindet, der durch das duale Beleuchtungssystem erzeugt wird. Legen Sie dann die Erfassungsrate der sCMOS-Kamera auf 30 Bilder pro Sekunde fest.Bewegen Sie nun mit dem Motorregler die Probe um einen Millimeter in axiale Richtung und erfassen Sie Bilder in jedem Schrittschritt von einem Millimeter. Fahren Sie fort, bis das gesamte Beispiel abgebildet wurde. Stapeln Sie die erfassten Bilder mit einer Visualisierungssoftware.Entwickeln Sie die 3D-Images mit diesen Bildstapeln. Um dies zu erreichen, dekonvolve die Punkt-Spread-Funktion zuvor bestimmt, und verwenden Sie es für die erworbenen Image-Stacks. Legen Sie schließlich einen Pixelschwellenwertfürstintensitätswert fest, um die Konturen des Herzens zu beobachten, und fügen Sie den Bildern basierend auf dieser Graustufenintensität Pseudofarbe hinzu.Am ersten Tag nach der Geburt kann man unter anderem die Ventile, das Atrium, die Herzkammer, den Brustmuskel und die Trabeekulation visualisieren. Am siebten Tag nach dem Geburt sind die Merkmale noch definierter. Das Atrium, ventrikel, ventrikuläre Hohlraumabmessungen und VentrikelWanddicke sind alle offensichtlich.Um die Kardiomyozytendifferenzierung im Herzen zu untersuchen, wurden heterozygote Knock-in-Mäuse mit der Kreide versehen, um Kardiomyozyten zu zeigen. Die beschrifteten Zellen werden hier in jeder Ebenenrichtung angezeigt. Die drei Ebenen wurden zusammengeführt, um eine 3D-Wiedergabe des Herzens zu erzeugen.Der rot umkreiste Bereich innerhalb des Einsatzes zeigt zwei durchscheinende Mausherzen, nachdem sie sich der Klarheitstechnik unterzogen und in den Borosilikatglasschlauch eingeführt wurden. Neben der Untersuchung von postnatalen Mäusen kann das Bildgebungssystem auch verwendet werden, um das erwachsene Mausherz zu untersuchen. Hier werden GFP-markierte ROMK-Kanäle mit 7,5 Monaten angezeigt.Diese fanden sich hauptsächlich in der ventrikulären Wand. Einmal gemeistert, kann diese Technik in ein bis zwei Minuten durchgeführt werden. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, alle Blasen um die Probe im Rohr zu entfernen.Andere Methoden, wie die automatische Segmentierung der Bildstapel, können durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit Herz-Kreislauf-Verletzungen und Regeneration zu beantworten. Nach seiner Entwicklung wurde diese Technik von Forschern verwendet, um die Herzarchitektur in postnatalen und erwachsenen Entwicklungsstadien bei Mäusen zu untersuchen.

light-sheet-fluorescence-microscopy-for-the-study-of-the-murine-heart

Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Im Herzen koordinieren molekularen Ereignisse, die elektrische und kontraktile Funktion des Organs. Eine Reihe von lokalen Feldfluoreszenzmikroskopie-Techniken präsentiert hier ermöglicht die Aufzeichnung von zellulären Variablen in intakten Herzen. Identifizieren von Mechanismen, um die Herzfunktion zu definieren, ist wichtig für das Verständnis, wie das Herz unter pathologischen Situationen funktioniert.

Lokale Feldfluoreszenzmikroskopie: Imaging zellulären Signalen in Intact Herzen

Hier beschreiben wir einen Lichtbogen-Mikroskop-Ansatz, um das Herz-CD45 + -Leukozyten-Infiltrat in einem murinen Modell der aseptischen fulminanten Myokarditis zu visualisieren, das durch die intratracheale Diphtherie-Toxin-Behandlung von CD11.DTR-Mäusen induziert wird.

Quantitative Visualisierung von Leukozyten-Infiltrat in einem Murin-Modell der Fulminant-Myokarditis durch Licht-Blatt-Mikroskopie

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur Entwicklung von Herzen im Zebrafisch in 4 Dimensionen (4D) zu visualisieren. 4-D-Bildgebung, über Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie (LSFM) dauert 3-dimensionale (3D) Bilder im Laufe der Zeit entwickelnde Herzen zu rekonstruieren. Wir zeigen qualitativ und quantitativ die Scherspannung aktiviert endokardialen Kerbe Signalisierung während der Entwicklung der Kammer, die kardiale Trabeculation fördert.

Licht-Blatt Fluoreszenz-Mikroskopie, 4-dimensionale Bilder über die Auswirkungen der modulierende Schubspannung auf entwickelnden Zebrafisches Herzen erfassen

Wir beschreiben optimierte Werkzeuge zur Untersuchung des Zebrafischherzens in vivo mit Lichtblattfluoreszenzmikroskopie. Insbesondere schlagen wir helle kardiale transgene Linien vor und präsentieren neue sanfte Einbettungs- und Immobilisierungstechniken, die Entwicklungs- und Herzfehler vermeiden. Eine mögliche Datenerfassungs- und Analysepipeline, die an die kardiale Bildgebung angepasst ist, ist ebenfalls vorhanden.

Lichtblattmikroskopie der schnellen Herzdynamik in Zebrafischembryonen

Wir berichten über eine Methode zur mesoskopischen Rekonstruktion des gesamten Mausherzens durch die Kombination neuer Fortschritte in der Gewebetransformation und Färbung mit der Entwicklung eines axial gescannten Lichtblattmikroskops.

Mesoskopische optische Bildgebung des ganzen Mausherzens

Dieses Protokoll demonstriert die mikroskopiegesteuerte Isolierung und Immunfluoreszenzfärbung von murinen Pulmonalvenen. Wir bereiten Gewebeproben vor, die den linken Vorhof, die Lungenvenen und die entsprechende Lunge enthalten, und färben sie für kardiales Troponin T und Connexin 43.

Mikrodissektion und Immunfluoreszenzfärbung von Myokardhülsen in murinen Pulmonalvenen

Das Protokoll nutzt fortschrittliche Lichtblattmikroskopie zusammen mit angepassten Gewebereinigungsmethoden, um komplizierte kardiale Strukturen in Nagetierherzen zu untersuchen, was ein großes Potenzial für das Verständnis der kardialen Morphogenese und des Umbaus birgt.

Light-Sheet-Bildgebung zur Aufdeckung der Herzstruktur in Nagetierherzen

Die dreidimensionale (3D) Rekonstruktion von Herzschäden bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt (repAMI) ermöglicht eine getreue Quantifizierung und Co-Lokalisierung von assoziierten krankheitsbeeinflussenden Mustern. Hier wird ein automatisierbarer, lichtblattgeführter Bildgebungsansatz für die gleichzeitige Messung von Herzschäden, Risikobereichen und Immunzellantworten bereitgestellt.

Simultane 3D-Analyse von Herzschädigung und Immunantwort bei reperfundiertem akutem Myokardinfarkt mittels Lichtblatt-Fluoreszenzmikroskopie

Eine zyklische Druck Bioreaktor in der Lage zu unterwerfen Herzklappengewebe zu physiologischen und pathologischen Druckverhältnisse ausgelegt ist. Ein LabVIEW-Programm ermöglicht es Benutzern, Druck Größe, Amplitude und Frequenz-Steuerung. Dieses Gerät kann verwendet werden, um die Mechanobiologie der Herzklappe Gewebe oder isolierte Zellen zu studieren.

Entwurf eines zyklischen Druck Bioreaktor für die Ex Vivo Studium der Aorten-Herzklappen

Eine Methodik zur ventrikulären Faserorientierung in vivo-Bilder des Patienten Herzen Geometrien für personalisierte Modellierung abzuschätzen beschrieben. Validierung der Methodik unter Verwendung von normalen und andernfalls caninen Herzen zeigen, dass, dass es keine signifikanten Unterschiede zwischen geschätzten und erworbenen Faserorientierungen in einer klinisch beobachtbaren Ebene.

Patienten-spezifischer Modellierung des Herz: Schätzung der Ventrikuläre Faserorientierungen

Erfahren Sie Licht-Blatt-Fluoreszenzmikroskopie für die Kardiologie mit optischer Klärung am murinen Herzen. Diese Methode ermöglicht schnelle Bildgebung und Beobachtung struktureller Veränderungen nach Gentherapie.

Licht-Blatt Fluoreszenzmikroskopie for the Study of Murine Herzen

Weitere Videos entdecken