Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Diese Methode kann verwendet werden, um Substrate zu kategorisieren, die zur Untersuchung von Schlüsselphänomenen in der Mechanobiologie, der Zellmigration und der ersten Generation verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung eines Weitfeldmikroskops erfordert, einem Gerät, das in vielen Labors üblich ist. Diese Methode kann angewendet werden, um den Elastizitätsmodul von Silizium- oder Polyacrylamidgel sowie von weichem isotropem linearem elastischem Material zu messen.

Das mit dieser Methode vorbereitete und charakterisierte Substrat kann auch für selbststreckende Experimente mit der steifen Silikonbasis verwendet werden. Um das weiche Silikonsubstrat herzustellen, nachdem Sie jeweils etwa 1,75 Gramm der Komponenten A und B aus dem weichen Silikonelastomer-Kit abgewogen haben, geben Sie den größten Teil des gewogenen Teils von Komponente A in die B-Komponenten-Polystyrol-Wiegeschale und verwenden Sie einen geeigneten Applikatorstab, um die beiden Komponenten fünf Minuten lang miteinander zu mischen. Übertragen Sie die Mischung in eine 35 Millimeter große Petrischale und lassen Sie das Substrat einige Minuten lang gleichmäßig auf der Petrischale verteilen.

Stellen Sie dann die Petrischale für 15 Minuten in eine Vakuumkammer, um alle Luftblasen zu entfernen, und heizen Sie eine heiße Platte vor. Wenn die Heizplatte 70 Grad Celsius erreicht, legen Sie einen Glasobjektträger auf die Kochplatte und stellen Sie die Petrischale auf die Glasseite. Lassen Sie das Silikon dann 30 Minuten bei 70 Grad Celsius aushärten.

Um das weiche Silikon mit fluoreszierenden Kügelchen zu koppeln, legen Sie das ausgehärtete Silikon in eine tiefe UV-Kammer, fünf bis zehn Zentimeter von der UV-Lampe entfernt, und setzen Sie die Probe fünf Minuten lang tiefem UV-Licht aus. Während das Silikon behandelt wird, lösen Sie 19 Milligramm EDC in 500 Mikrolitern deionisiertem Wasser in einem 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen. Und wirbeln Sie das Rohr, um die Chemikalie aufzulösen.

Geben Sie anschließend 500 Mikroliter deionisiertes Wasser zu 11 Milligramm Sulfo-NHS in ein zweites 1,5-Milliliter-Röhrchen. Und Wirbel, um die Chemikalie aufzulösen. Kombinieren Sie dann die EDC- und Sulfo-NHS-Lösungen in einem einzigen Mikrozentrifugenröhrchen.

Fügen Sie nun der Mischung 30 Mikroliter einer geeigneten Suspension aus Fluor-4-konjugierten, carboxylatmodifizierten Mikrokügelchen und 0,02 Milligramm Rattenschwanzkollagen 1 hinzu. Nach kurzem Vortexen legen Sie ein Stück Parafilm auf den Deckel eines zweiten Deckels mit kleinerem Durchmesser und geben Sie einen Milliliter der EDC-NHS-Kügelchen-Kollagen-1-Mischung auf den Parafilm. Drehen Sie die Petrischale, die das weiche Silikon enthält, über die Mischung um, indem Sie die Schale auf beiden Seiten mit zwei Glasobjektträgern stützen, so dass die weiche Silikonoberfläche die Bead-Lösung berührt, ohne die Oberfläche des darunter liegenden Deckels mit kleinerem Durchmesser direkt zu berühren.

Decken Sie dann die Probe 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit Alufolie ab, bevor Sie das Silikon zweimal mit zwei Millilitern PBS pro Waschgang waschen und lassen Sie das Silikon über Nacht in zwei Millilitern frischem PBS bei 37 Grad Celsius aufrecht aushärten. Verwenden Sie am nächsten Morgen eine spitze Pinzette, um fünf Millimeter Zirkoniumkugel-Eindringkörper auf das weiche Silikon zu drapieren, wobei Sie mindestens einen Milliliter PBS von den Rändern der Silikonschicht und mindestens fünf Eindringkörperdurchmesser von der Position der anderen Eindringkörper entfernt sind. Stellen Sie dann die Schale aus weichem Silikon auf einen Weitfeld-Mikroskoptisch und verwenden Sie das 10-fach-Objektiv, um ein Phasenbild eines gesamten Eindringkörpers ohne sichtbare Defekte zu erhalten.

Wählen Sie nach dem Speichern des Bildes den entsprechenden Fluoreszenzkanal für die Visualisierung der fluoreszierenden Mikrokügelchen aus. Wenn sich der Eindringkörper in der Nähe des rechten Randes des Rahmens befindet, verringern Sie die Z-Koordinaten, bis die fluoreszierenden Mikroperlen unter der Mitte des Kugeleinrückers knapp unscharf werden. Erfassen Sie dann einen Z-Stapel mit einem Bild für jedes 0,5-Mikrometer-Z-Inkrement, bis die Mikrokügelchen in der oberen Schicht des Silikons in der Nähe des linken Randes des Bildrahmens ein- und wieder unscharf sind.

Um die Silikonsteifigkeit zu berechnen, öffnen Sie zunächst das Eindringkörperphasenbild in ImageJ und klicken Sie auf Analysieren und Maßstab festlegen und Längeneinheit prüfen, um zu bestätigen, dass die Länge auf Pixel eingestellt ist. Klicken Sie mit dem Linienwerkzeug auf einen Punkt auf der Eindringkante und halten Sie die Maustaste gedrückt, indem Sie den Cursor zu einem Punkt auf der diametral gegenüberliegenden Kante bewegen, um den Durchmesser des Eindringkörpers zu messen und die Länge in Pixel in der Statusleiste des ImageJ-Hauptfensters zu notieren, bevor Sie den Cursor loslassen. Öffnen Sie als Nächstes das Dateimenü und wählen Sie Bildsequenz importieren, um ein Bild im Z-Stapel von fluoreszierenden Mikroperlenbildern auszuwählen, und klicken Sie auf OK, um den Stapel zu öffnen.

Zeichnen Sie mit dem Linienwerkzeug eine Linie über eine gut definierte Mikroraupe in einem Bild und klicken Sie auf Zeichnungsprofil in Live analysieren, um die aktualisierte Linienscanintensität über die Raupe zu erhalten, während Sie verschiedene Frames auswählen. Das Bild, das den höchsten Wert der maximalen Intensität liefert, kann dann als Bild im Fokus ausgewählt werden. Fluoreszenzbilder der Mikrokügelchen auf der Oberseite des Silikons, die in einer x-y-Rahmenposition aufgenommen wurden, platzieren den Bereich unter dem Eindringkörper an der äußersten rechten Seite des Rahmens.

Der Bereich ganz links im Rahmen wird dann als der Bereich ausgewählt, der vom Einrückungskörper entfernt ist. In diesem repräsentativen Satz von Intensitätslinienscans, die über eine einzelne Mikrobead gemessen werden, variiert der Fokus in Z-Schritten von 0,5 Mikrometern. Der Z-Wert, der dem scharfen Bild entspricht, kann dann objektiv ausgewählt werden, basierend auf dem Z-Wert, der dem Zeilenscan mit der höchsten maximalen Intensität entspricht.

Hierbei wurde der Elastizitätsmodul des Silikons für verschiedene A:B-Komponenten-Mischungsverhältnisse auf der Grundlage des soeben gezeigten Verfahrens ermittelt. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie weiche Silikonsubstrate vorbereiten, die fluoreszierenden Kügelchen darauf aufsetzen und die Steifigkeit des Substrats mit einem Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop messen.