Name: Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-03T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 2 s
Description: Erfahren Sie, wie Sie die Steifigkeit weicher Silikonsubstrate für Mechanobiologie-Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop messen. Diese Methode ermöglicht präzise Bestimmung des Elastizitätsmoduls für Zellmigrationsforschung.

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Wir danken Margaret Gardel für großzügig erlaubt die Verwendung von dem Rheometer. Wir erkennen an Unterstützung von den NIH (1R15GM116082), die diese Arbeit ermöglichte.

1. Herstellung von weichem Silikon Substrat
<ol><li>Die Komponente A und B-Komponente 1,75 g 1,75 g abwiegen (a = 1:1) aus dem weichen Silikon-Elastomer-Kit (Polystyrol) mit einem Gewicht von Schalen.</li>
	<li>Der B-Komponente in das Fach mit einem Gewicht von der A-Komponente hinzu und mischen sie zusammen für 5 min mit einem geeigneten Applikator-Stick.</li>
	<li>Ein 35 mm Petrischale der obige Mischung hinzufügen. Lassen Sie die Mischung gleichmäßig auf der Petrischale für ein paar Minuten verteilt. Hinweis: Die Wahl der Petrischale Durchmesser und die Höhe aus weichem Silikon bestimmt die weichen Silikon-Dicke. Hier werden die Dicke ca. 3,5 mm; mehr über die Wahl der Elastomer-Stärke im Abschnitt Diskussion .</li>
	<li>Bringen Sie die Petrischale mit der Silikon-Mischung, mit dem Deckel aus, in einer Vakuumkammer für 15 min um Luftblasen zu entfernen. Während dieser Zeit Vorwärmen einer Heizplatte bis 70 ° C.</li>
	<li>Sobald die heiße Platte 70 ° C erreicht, setzen Sie einen Objektträger auf und dann legen Sie die Petrischale mit der Silikon-Mischung auf den Objektträger. Lassen Sie das Silikon Heilung bei 70 ° C für 30 Minuten. Stellen Sie Polystyrol Teller nicht direkt auf der heißen Platte, da die Petrischale schmelzen kann.</li>
</ol>(2) Kopplung von fluoreszierenden Microbeads auf dem weichen Silikon
<ol><li>Legen Sie das ausgehärtete weiche Silikon (in der ungedeckten Petrischale) in einer tiefen UV-Kammer (ein Gehäuse mit einer Tiefe UV-Lampe Lichtwellenlängen von 185 und 254 nm). Die weichen Silikon-Probe (~ 5-10 cm entfernt von der UV-Lampe) tiefen UV-Licht für 5 min aussetzen.<ol>
<li>Während das Silikon tiefen UV-Licht ausgesetzt ist, fahren Sie mit folgenden Schritten 2.2-2.6. Nach der tiefen UV-Exposition Entgasen der tiefen UV-Kammer für mindestens 5 min vor dem Abrufen der Probenmaterials.</li>
	</ol>
</li>
	<li>In der Zwischenzeit 19 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) Carbodiimide (EDC) in einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch abwiegen und 500 μL deionisiertes Wasser (DI) Wasser hinzufügen. Auflösen der EVG durch das Rohr vorsichtig schütteln.</li>
	<li>Wiegen Sie in einem separaten 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch 11 mg N- Hydroxysulfosuccinimide (Sulfo-NHS), 500 μL DI Wasser hinzu, und lösen Sie die Sulfo-NHS durch das Rohr vorsichtig schütteln. Dann kombinieren Sie die EDC und Sulfo-NHS Lösungen in einem einzigen Microcentrifuge Schlauch.</li>
	<li>Diese EDC/Sulfo-NHS-Projektmappe fügen Sie 30 μL 0,44 μm Durchmesser rot (oder jede andere Farbe der Fluoreszenz basierend auf die Filter-Cubes zur Verfügung in dem Fluoreszenzmikroskop) carboxylat geändert fluoreszierende Microbeads (mit einer 1 % w/V Lager Konzentration hinzu).</li>
	<li>Die EDC/Sulfo-NHS/Wulst-Mischung hinzufügen 0,02 mg Kollagen I (von einem Rattenschwanz, Lager Konzentration von 4 mg/mL in 0,02 M Essigsäure), eine Konzentration von etwa 0,02 mg/mL zu erhalten.</li>
	<li>Wirbel der EDC/NHS/Perle/Kollagen ich Mischung kurz um sicherzustellen, dass die Perlen gleichmäßig im gesamten Gebäude, vor dem Kuppeln verteilt sind.</li>
	<li>1 mL EDC/NHS/Perle/Kollagen Pipette ich Mischung auf einem Stück Parafilm eine andere flache, flache Deckel (mit kleinerem Durchmesser) platziert. Drehen Sie die Petrischale mit weichem Silikon auf diese Mischung, so dass die weichen Silikon-Oberfläche die Mischung Kontakte aber die Oberfläche von den kleineren Petrischale Deckel unten nicht direkt berühren. Um die umgekehrte Petrischale zu erhöhen, verwenden Sie ein oder zwei Glas-Objektträger unter beiderseits der invertierten Petrischale Abstandhalter. Hinweis: Siehe Abbildung 1 zu sehen, wie Schritt 2.7 durchgeführt wird.</li>
	<li>Die Probe mit Alufolie abdecken und bei Zimmertemperatur 30 min inkubieren.</li>
	<li>Die Petrischale mit weichem Silikon entfernen und setzen Sie ihn aufrecht (Silikon-Seite nach oben).</li>
	<li>Waschen Sie die weichen Silikon-Oberfläche mit Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) durch Zugabe von 2 mL PBS (pH 7,4) in die Schale. Lassen Sie es für ein paar Minuten. Aus der PBS Aspirieren und das Silikon wieder mit 2 mL PBS waschen. Lassen Sie die Silikon Heilung weiter für etwa einen Tag. Stellen Sie aus diesem Grund die weichen Silikon-Probe mit PBS-Puffer bei 37 ° C über Nacht.</li>
</ol>3. Messung Silikon Steifigkeit mit Kugel Einzug mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop
<ol><li>Rufen Sie die Petrischale mit weichem Silikon und sicherstellen Sie wollen, dass es mindestens 1 mL PBS, die Silikon-Oberfläche mehrere mm unterhalb der Flüssigkeitsoberfläche zu haben.</li>
	<li>Pinzette Spitz, fünf 1 mm Zirkon Kugel Eindringkörper auf dem weichen Silikon fallen. Tauchen Sie die Kugeln in das flüssige Medium ein und legen Sie ab, Weg von den Rändern der Silikonschicht und mindestens 5 Eindringkörper Durchmessern vom Standort der anderen Eindringkörper entfernt. Hinweis: Wenn über der Flüssigkeitsoberfläche gelöscht, können die Kugeln nicht das flüssige Medium (Float) geben aufgrund der Oberflächenspannung des flüssigen Mediums.</li>
	<li>Legen Sie die Petrischale mit weichem Silikon auf Mikroskoptisch, so dass es möglich, Bild durch die Petrischale Basis ist.</li>
	<li>Mit Phase-Bildgebung mit einem 10 X-Objektiv (wie z. B. eine trockene 10 X Objektive von NA 0,30), zu lokalisieren und eine Kugel Eindringkörper in den Fokus zu bringen.</li>
	<li>Nehmen Sie eine Phase Bild eines Teils oder der gesamten der Eindringkörper und speichern Sie dieses Bild. Verwenden Sie einen Kachel-Scan, falls vorhanden. Wenn der Eindringkörper sichtbare Mängel hat, entsorgen Sie und ersetzen Sie es mit einem anderen Eindringkörper.</li>
	<li>Schwenken Sie unter live Phase Bildgebung nach links von der Eindringkörper Rand damit der linke Rand des Rahmens mindestens ein Abstand von ~1.5 R aus dem Eindringkörper Center ist. Stellen Sie sicher, dass das Zentrum der Eindringkörper auf der rechten Seite, nahe an den rechten Rand des Bildrahmens sichtbar bleibt. Eine Phase Bild nehmen und es zu speichern.</li>
	<li>Wechseln Sie die Mikroskop-Lichtquelle bis hin zur Beleuchtung für den roten fluoreszierenden Kanal. Mit der X- und y-Koordinaten unverändert (die X-y -Position des Zentrums Eindringkörper innerhalb aber nahe am rechten Rand des Rahmens), Schwerpunkt nach unten (Abnahme Z) bis rot fluoreszierende Microbeads unter der Kugel Eindringkörper Center gehen Sie einfach unscharf.</li>
	<li>Nehmen Sie einen Z-Stapel mit einem Bild für jeden Z-Inkrement von 0,5 µm bis Microbeads in die oberste Schicht des Silikons weit von der Eindringkörper (nahe dem linken Rand des bildgebenden Rahmens) unscharf gehen.</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 3,4-3,8 mit den anderen Eindringkörper auf die Probe.</li>
</ol>4. Berechnung des Silikons Steifigkeit (Elastizitätsmodul)
<ol><li>Öffnen Sie das Bild der Phase von der Eindringkörper mit ImageJ, klicken Sie auf das Linienwerkzeug und gemessen Sie der Eindringkörper Durchmesser in Pixeln. Klicken und halten Sie einen Punkt am Rande Eindringkörper bewegen Sie den Cursor auf einen diametral gegenüberliegenden Punkt am Rand und beachten Sie die Länge in Pixeln auf der Statusleiste des Hauptfensters ImageJ vor der Freigabe des Cursors angezeigt.<ol>
<li>Sicherzustellen, dass die Längeneinheit Pixel gesetzt, indem Sie auf analysieren | Maßstab festlegen und Überprüfung der Längeneinheit.</li>
		<li>Der Eindringkörper Radius in Pixeln in μm unter Berücksichtigung der objektiven Vergrößerung und der CCD-Kamera-Pixel-Größe konvertieren (R in μm = R in Pixel x die CCD-Kamera-Pixelgröße in μm / Objektive Vergrößerung).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Den Rot-Kanal Z-Stack von Microbead Bildern (wenn die Microbeads rot fluoreszierende sind) in ImageJ durch Anklicken Datei zu öffnen | Import | Bild-Sequenz und wählen Sie jedes Bild im Stapel und klicken Sie auf "OK" , um den Stapel zu öffnen. Hinweis: F1 ist die Frame-Nummer auf der Microbeads unter dem Eindringkörper Center befinden sich in der besten möglichen Fokus und F2 die Frame-Nummer, bei der die Microbeads (an einem Bereich der ~1.5 R die Perle entfernt) am linken Rand des Rahmens in der besten möglichen Fokus sind. Die Z-Unterschied zwischen den beiden Rahmen ist die Einrückung Tiefe δ.<ol>
<li>Mit dem Linienwerkzeug in ImageJ, zeichnen Sie eine Linie über eine klar definierte Microbead im Bild. Klicken Sie auf analysieren | Plot-Profil und klicken Sie auf die Live -Taste, um die aktualisierte Zeile Scan Intensität über den Wulst zu erhalten, bei der Auswahl von unterschiedlichen Frames. Das Bild, das den höchsten Wert für die maximale Intensität gibt kann als Frame im Fokus gewählt werden.</li>
		<li>Da die Z-Inkrement zwischen den Frames in der Z-Stack 0,5 μm ist, berechnen die Eindringtiefe in μm als δ = (F2-F1) x 0,5.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Auf das Gel von der Eindringkörper aufgrund seines Gewichts (abzüglich der gegnerischen Auftriebskraft), d. h. ausgeübte Kraft zu berechnen, die Einrückung Kraft F, als das Volumen der Eindringkörper x (die Dichte der Eindringkörper - die Dichte des flüssigen Mediums) x die Erdbeschleunigung. Verwenden Sie die Gleichung F = (4/3) X 3.142 x (R3) x (ρEindringkörper - ρMedium) x g wo R der Radius der Eindringkörper ist ρEindringkörper ist die Dichte der Eindringkörper, ρMedium ist die Dichte des flüssigen Mediums und g ist die Erdbeschleunigung (9,81 m/s2). Drücken Sie alle Mengen, die auf der rechten Seite in SI-Einheiten, F (N) zu erhalten.</li>
	<li>Berechnen Sie Elastizitätsmodul (E) des Silikons mit einer veränderten11 Hertz Modell12 Gleichung: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq1.jpg"> Wo: c = einen Korrekturfaktor, der den Hertz-Modell Ausdruck ändert, die folgt; V = Poisson Verhältnis von Silikon-Gel (genommen als 0,5 wie bei inkompressiblen Materialien7); F = die Einrückung Kraft; R = den Eindringkörper Radius; und Δ = die Eindringtiefe. Ausdruck aller Größen auf der rechten Seite in SI-Einheiten zu E in PA.<ol>
<li>Berechnen Sie die Korrektur Faktor c 3folgendermaßen: <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq2.jpg"> Wo: <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq3.jpg"> <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq4.jpg">; und <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/57797/57797eq5.jpg">. Es sei darauf hingewiesen, dass dieser Korrekturfaktor speziell verwendet werden, nur dann, wenn das weiche Silikon gut an die Petrischale (oder steif Silikon) darunter hält (was hier der Fall ist).</li>
		<li>Berechnen Sie die Höhe h der die weiche Silikonschicht anhand der Menge an Silikon hinzugefügt und die Petrischale Durchmesser. Alternativ erhalten h direkt durch die Bestimmung der Z-Koordinate der oberen und unteren Flächen der Silikon-Schicht durch Phase-Bildgebung (geringfügige Verunreinigungen kommen in den Fokus an beiden Oberfläche). Beachten Sie, dass für eine große h (h2 &gt; Rδ), die Korrektur Faktor c liegt in der Nähe 1.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wiederholen Sie die Schritte 4.1-4.4 für jedes Eindringkörper. Durchschnitt des Elastizitätsmoduls gewonnen aus jeder Eindringkörper, die mittlere Elastizitätsmodul für die Silikon-Probe zu erhalten.</li>
</ol>

<ol><li>Handorf, A. M., Zhou, Y., Halanski, M. A., Li, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+stiffness+dictates+development%2C+homeostasis%2C+and+disease+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Organogenesis%22%5BJournal%5D)">Tissue stiffness dictates development, homeostasis, and disease progression.</a> Organogenesis. 11 (1), 1-15 (2015).</li>
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<li>Muhamed, I., Chowdhury, F., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biophysical+tools+to+study+cellular+mechanotransduction%5BTitle%5D)+AND+%22Bioengineering+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Biophysical tools to study cellular mechanotransduction.</a> Bioengineering (Basel). 4 (1), 12(2017).</li>
<li>Dumbali, S. P., Mei, L., Qian, S., Maruthamuthu, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endogenous+sheet-averaged+tension+within+a+large+epithelial+cell+colony%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomechanical+Engineering%22%5BJournal%5D)">Endogenous sheet-averaged tension within a large epithelial cell colony.</a> Journal of Biomechanical Engineering. 139 (10), 101008(2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Während die Kugel Einzug Methode einfach zu implementieren ist, Aufmerksamkeit auf die Wahl der Eindringkörper und die Dicke der Probe weichem Silikon zu entrichten. Die Gleichung zur Berechnung des Elastizitätsmoduls gilt unter einer Reihe von Bedingungen11und diese sind in der Regel erfüllt, wenn die Dicke der Probe Silikon > 10 % des Radius Eindringkörper ist und < ~ 13 x der Eindringkörper Radius. Wir fanden, dass Silikon Dicke von 5-10 x der Eindringkörper Radius eine gute Wahl, wobei die Pro...

Zellen in den weichen Geweben befinden sich in einem Mikro-Umgebung deren Steifigkeit in Kilopascal Palette1, im Gegensatz zu Gewebekultur Gerichte ist deren Steifigkeit mehrere Größenordnungen höher ist. Frühe Experimente mit Zellen auf extrazelluläre Matrix Protein-beschichtete weichen Untergründen zeigte, dass die Steifigkeit des Substrats beeinflusst, wie Zellen bewegen sowie halten uns an die extrazelluläre Matrix unter2,3. In der Tat beeinflusst die Substrat-Steifigkeit grundlegend die Zelle Funktion4 in gewissem Sinne ähnlich durchdringend biochemische Signale. Polyacrylamid-Gele (beschichtet mit extrazellulärer matrixproteine) sind (Wasser durchdringt) Hydrogele, die ausgiebig genutzt wurden als Kultursubstrate Zelle für Mechanobiology5Studien. Polydimethylsiloxan (PDMS), das am häufigsten verwendete Silikon (Polysiloxan), hat als eine steife Silikon mit Megapascal-Palette Steifigkeit für Mikron-Skala Fertigung6verbreitet. Seit kurzem weichem Silikon, die Substrate mit Steifheit im Bereich mehr physiologisch relevanten Kilopascal als Zelle Kultursubstrate für Mechanobiology Studien7,8angestellt gewesen sein.
Verschiedene Methoden wurden verwendet, um die Steifigkeit der flexible Substrate, einschließlich Rasterkraftmikroskopie, makroskopische Deformation des ganzen Proben auf Dehnung, Rheologie und Einzug mit Kugeln und sphärisch gekippt Microindentors9 Messen . Während jede Technik ihre vor- und Nachteile hat, ist Einzug mit einer Kugel eine besonders einfache, aber ziemlich genaue Methode, die lediglich den Zugang zu einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop. Einzug mit einer metallischen Kugel wurde verwendet, um die Steifigkeit der Hydrogele in früheren Arbeiten3,9,10messen. Frühwerk, das die Wichtigkeit des Substrats Steifigkeit zu Zelle Bewegung gezeigt verwendet diese Methode, um festzustellen, Hydrogel Substrat Steifigkeit3. Vor kurzem hat konfokalen Mikroskopie auch für ein elegantes Charakterisierung10verwendet.
Hier präsentieren wir eine Schritt für Schritt-Protokoll für die Zubereitung von einem weichen Silikon-Substrat, Kupplung fluoreszierende Perlen (und eine extrazelluläre Matrix Proteine wie Kollagen ich) nur auf der Oberseite imaging eine Einrücken Sphäre und der oberen Oberfläche mit phase und Fluoreszenz imaging, beziehungsweise, und schließlich analysiert die Bilder zur Berechnung des Elastizitätsmoduls des Substrats Silikon. Das weiche Silikon-Substrat vorbereitet auf diese Weise kann problemlos für Traktion Kraft-Mikroskopie Experimente verwendet werden. Der Einsatz von steifen Silikon (anstelle einer Petrischale) als Basis für das weiche Silikon ermöglicht auch Mechanobiology Studien mit einem externen Strecke. Gerechtfertigt, sind praktische Erwägungen notwendig zur Vermeidung von möglichen Komplikationen auch angegeben.

<table><tbody><tr><td>CY 52-276 A/B Silikonelastomer-Kit</td><td>&nbsp; Dow Corning</td><td>CY 52-276</td><td>Bei Raumtemperatur</td></tr><tr><td>lagern Thermo Scientific Pierce EDC</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI22980</td> Bei <td>-20° lagern; C</td></tr><tr><td>Thermo Wissenschaftlich&nbsp; Pierce Sulfo-NHS-Vernetzer</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-24510</td><td>Bei 4° lagern; C</td></tr><tr><td>Carboxyl fluoreszierende rosa Partikel, 0,4-0,6 &Mikro; m, 2 mL</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>CFP-0558-2</td><td>Lagern bei 4°; C, nicht einfrieren</td></tr><tr><td>1,0 mm Säuregewaschene Zirkoniumkügelchen</td><td>OPS Diagnostics LLC</td><td>BAWZ 1000-250-33</td><td></td></tr><tr><td>Tiefe UV-Kammer mit Ozonevakuator</td><td>Novascan Technologies, Inc.</td><td>PSD-UV4, OES-1000D</td><td></td></tr><tr><td>Weitfeld-Fluoreszenzmikroskop</td><td>Leica Microsystems</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>Collagen I, aus Rattenschwanz</td><td>Corning</td><td>354236</td><td>Stammkonzentration = 4 mg/ml; lagern bei 4°; C</td></tr><tr><td>ImageJ-NIH</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Public-Domain-Software</td></tr></tbody></table>

messung der steifigkeit weichem silikon substrate für mechanobiology studien mit einem weitfeld-fluoreszenz-mikroskop

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Weiche Gewebe im menschlichen Körper haben in der Regel Steifigkeit im Bereich Kilopascal (kPa). Entsprechend, Silikon und Hydrogel flexible Substrate nachweislich nützliche Substrate für die Kultivierung von Zellen in einem physischen Mikroumgebung, die teilweise in Vivo Bedingungen imitiert werden. Hier präsentieren wir Ihnen ein einfaches Protokoll für die Charakterisierung der Youngs Moduli isotrope lineare elastische Substrate, die in der Regel verwendet für Mechanobiology Studien. Das Protokoll besteht aus Vorbereitung eine weiche Silikon-Substrat auf einer Petrischale oder steif Silikon, Beschichtung der Oberfläche des Substrates Silikon mit fluoreszierenden Perlen, mit Hilfe einer Millimeter-Skala-Kugel an die Oberseite (durch die Schwerkraft), imaging die fluoreszierenden Einrücken Perlen auf der eingerückten Silikon-Oberfläche mit dem Fluoreszenzmikroskop, und analysieren die resultierenden Bilder zur Berechnung des Elastizitätsmoduls des Substrats Silikon. Kopplung der Substrat-Oberfläche mit einem Moduli extrazelluläre Matrix Protein (neben der fluoreszierenden Perlen) ermöglicht das Silikon Substrat leicht für Zelle Beschichtung und anschließendem Studium mit Traktion Kraft-Mikroskopie Experimente verwendet werden. Der Einsatz von steifen Silikon, anstelle einer Petrischale als Basis aus weichem Silikon, ermöglicht die Verwendung von Mechanobiology Studien mit externen Strecke. Ein besonderen Vorteil dieses Protokolls ist, dass ein Fluoreszenzmikroskop Weitfeld, die allgemein verfügbar in vielen Labors ist für dieses Verfahren erforderlichen Geräte. Wir zeigen dieses Protokolls durch die Messung des Elastizitätsmoduls von weichem Silikon Substraten von verschiedenen elastischen Moduli.

Mit der oben beschriebenen Protokoll, wir weichen Silikon in einem 35 mm Petrischale vorbereitet, bei 70 ° C für 30 min geheilt und fluoreszierende Microbeads gekoppelt (und Kollagen ich) auf die obere Fläche als schematisch in Abbildung 1dargestellt. Tiefen UV wurde zuvor für das eventuelle Protein Ankopplung an Substraten13verwendet. Beachten Sie, dass (I) die Aushärtung Bedingungen verwendet hier spezifisch für diese weiche Sil...

Substrate mit Steifheit im Bereich Kilopascal sind nützlich, um die Reaktion der Zellen auf physiologisch relevanten Mikroumgebung Steifigkeit zu studieren. Verwenden nur ein Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop, kann des Elastizitätsmoduls weichen Silikon-Gel mit einer Einbuchtung mit einer geeigneten Kugel bestimmt werden.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Diese Methode kann verwendet werden, um Substrate zu kategorisieren, die zur Untersuchung von Schlüsselphänomenen in der Mechanobiologie, der Zellmigration und der ersten Generation verwendet werden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie die Verwendung eines Weitfeldmikroskops erfordert, einem Gerät, das in vielen Labors üblich ist. Diese Methode kann angewendet werden, um den Elastizitätsmodul von Silizium- oder Polyacrylamidgel sowie von weichem isotropem linearem elastischem Material zu messen.Das mit dieser Methode vorbereitete und charakterisierte Substrat kann auch für selbststreckende Experimente mit der steifen Silikonbasis verwendet werden. Um das weiche Silikonsubstrat herzustellen, nachdem Sie jeweils etwa 1,75 Gramm der Komponenten A und B aus dem weichen Silikonelastomer-Kit abgewogen haben, geben Sie den größten Teil des gewogenen Teils von Komponente A in die B-Komponenten-Polystyrol-Wiegeschale und verwenden Sie einen geeigneten Applikatorstab, um die beiden Komponenten fünf Minuten lang miteinander zu mischen. Übertragen Sie die Mischung in eine 35 Millimeter große Petrischale und lassen Sie das Substrat einige Minuten lang gleichmäßig auf der Pet

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Research

Forschung

JoVE Journal

Bioengineering

Biotechnik

Hier beschreiben wir eine schnelle und einfache Methode, um Zellen Steifigkeit zu messen. Das allgemeine Prinzip dieser Methode besteht darin, Membranverformung in Reaktion auf wohldefinierte negativen Druck durch eine Mikropipette an die Zelloberfläche aufgebracht messen. Diese Methode bietet ein leistungsfähiges Werkzeug zur biomechanischen Eigenschaften von Substrat-anhaftenden Zellen zu studieren.

Mikropipette Aspiration von Substrat-attached Cells zu schätzen Zelle Stiffness

Dieses Papier zeigt ein Protokoll, um die mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mittels Mikroindentation mit einem Atomic Force Microscope (AFM) zu charakterisieren.

Messung der mechanischen Eigenschaften von lebenden Zellen mit Atomic Force Microscopy

Hier wird eine Methode beschrieben, die eine schnelle, effiziente und kostengünstige Herstellung von Polyacrylamid-Gelen in einem Multiwell-Plattenformat ermöglicht. Die Methode erfordert keine spezielle Ausrüstung und kann von jedem Forschungslabor leicht übernommen werden. Es wäre besonders nützlich in der Forschung, die sich auf das Verständnis steifigkeitsabhängiger Zellreaktionen konzentriert.

Einfache Polyacrylamid-basierten Multiwell Steifigkeit Assay für das Studium der Steifigkeit abhängige Zell-Antworten

Ein neuartiges Bildgebungsprotokoll wurde entwickelt, das einen speziellen motorbetriebenen mechanischen Aktuator verwendet, um die Messung von Echtzeitreaktionen auf mechanische Dehnung in lebenden Zellen zu ermöglichen. Das für die Mechanobiologie relevante System kann Dehnungen von bis zu 20 % aufbringen und ermöglicht gleichzeitig eine Bildgebung nahezu in Echtzeit mit konfokaler oder Rasterkraftmikroskopie.

Live Cell Imaging bei Mechanical Stretch

Wir präsentieren detaillierte Protokolle für die Isolierung von Aorten aus der Maus und die Messung ihres Elastizitätsmoduls mittels Rasterkraftmikroskopie.

Messung der Steifigkeit von<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Maus Aorten Mit Rasterkraftmikroskopie

Mit Hilfe eines zuvor entwickelten Geräts zur mechanischen Belastung von Anbauzellen beschreibt dieser Beitrag eine neu gestaltete Substratum-Geometrie und ein maßgeschneidertes Gerät zur hochauflösenden Einzeller-Abbildung von angespannten Zellen mit einem 100x Öl-Immersionsziel.

Hochauflösende Bildgebung von Kerndynamik in Live-Zellen unter Uniaxialer Tensile-Straße

Wir präsentieren ein Protokoll zur Messung der Elastizitätsmodule von kollagenreichen Bereichen in normaler und kranker Leber mittels Rasterkraftmikroskopie. Der gleichzeitige Einsatz der Polarisationsmikroskopie bietet eine hohe räumliche Präzision zur Lokalisierung kollagenreicher Areale in den Leberabschnitten.

Messung der Lebersteifigkeit mittels Rasterkraftmikroskopie gekoppelt mit Polarisationsmikroskopie

Vor kurzem haben wir die retinale Kapillarversteifung als neues Paradigma für retinale Dysfunktion im Zusammenhang mit Diabetes identifiziert. In diesem Protokoll werden die Schritte zur Isolierung von retinalen Kapillaren und der subendothelialen Matrix aus retinalen Endothelkulturen erläutert, gefolgt von einer Beschreibung der Steifigkeitsmesstechnik mittels Rasterkraftmikroskopie.

Isolierung von retinalen Kapillaren und subendothelialer Matrix der Maus zur Steifigkeitsmessung mittels Rasterkraftmikroskopie

Hier präsentieren wir ein vielseitiges äquibiaxiales Streckgerät, das pneumatisch betätigt wird und mit der hochauflösenden Mikroskopie kompatibel ist.

Äquibiaxiales Stretching-Gerät für die konfokale Fluoreszenzmikroskopie mit lebenden Zellen mit hoher Vergrößerung

Obwohl die Steifigkeit der extrazellulären Matrix (ECM) ein entscheidender Regulator des zellulären Verhaltens ist, bleiben die zugrunde liegenden Sensor- und Transduktionsmechanismen unklar. Um dem entgegenzuwirken, stellen wir Protokolle zur Herstellung von polyacrylamid- und silikonbasierten Substraten mit abstimmbarer Steifigkeit bereit, um unser Verständnis des Zell-ECM-Übersprechens zu vertiefen.

Erzeugung von Polyacrylamid- und Silikon-Extrazellmatrixsubstraten mit definierter Steifigkeit für Anwendungen in der Zellbiologie

Erfahren Sie, wie Sie die Steifigkeit weicher Silikonsubstrate für Mechanobiologie-Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop messen. Diese Methode ermöglicht präzise Bestimmung des Elastizitätsmoduls für Zellmigrationsforschung.

Messung der Steifigkeit weichem Silikon Substrate für Mechanobiology Studien mit einem Weitfeld-Fluoreszenz-Mikroskop

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