Schnelle, skalierbare Montage und Beladung von bioaktiven Proteinen und Immunstimulantien in diversen synthetischen darin über Flash-Nanoprecipitation

Wir glauben, dass die Verwendung von Flash-Nanopräzipitation zum Zusammensetzen komplexer Nanostrukturen es Forschern, die nicht über umfangreiche Erfahrung in Chemie, Ingenieurwesen oder Nanomaterialwissenschaften verfügen, ermöglichen wird, fortschrittliche Wirkstoffverabreichungssysteme unabhängig für ihre eigenen spezifischen Anwendungen und Bedürfnisse herzustellen. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die Erzeugung großer Volumina verschiedener Nanostrukturen in hoher Konzentration, geringer Polydispersität und beladen mit bioaktiven Molekülen, einschließlich niedermolekularer Arzneimittel und Proteine, die alle unter sterilen Bedingungen gebildet werden. Im Allgemeinen können Personen, die neu in der Polymersynthese sind, Schwierigkeiten haben, da die Polypropylensulfidkomponente sehr empfindlich auf Oxidation durch Einwirkung von Luft reagiert.

visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die mehreren Aufprallschritte schwer zu erlernen sind, da sie sehr schnell hintereinander ausgeführt werden müssen. Um die geschlossenen Aufpralldüsen (CIJ-Mischer) zu sterilisieren, arbeiten Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank und tauchen Sie den Mischer so ein, dass alle Teile über Nacht in ein molares Natriumhydroxid von null Punkt zerlegt sind. Bauen Sie den CIJ-Mischer wieder zusammen und lassen Sie endotoxinfreies Wasser mit Luerlock-Spritzen durch den Mischer fließen, testen Sie den pH-Wert des Wassers und lassen Sie das Wasser weiter durchfließen, bis der pH-Wert als neutral registriert wird.

Um die erste Impingementlösung herzustellen, wiegen Sie zunächst 20 Milligramm des synthetisierten Polymers in ein Ein-Komma-Fünf-Liter-Röhrchen. Fügen Sie dann hydrophobe Farbstoffe, Medikamente oder andere Fracht hinzu. Zum Schluss fügen Sie dem Polymer und der Ladung 500 Mikroliter 100% Tetrahydrofuran hinzu und wirbeln Sie kräftig vortexen, um sich aufzulösen.

Zur Herstellung der zweiten Impingementlösung wird die hydrophile Fracht, die in die Polymervesikel geladen werden soll, in 500 Mikrolitern eines wässrigen Puffers gelöst. Geben Sie 2,5 Milliliter eines wässrigen Puffers Ihrer Wahl in ein Reservoir geeigneter Größe. Stellen Sie nun den Behälter so unter den CIJ-Mischer, dass der Abfluss aus dem Mischer direkt in den Behälter gelangt.

Laden Sie die Impingement-Lösungen in separate Ein-Milliliter-Einwegspritzen aus Kunststoff und schlagen Sie die Lösungen gegeneinander, um gleichzeitig Nanostrukturen zu bilden, indem Sie die Spritzen in Luerlock-Adapter an der Oberseite des CIJ-Mischers einführen. Drücken Sie beide Spritzen in einer einzigen, gleichmäßigen und schnellen Bewegung gleichzeitig und mit gleicher Kraft. Wenn mehrere Impingements durchgeführt werden, ist es wichtig, dass diese so schnell wie möglich durchgeführt werden, um den Verlust von Valtower organischem Lösungsmittel zu reduzieren.

Um mehrere Impingements durchzuführen, teilen Sie die entstehende Nanostrukturlösung auf zwei Spritzen auf und wiederholen Sie diesen Schritt bis zu vier weitere Male. Sammeln Sie den Abfluss in dem mit wässrigem Puffer gefüllten Behälter und rühren Sie vorsichtig um, um eine Durchmischung sicherzustellen. Es gibt mehrere Möglichkeiten, die entladene Ladung und das organische Lösungsmittel zu entfernen.

Die Nanocarrier-Formulierung kann durch Excise Exclusion oder Entsalzungssäule, durch ein Tangentialfluss-Filtrationssystem, durch Vakuumtrocknung oder durch Dialyse entfernt werden, wie hier gezeigt. Dialysieren Sie die Nanocarrier-Formulierung in demselben wässrigen Puffer und Reservoir, das auch für das Impingement verwendet wird. Verwenden Sie mindestens 24 Stunden lang Schläuche mit einem geeigneten Molekulargewichts-Cutoff und wechseln Sie den Puffer

Sobald die entladene Fracht aus dem organischen Lösungsmittel entfernt wurde, konzentrieren Sie die Nanocarrier-Formulierung mit einem Spin-Konzentrator-System gemäß den Anweisungen des Herstellers. Nanocarrier können bei vier Grad Celsius über Wochen bis Monate gelagert werden. Vor der Verwendung nach der Lagerung sollten Nanocarrier-Formulierungen kurz vortext werden.

Führen Sie die Herstellung einer Hochgeschwindigkeits-Spritzenpumpe durch, wie im Textprotokoll beschrieben. Um den Autorun-Modus zu verwenden, wählen Sie im Hauptmenü die Option Autorun. Das System fordert den Benutzer auf, den Motor die Spritzenausstoßplattform automatisch an den Anfang des Präzisionsschlittens positionieren zu lassen.

Stellen Sie sicher, dass der Weg vor und hinter der Metallplatte frei ist, bevor Sie fortfahren. Laden Sie den CIJ-Mischer in die rechteckige Öffnung des hinteren Ausstoßwagens. Laden Sie dann wie bisher eine Milliliter-Kunststoffspritze und montieren Sie die Spritzen auf die weiblichen Köderanschlüsse des CIJ-Mischers.

Stellen Sie vor dem Betrieb des Geräts die gewünschte Motordrehzahl ein und überprüfen Sie, ob das System klar ist, wie im Textprotokoll beschrieben. Um Reaktanten aus den Spritzen in den CIJ-Mischer auszustoßen, drücken Sie die Run-Taste in der Softwareoberfläche. Repräsentative kryogene Transmissionselektronenmikroskopische Aufnahmen zeigen kleinere und monodispersere Polymersomen nach wiederholtem Aufprall.

Die Analyse des dynamischen Lichtstreuens bestätigte eine Linksverschiebung der Größenverteilung der Polymersomen nach wiederholtem Aufprall. Nach fünf wiederholten Impingements entsprechen der durchschnittliche Durchmesser und die Polydispersität der Polymersomen denen der extrudierten Proben, die durch Dünnschichtrehydratation gebildet werden. Die Flash-Nanopräzipitation kann verwendet werden, um eine Vielzahl von hydrophoben und hydrophilen kleinen Molekülen und Makromolekülen in Polymersomen zu laden.

Obwohl diese Methode Aufschluss über die Funktionsweise von Immuntherapien und Impfstoffen geben kann, kann sie auch auf die Untersuchung angewendet werden, wie sich Polymere selbst zu komplizierten Nanostrukturen zusammenfügen. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie die intravenöse oder subkutane Verabreichung an Tiermodelle durchgeführt werden, um zu bestimmen, welche Zelluntergruppen die Nanopartikel internalisieren oder wie der Weg der Clearance für verschiedene Nanostrukturen aussieht. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die Therapie von Herzkrankheiten und Krebs sowie auf die Entwicklung von Impfstoffen gegen Infektionskrankheiten, da diese Nanocarrier mehrere Medikamente an sehr spezifische Immunzellen richten können.