Hsp33 des Redox-regulierten Chaperon Aktivität definieren und Mapping Konformationsänderungen auf Hsp33 mit Wasserstoff-Deuterium Austausch Massenspektrometrie

Der hier vorgestellte Arbeitsablauf kann dazu beitragen, unser Verständnis der zellulären Rolle von Chaperonen unter oxidativen Stressbedingungen zu erweitern. Insbesondere kann es helfen zu verstehen, wie Chaperone die Proteinaggregation während der Entfaltung verhindern. Denn diese beiden Rückseiten bieten unterschiedliche Techniken einen Einblick in die Aktivität von flaggengetrennten Chaperonen.

Es kann auch verwendet werden, um andere Proteine auf Wechselwirkungen wie Enzyminteraktionen und Proteindynamik zu untersuchen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da sie die Verwendung verschiedener Instrumente erfordert, was für neue Benutzer eine Herausforderung darstellen kann. Schleudern Sie zunächst eine zuvor aufgetaute Proteinprobe herunter, um Aggregate zu entfernen.

Fügen Sie dann fünf millimolare DTT und 20 mikromolare Zinkchloride hinzu und inkubieren Sie die Probe mindestens 1,5 Stunden lang bei 37 Grad Celsius. Zur Entnahme des DVB-T äquilibriert man eine Entsalzungssäule mit 40 μmolar Kaliumphosphatpuffer, indem man die Säule vollständig mit dem Puffer füllt und heraustropfen lässt. Drücken Sie mit einer Pinzette vorsichtig auf den weißen Scheibenfilter in der Säule und entfernen Sie ihn.

Füllen Sie die Säule mit Kaliumphosphatpuffer und zentrifugieren Sie sie drei Minuten lang bei 1000 mal G. Nach der Zentrifugation die Säule in ein sauberes Röhrchen überführen und die Proteinprobe langsam in die Mitte der Säule geben. Die Säule wird zwei Minuten lang bei 1000 mal G zentrifugiert, so dass sich das DTT-freie Protein im Durchfluss befindet.

Überprüfen Sie nun die Proteinkonzentration und messen Sie die Absorption bei 280 Nanometern. Die Hälfte der Proteinproben wird in Aliquote verteilt. Inkubieren Sie die Aliquote 20 Minuten lang unter anaeroben Bedingungen, um den Sauerstoff vollständig zu entfernen.

Verschließen Sie dann die Röhrchen mit Plastikfolie und lagern Sie die Proben unter kalten Bedingungen. Geben Sie anschließend frisch zubereitetes fünf Millimolare Wasserstoffperoxid in die verbleibende Proteinprobe und inkubieren Sie es drei Stunden lang bei 40 Grad Celsius unter Schütteln. Nach der Zentrifugation wird die Proteinkonzentration überprüft, anschließend werden die oxidierten Proteine in Aliquote aufgeteilt und unter kalten Bedingungen gelagert.

Bereiten Sie das denaturierte Substrat vor, indem Sie 12 mikromolare Citratsynthase über Nacht in 40 millimolaren HEPES und 4,5 molaren Guanidiniumchlorid inkubieren. Öffnen Sie am nächsten Tag die Fluorspektrometer-Software und gehen Sie zur Zeitverlaufsmessung. Stellen Sie die Anregungsbandbreite auf 2,5 Nanometer ein.

Die Anregungswellenlänge beträgt 360 Nanometer. Die Emissionswellenlänge beträgt 360 Nanometer. Die Emissionsbandbreite beträgt fünf Nanometer.

Und das Datenintervall auf 0,5 Sekunden. Stellen Sie die Temperatur auf 25 Grad Celsius ein. Bereiten Sie die Probe vor, indem Sie 1600 Mikroliter 40 millimolare HEPES in eine Quarzküvette geben.

Setzen Sie die Küvette in den Probenhalter eines Fluorostrometers ein, damit die Probe die gewünschte Temperatur erreicht. Nachdem Sie das Rühren auf 600 U/min eingestellt haben, beginnen Sie mit der Messung, bis die Basislinie erreicht ist. Um die Citratsynthase-Aggregation in Abwesenheit eines Chaperons zu messen, fügen Sie 120 Sekunden nach der Messung 10 Mikroliter denaturierte Citratsynthetase hinzu.

Setzen Sie dann die Messung 1200 Sekunden lang fort. Um die Citratsynthase-Aggregation in Gegenwart von Hsp33 zu messen, fügen Sie Hsp33 60 Sekunden in die Messung ein. Nach weiteren 60 Sekunden werden 10 Mikroliter denaturierte Citratsynthetase zugegeben und die Messung 1200 Sekunden lang fortgesetzt.

Laden Sie als Nächstes die Datendatei hoch, um eine Datenanalyse und Rauschentfernung durch Kfits durchzuführen. Um Rauschen zu entfernen, wählen Sie die Analyseparameter, verwenden Sie automatisch bestes Modell und wählen Sie Rauschen ist immer über dem Signal. Entfernen Sie offensichtliche Ausreißer manuell mit den einstellbaren grünen und roten Linien, die die Geräusche oberhalb der grünen Linie und unterhalb der roten Linie filtern.

Legen Sie anschließend die Grundlinie und die Anpassungskurve fest. Nachdem Sie die Rauschschwelle angewendet haben, laden Sie die verarbeiteten Daten herunter. Bereiten Sie Proben von Proteinsubstratkomplexen vor, indem Sie Citratsynthetase zu Hsp33 in einem Verhältnis von 1 bis 1,5 bei 43 Grad Celsius hinzufügen.

Verwenden Sie mindestens vier Schritte und inkubieren Sie die Proben nach jeder Zugabe 15 Minuten lang bei 43 Grad Celsius, um eine komplexe Bildung zu ermöglichen. Die Proben werden 30 Minuten lang bei 16000 mal G bei vier Grad Celsius zentrifugiert, um alle Aggregate zu entfernen. Geben Sie dann die Proben in 150 Mikroliter Glaseinsätze und überführen Sie sie in Fläschchen.

Legen Sie sie dann in die richtigen Schalen. Halten Sie die Puffer H und D bei 25 Grad Celsius und halten Sie die Proben und den Abschreckpuffer bei null bis zwei Grad Celsius. Schalten Sie anschließend alle Kühleinheiten des Massenspektrometers manuell ein.

Sobald alle Kühlsysteme ihre Zieltemperaturen erreicht haben, schalten Sie sowohl die HPLC- als auch die Ladepumpen manuell ein. Öffnen Sie die Software, die beide Pumpen steuert, sowie die Software, die das Massenspektrometer steuert, und stellen Sie sicher, dass sich das MS im Standby-Modus befindet. Trennen Sie anschließend das HPLC-Auslassventil von der MS-Quelle.

Waschen Sie das System zuerst mit einer Dreifachreinigerlösung. Dann mit Puffer B und schließlich mit Puffer A.Dann setzen Sie die Pepsinsäule in das System ein. Nachdem Sie das System mit gleichmäßigem Durchfluss und konstantem Druck gewaschen haben, setzen Sie das HPLC-Auslassventil in die MS-Quelle ein und schalten Sie das MS ein.

Öffnen Sie nun die Software. Erstellen Sie eine laufende Sequenz und geben Sie alle Zeitpunkte, Probennamen und -positionen in die Trays sowie die Puffernamen und -positionen ein. Analysieren Sie nach Abschluss des Laufs die Peptidabdeckung der Probe, indem Sie die nicht deuterierten Kontrollproben durch die Software laufen lassen.

Übertragen Sie Daten in die HDX Workbench-Software, und analysieren Sie die Ergebnisse mit der Software. Speichern Sie die ausgewählten Peptide und fahren Sie mit der Analyse der Deuteriumaufnahme fort. Die chemische Denaturierung führt zu einer schnellen Citratsynthetase-Aggregation, die durch die Wiederfaltung eines vollständig denaturierten Proteins unter ungünstigen Pufferbedingungen induziert wird.

Auf der anderen Seite resultiert die thermisch induzierte Aggregation aus einer relativ langsamen Entfaltung des nativ gefalteten Substrats. Bei beiden Formen der Denaturierung wurde durch die Zugabe von oxidiertem Hsp33 die Aggregation vollständig aufgehoben und die 360-Nanometer-Messwerte auf vernachlässigbare Werte gesenkt. Das Vorhandensein eines reduzierten Hsp33 hatte keinen Einfluss auf die Stabilität der Citratsynthetase und ergab eine Aggregationskurve, die derjenigen ähnelte, die in Abwesenheit eines Chaperons nachgewiesen wurde.

Das Deuterierungsmuster zwischen dem gebundenen und ungebundenen Chaperon Hsp33 und seinem Substrat Citratsynthetase zeigt eine Client-Interaktionsstelle innerhalb der C-terminalen Redoxschalterdomäne des Chaperons. Reduziertes Hsp33 hat eine vollständig geordnete Struktur, wird aber funktionsfähig, wenn es oxidativen Stress wahrnimmt. Während das reduzierte gebundene und ungebundene Hsp33 ähnliche Peptidkurven erzeugt, zeigt das oxidierte Hsp33 einen Deuterationsunterschied von 30 % zwischen dem gebundenen und dem ungebundenen Chaperon, wobei bestimmte Bereiche des gebundenen Proteins auf eine allosterische Behinderung hinweisen.

Nach der Etablierung kann der Streuassay innerhalb weniger Stunden abgeschlossen werden, während die DHEX-Methodik bei ordnungsgemäßer Durchführung in zwei bis vier Tagen abgeschlossen werden kann. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, im Voraus zu planen. Denken Sie daran, dass die beschriebenen Bedingungen wie Temperatur, Inkubationszeiten und Pufferlösungen proteinspezifisch sind und für jedes Protein optimiert werden müssen.

Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden wie Vernetzung oder Fällung durchgeführt werden, um Studien zu den Wechselwirkungen zwischen Chaperonsubstraten zu ergänzen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass diese Technik Forschern auf dem Gebiet der Strukturbiologie den Weg geebnet hat, die Proteinplastizität in molekularen Chaperonen zu erforschen.