Name: Multimodale Volumetrische Retinal Imaging von schrägen Scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) und optische Kohärenztomografie (OCT) (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-04T14:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 22 s
Description: Erfahren Sie multimodale volumetrische Netzhautbildgebung mit oSLO und OCT für die Diagnose von diabetischer Retinopathie. Diese Methode ermöglicht hochkontrastreiche 3D-Darstellungen einzelner Kapillaren in vivo.

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Finanzierung ist von Evans medizinische Stiftung Fördermittel aus Boston Medical Center sowie einen Untervertrag von NIH 5R01CA183101, BU-CTSI Pilot gewähren, 1UL1TR001430, BU-Joslin pilot-Programm und BU-CTSI KL2TR001411.

Alle hier beschriebene Methoden wurden von Animal Care und Nutzung Ausschuss (ACUC) von Boston Medical Center genehmigt.
1. System-Setup
<ol><li>oSLO-System<ol>
<li>Verwenden einer Laserquelle Supercontinuum als System-Laserquelle.<ol>
<li>Höheren Wellenlängenbereich (650-2000 nm) Bereich des sichtbaren Lichts (450-650 nm) durch einen dichroitischen Spiegel (DM1) trennen. Erweitern Sie das Spektrum mit einem Paar dispersive Prismen nach den Strahl durch einen Strahlteiler Polarisation (PBS).</li>
			<li>Legen Sie einen Schlitz um die Erregung Wellenlängenbereich (475-495 nm) auszuwählen. Verwenden Sie einen reflektierenden Spiegel reflektieren den gefilterten Strahl zurück auf das Prisma paar und Paar dann das Licht in die Singlemode-Faser (SMF 1).</li>
			<li>Verwenden Sie ein Spektrometer zur Bestätigung der Auswahl der Wellenlänge am Ausgang der single-Mode-Faser.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verbinden Sie die Singlemode-Faser mit zwei kaskadierte LWL-Koppler, wie in Abbildung 2dargestellt. Einer der Faser-Ausgangs-Port aus der zweiten Faserkoppler liefert das Licht auf das oSLO-System.</li>
		<li>Lassen Sie den Laser zuerst im oSLO-System.<ol>
<li>Den Laser von einem Galvanometer-Spiegel (GM1) abzulenken. Relais der Laser zu einem zweiten Galvanometer-Spiegel (GM2) durch ein 1:1 Teleskopsystem, und weitere Relais auf die Pupille des Auges durch einen 3:1 Teleskopsystem.</li>
			<li>Installieren Sie einen dichroitischen Spiegel (DM2) innerhalb des Systems der 3:1 Teleskop, die Fluoreszenz-Signale zu reflektieren.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Das 3:1 Teleskopsystem und dichroitische Spiegel (DM2) auf eine angepasste Taube Schweif Schieberegler zum Ausgleich der optischen Achse und erstellen die schräge Beleuchtung zu scannen, wie in Abbildung 3gezeigt zu montieren. Verwenden Sie ein Bremssattel genau die Offset Länge beliebig steuern.</li>
		<li>Fluoreszenz imaging Strahlengang.<ol>
<li>Die Fluoreszenz von der dichroitischen Spiegel und Relais zum dritten Galvanometer-Spiegel um das langsame Scannen de-Scannen zu reflektieren.</li>
			<li>Relais das Licht zu einem bildgebenden Objektiv von einem anderen 1:1 Teleskopsystem. Installieren Sie die oben genannten Optik auf einem Verschiebetisch. Hinweis: Zusätzliche Übersetzung zweistufig sind unter dem dritten Galvanometer-Spiegel (GM3), Redundanz in die Anzahl der Freiheitsgrade sorgen für die Optimierung der Bildgebung installiert.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Montieren Sie eine endgültige imaging-System auf einer Bühne, die hat drei Freiheitsgrade (Rotation und zwei Achsen der Übersetzung). Verwenden Sie eine planare Kamera, um die Cross-Sectional Fluoreszenzbilder zu erfassen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Optische Kohärenz Tomographie System<ol>
<li>Verwenden Sie die gleichen Supercontinuum Laserquelle als System-Laserquelle.<ol>
<li>Trennen Sie das nahe Infrarot (NIR) Bereich (650-900 nm) von Restlicht (650-2000 nm) durch ein anderes dichroitische Spiegel (DM3). Verwenden Sie einen langen Pass Filter um ausreichend Bandbreite, um 800-900 nm weiter einzuschränken. Koppeln Sie den Strahl in die Singlemode-Faser (SMF 2).</li>
		</ol>
</li>
		<li>Verbinden Sie die Singlemode-Faser mit den anderen Eingang der zwei kaskadierte LWL-Koppler, mit der blauen oSLO Anregung zu kombinieren. Lenken Sie das Licht aus der zweiten Ausgangs-Port des zweiten Faserkoppler, OCT referenzarm, verfügt über eine Variable Graufilter (VNDF), Streuung Entschädigung Platten und einen reflektierenden Spiegel. Hinweis: Das Licht aus dem referenzarm zurück und das Auge setzt bei der zweiten LWL-Koppler und wird an das OCT-Spektrometer, das Signal zu sammeln.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Die Datenerfassung<ol>
<li>Verwenden Sie eine Datenerfassungs-System-Software in LabVIEW geschrieben und aus dem Scan-Protokoll von OCTA7,8,9,10geändert. Für jeden B-Scan, eine 80 % Einschaltdauer sah Zahn mit 500 Schritten ist die Ausgabe von einem Analogausgang (AO1) X Steuerung "schnelle Scan Spiegel, GM2.</li>
		<li>Auslösen der Zeilenkamera bei jedem Schritt Daten für das Office-Anpassungstool zu erwerben nur, wenn der Spiegel in der Scan-Richtung ist. Legen Sie die Belichtungszeit für die Zeilenkamera 17 µs sein.</li>
		<li>Um die OCTA-Signal zu erhalten, wiederholen Sie die Messung 5 Mal am gleichen Ort B-Scan.</li>
		<li>Legen Sie die Ausgaberate AO bei 100 kHz und die OCT-a-line-Rate bei 50 kHz. Steuern der y' slow Scan Spiegel, GM1, durch Rampen Wellenform. Synchronisieren Sie den de-Scannen Spiegel, GM3, mit GM1, das langsame Scannen de-scannen.</li>
		<li>Die planare Kamera auslösen, indem Sie ein anderes Analogausgang Board (AO2) für eine fluoreszierende Aufnahme bei jeder y' Lage. Die bildgebende Größe zuschneiden oder bin die Nachbar-Pixel zur Erhöhung der Geschwindigkeit und Empfindlichkeit wie gewünscht.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. System Ausrichtung
<ol><li>Passen Sie den Schlitz in der oSLO-Lichtquelle die blauen Erregung Wellenlänge auswählen. Verwenden ein Spektrometers zur Überwachung des Spektralbereichs um rund 475-490 nm.</li>
	<li>Den Schieberegler Taube Heck montieren um die optische Achse von ~ 5 mm verschieben. Dadurch wird ein Offset bei der Ratte-Schüler von ~1.7 mm, was in einem schrägen Winkel von ~ 15 ° auf der Netzhaut.</li>
	<li>Verschiebetisch der Fluoreszenz-Detektion-Optik durch die gleichen 5 mm einstellen.</li>
	<li>Passen Sie die endgültige Fluoreszenz imaging-System um ~ 30 ° zu sein.</li>
	<li>Messen Sie die optische Leistung mit einem Leistungsmesser. Sicherstellen Sie, dass die blauen oSLO erregerleistung ist ≤0.2 mW und OCT Laser macht ≤0.8 mW, die Netzhaut nicht beschädigt wird. Hinweis: Basierend auf dem ANSI-Standard, die maximale permissive Belichtung (MPE) an der Netzhaut ist auf der Ebene der ~ 2mW7,8 im sichtbaren Bereich des Lichts. Nach der Formel von Delori Et al. 9, die Fehlergrenze für das nahe Infrarot-Licht ist etwa doppelt so hoch als das sichtbare Licht, bei etwa 4 mW.</li>
</ol>3. in Vivo Tierversuch
<ol><li>Übertragen Sie eine 12-Wochen männliche lange Evans Ratte in der Induktion Kammer. Die Ratte mit 4,5 % Isofluran in Sauerstoff für 10 Minuten mit einer Durchflussmenge von 2 L/min durch einen Verdampfer Isoflurane zu betäuben.<ol>
<li>Bestätigen Sie die Tiefe der Narkose wie durch einen Mangel an Rückzug Reflex während einer interdigital Prise bestimmt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Legen Sie nach der Induktion die Ratte auf Inhaber eines 5-Achsen (X, y, Z-Übersetzungen, Gier und Tonhöhe). Sorgen Sie für zusätzliche Wärme mittels einer beheizten Objekttisch, zirkulierenden Warmwasser Decke oder eine andere geeignete Methode in einem längeren Experiment. Pflegen Sie die Narkose auf 1,5 % des Isofluorane mit einer Durchflussmenge von 2 Liter/Minuten während der restliche Teil des Experiments. Wenn keine Induktion-Kammer mit aktiven Auspuff verwenden, sollte die Induktion Kammer auf einem Backdraft oder Randabsaugung Tisch oder unter einen Schnorchel, Isofluran Aufräumen platziert werden.</li>
	<li>Erweitern Sie die Pupille mit 1 % Tropicamid ophthalmologischen Lösung für 2 Minuten. Tragen Sie 0,5 % Tetracaine HCl ophthalmologischen Lösung auf die Ratte Auge für zusätzliche örtliche Betäubung, auf, bei Bedarf. Auge mindestens einmal pro Minute während des Tests mit kommerziellen künstliche Tränen befeuchtet.</li>
	<li>Fluorescein Salz (10 % w/w) oder FITC zu injizieren (10 % w/w) in steriler Kochsalzlösung verdünnt (0,1-0,3 mL) durch die Rute Vene mit einer 1 mL Spritze und ein 29G Nadel.</li>
	<li>Schalten Sie die Laserquelle. Ort ein Graufilter, die blaue leichte Erregung bei der Ausrichtung zu vermindern. Messen Sie die Kraft des Lichtes OCT ~0.8 mW zu sein, und das blaue Licht < 0,01 mW auf die Bildung des grauen Stars zu vermeiden.</li>
	<li>Startmodus der Galvanometer Scannen und Ausrichtung. Passen Sie die Höhe der den Augapfel zu einen stationären Laser auf der Hornhaut vor Ort machen. Passen Sie die Ratte augenposition um den Rand der Pupille etwa senkrecht zum Laser machen, und versetzt den Laser auf der apikalen Mitte des Auges, um ca. ~1.5 mm.</li>
	<li>Tierische pedaldom weiter bis OCT Bilder optimale Qualität zu erreichen. In der X' schnell Abtastrichtung, stellen sicher, dass der Querschnitte B-Bild flach erscheint. Beim Umschalten auf die y' Scanrichtung zu verlangsamen, sicherstellen, dass der Querschnitt B-Bild scheint geneigt, wegen der schrägen scannen.</li>
	<li>Graufilter, der blaue leichte Erregung zu entfernen und die Futtermittel von der Kamera in Echtzeit zu überwachen. Cross sectional fluoreszierende Bild sollte angezeigt werden, zeigt Blutgefäße erscheinen in verschiedenen Tiefen.<ol>
<li>Stellen Sie den Fokus der letzten Fluoreszenz imaging-System um den optimalen Fokus zu erreichen. Lassen Sie Feineinstellungen der augenposition in der seitlichen Ebene, optimale oSLO Bildqualität zu erreichen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beginnen Sie nach der Ausrichtung, gleichzeitige OCTA und volumetrische Fluorescein Angiographie (vFA) zu erwerben.</li>
	<li>Die volumetrische Bilder für OCTA und oSLO von Matlab zu konstruieren. Die Algorithmen werden zuvor im Detail10beschrieben. Erzeugen Sie retinale Vasculatures Tiefe gelöst durch Segmentierung Bild.</li>
	<li>Schalten Sie nach Abschluss der Bildgebung den Laser, lassen Sie das Tier tragen Sie einige ophthalmologische Salbe auf die Augen auf und dann legen Sie das Tier in einer Box Erholung.</li>
	<li>Nicht unbeaufsichtigt lassen das Tier bis es ausreichend Bewusstsein zur Aufrechterhaltung der sternalen liegen wiedererlangt hat oder wie pro institutionelle Politik.</li>
</ol>

<ol><li>Webb, R. H., Hughes, G. W., Delori, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Confocal+scanning+laser+ophthalmoscope%5BTitle%5D)+AND+%22Applied+Optics%22%5BJournal%5D)">Confocal scanning laser ophthalmoscope.</a> Applied Optics. 26 (8), 1492-1499 (1987).</li>
<li>Roorda, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+optics+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Adaptive optics scanning laser ophthalmoscopy.</a> Optics Express. 10 (9), 405-412 (2002).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4638169/">Optical coherence tomography.</a> Science. 254 (5035), 1178-1181 (1991).</li>
<li>de Carlo, T. E., Romano, A., Waheed, N. K., Duker, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+review+of+optical+coherence+tomography+angiography+%28OCTA%29%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Retina+and+Vitreous%22%5BJournal%5D)">A review of optical coherence tomography angiography (OCTA).</a> International Journal of Retina and Vitreous. 1 (1), 5(2015).</li>
<li>Jia, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Optical+Coherence+Tomography+Angiography+of+Choroidal+Neovascularization+in+Age-Related+Macular+Degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Quantitative Optical Coherence Tomography Angiography of Choroidal Neovascularization in Age-Related Macular Degeneration.</a> Ophthalmology. 121 (7), 1435-1444 (2014).</li>
<li>Chen, C. -L., Wang, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+coherence+tomography+based+angiography+%5BInvited%5D%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Optical coherence tomography based angiography [Invited].</a> Biomedical Optics Express. 8 (2), 1056-1082 (2017).</li>
<li>Yi, J., Chen, S. Y., Shu, X., Fawzi, A. A., Zhang, H. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+retinal+imaging+using+visible-light+optical+coherence+tomography+guided+by+scanning+laser+ophthalmoscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Human retinal imaging using visible-light optical coherence tomography guided by scanning laser ophthalmoscopy.</a> Biomedical Optics Express. 6 (10), 3701-3713 (2015).</li>
<li>Zhang, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-band+spectral-domain+optical+coherence+tomography+for+in+vivo+imaging+the+spectral+contrasts+of+the+retinal+nerve+fiber+layer%5BTitle%5D)+AND+%22Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Dual-band spectral-domain optical coherence tomography for in vivo imaging the spectral contrasts of the retinal nerve fiber layer.</a> Optics Express. 19 (20), 19653-19667 (2011).</li>
<li>Delori, F. C., Webb, R. H., Sliney, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximum+permissible+exposures+for+ocular+safety+%28ANSI+2000%29%2C+with+emphasis+on+ophthalmic+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+the+Optical+Society+of+America+a-Optics+Image+Science+and+Vision%22%5BJournal%5D)">Maximum permissible exposures for ocular safety (ANSI 2000), with emphasis on ophthalmic devices.</a> Journal of the Optical Society of America a-Optics Image Science and Vision. 24 (5), 1250-1265 (2007).</li>
<li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Volumetric+fluorescence+retinal+imaging+in+vivo+over+a+30-degree+field+of+view+by+oblique+scanning+laser+ophthalmoscopy+%28oSLO%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Optics+Express%22%5BJournal%5D)">Volumetric fluorescence retinal imaging in vivo over a 30-degree field of view by oblique scanning laser ophthalmoscopy (oSLO).</a> Biomedical Optics Express. 9 (1), 25-40 (2018).</li>
</ol>

Ji Yi hält eine ausstehende Patent für oSLO. Die anderen Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Hier haben wir beschrieben, oSLO, eine in Vivo Volumetrische fluoreszierende Retinal imaging Technik mit einem FOV über 30°. Im Vergleich zu OCT, eines aktuellen Behandlungsstandards bildgebendes Verfahren in der Augenheilkunde, oSLO bietet eine ähnliche 3D imaging-Funktion doch erlaubt Fluoreszenz-Kontrast, der OAT nicht anfällig ist. Der Vorteil von oSLO ist, dass es nur einen rasterscan erfordert und die nahtlose Kombination von OCT erlaubt, die zwei sich ergänzende Techniken für Struktur- und fluoreszierende...

Augenheilkunde und Vision Wissenschaft profitieren von der modernen optischen bildgebenden Verfahren, da die Netzhaut mit Licht leicht erreicht werden kann. Fluoreszenz retinale Bildgebung ist ein wichtiges Instrument bei der Diagnose und Behandlung von Gefäßerkrankungen chorioretinalen wie Diabetische Retinopathie (DR) und Altersbedingte Makula-Degeneration (AMD), die Ursachen von Blindheit in den Vereinigten Staaten führen.
Jedoch ist es immer noch schwierig, ein großes Sichtfeld (FOV), dreidimensionale (3D) Retinal imaging mit Fluoreszenz-Bildgebung zu erwerben. Fundus-Fotografie verfügt nicht über die Tiefe-Lösung von Fähigkeit und diffuses Licht nicht ablehnen. Die Vermischung von Signalen unterschiedlicher Tiefe reduziert dadurch die Bildqualität. Scanning Laser Ophthalmoskopie (SLO) und konfokale SLO (cSLO) kann die Wirkung von diffusem Licht mithilfe konfokale gating1reduzieren. Es ist jedoch schwierig für SLO oder cSLO eine menschliche Netzhaut 3D-Bild aufgrund der Begrenzung der Schärfentiefe zu erwerben. Adaptiver Optik SLO (AOSLO) bieten hervorragende Auflösung und Kontrast korrigieren der Wavefront Aberrationen durch das menschliche Auge eingeführt. Jedoch müsste AOSLO Z-Stapeln für Volumetrische Bildverarbeitung2. Optische Kohärenz Tomographie (OCT)3 und OCT angiographiesysteme (OCTA) überwinden diese Einschränkungen um dreidimensionale (3D) anatomische und vaskuläre Bilder4,5,6, sondern die Farbstoff-freie Natur bieten Oktober kann nicht auslaufen bezeichnend für vaskuläre Dysfunktion visualisieren.
Dieses Protokoll beschreibt eine neuartigen multimodale Plattform für 3D Volumetrische Fluoreszenz Retinal imaging, nämlich schräg scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO). In diese imaging-System eine schräge Abtastung entsteht durch eine Taube Schweif Schieberegler und eine endgültige imaging-System orientiert sich in einem Winkel zur Fluoreszenz Kreuz Schnittbilder zu erkennen. Das System nutzt Laser-scanning-Methoden, und diese Techniken ermöglichen einfache Einbindung mit OCT als ergänzende volumetrischen strukturellen bildgebenden Modalität. Die aktuelle Tiefe Auflösung beträgt etwa 25 µm in der Ratte Netzhaut und das Sichtfeld beträgt 30°. Im Wesentlichen der oSLO ermöglicht eine fluoreszierende Version Okt. und sind gleichzeitig mit OCT kombinierbar und OCTA über einem großen FOV.
In diesem Protokoll werden wir das Setup des oSLO, die Methode der Ausrichtung und den Bau, die Methode der in-Vivo Bildgebung der Ratte Netzhaut und die repräsentativen Ergebnisse beschreiben.

<table><tbody><tr><td>Superkontinuums-Laserquelle</td><td>NKT Photonics</td><td>SuperK EXTREME EXU-OCT6</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel (DM1)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP650R</td><td></td></tr><tr><td>dichroitischer Spiegel (DM2)</td><td>Chroma</td><td>ZT514/1064rpc</td><td></td></tr><tr><td>Dichroitischer Spiegel (DM3)</td><td>Thorlabs</td><td>DMLP900R</td><td></td></tr><tr><td>Singlemode-Faser (SMF 1)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-460B-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Singlemode-Faser (SMF 2)</td><td>Thorlabs</td><td>P3-780A-FC-2</td><td></td></tr><tr><td>Glasfaserkoppler</td><td>Thorlabs</td><td>TW850R5A2</td><td></td></tr><tr><td>1:1 Teleskopsystem</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-100-A&mal; </td><td></td>2</tr><tr><td>3:1 Teleskop System</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-150-A&mal; </td><td></td>2</tr><tr><td>3:1 Teleskop System</td><td>Thorlabs</td><td>AC254-50-A&mal; </td><td></td>2</tr><tr><td>Galvo-Spiegel (GM1,GM2)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS201&mal; </td><td></td>2</tr><tr><td>De-sacn Galvo Spiegel (GM3)</td><td>Thorlabs</td><td>GVS011</td><td></td></tr><tr><td>Objektiv</td><td>Olympus</td><td>UplanSApo 20&mal;/0.75</td><td></td></tr><tr><td>Final Imaging</td><td>System Olympus</td><td>UplanFL N 10&fach;/0.3</td><td></td></tr><tr><td>Final Imaging System</td><td>Computar</td><td>12-36mm/1:2.8</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>PCO</td><td>Pco.pixelfly USB</td><td></td></tr><tr><td>Filter</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr><tr><td>Montierter stufenloser ND-Filter</td><td>Thorlabs</td><td>NDC-50C-4M-A</td><td></td></tr><tr><td>Zeilenkamera</td><td>Thorlabs</td><td>SPL2048-140K</td><td></td></tr><tr><td>Analoge Ausgangskarte (AO1)</td><td>National Instrument</td><td>PCI-6731</td><td></td></tr><tr><td>Analoge Ausgangskarte (AO2)</td><td>National Instrument</td><td>PCIe-6351</td><td></td></tr><tr><td>Langpassfilter</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0800</td><td></td></tr></tbody></table>

multimodale volumetrische retinal imaging von schrägen scanning laser ophthalmoskopie (oslo) und optische kohärenztomografie (oct)

Multimodal Volumetric Retinal Imaging by Oblique Scanning Laser Ophthalmoscopy (oSLO) and Optical Coherence Tomography (OCT)

Während Fluoreszenz-Bildgebung in der Augenheilkunde weit verbreitet ist, ist ein großes Sichtfeld (FOV) dreidimensionale (3D) Fluoreszenz Netzhautbild nach wie vor eine große Herausforderung mit der State-of-the-Art-Retinal bildgebende Modalitäten, weil sie Z-Stapeln, erfordern würde Kompilieren Sie eine Volumetrische Dataset. Neuere optische Kohärenztomografie (OCT) und OCT angiographiesysteme (OCTA) überwinden diese Einschränkungen um dreidimensionale (3D) anatomische und vaskuläre Bilder liefern, aber die Farbstoff-freie Art der OCT kann nicht auslaufen bezeichnend für vaskuläre visualisieren Dysfunktion. Dieses Protokoll beschreibt eine neuartige schräge scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) Technik, die 3D Volumetrische Fluoreszenz retinale Bildgebung. Das Setup von dem abbildenden System generiert die schräge Abtastung durch eine Taube Schweif Schieberegler und richtet die endgültige imaging-System in einem Winkel, fluoreszierende Schnittbilder zu erkennen. Das System nutzt die Laser-scanning-Methode und ermöglicht daher eine einfache Einbindung von OCT als ergänzende volumetrischen strukturellen bildgebenden Modalität. In-Vivo Bildgebung auf Ratte Netzhaut wird hier gezeigt. Fluorescein Lösung wird intravenös injiziert, um Volumetrische Fluorescein Angiographie (vFA) zu produzieren.

Abbildung 4a zeigt ein Querschnitt OCT-Bild der Ratte Netzhaut. Abbildung 4 b -4 c zeigen die gleichen retinalen Schnittbilder von OCTA und oSLO vFA zur gleichen Zeit erworben. Der oSLO ermöglicht Cross-Sectional FA analog zu der OCT B-Scan. Im Vergleich zu OCTA identifiziert das oSLO vFA Cross-Sectional Bild eindeutig die Schiffe in der nervenfaserschicht (NFL) und Ganglion Zellschicht (GCL) und Kapillaren in de...

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um ein großes Sichtfeld (FOV) dreidimensionale (3D) Fluoreszenz und OCT Netzhautbild mithilfe eine neuartige bildgebende multimodale Plattform abrufen. Wir werden das System-Setup, die Methode der Ausrichtung und der operativen Protokolle vorstellen. In-Vivo Bildgebung werden demonstriert und repräsentative Ergebnisse zur Verfügung gestellt werden.

Multimodale Volumetrische Retinal Imaging von schrägen Scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) und optische Kohärenztomografie (OCT)

While fluorescence imaging is widely used in ophthalmology, a large field of view (FOV) three-dimensional (3D) fluorescence retinal image is still a big ...

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ophthalmologie und der Netzhautbildgebung zu beantworten. Dazu gehören die Bildgebung und Quantifizierung der Störung der Blut-Netzhaut-Schranke und der Funktionen der retinalen Kapillaren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie durch die Verwendung eines schrägen Scanning-Lasers in einem einzigen Rasterscan eine dreidimensionale Multikontrast-Netzhautbildgebung mit großem Sichtfeld erzielen kann.Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose der diabetischen Retinopathie und anderer präretinaler Erkrankungen. Denn oSLO kann kontrastreiche Bilder von retinalen Mikrogefäßen bis hin zu einzelnen Kapillaren in 3D erhalten. Obwohl diese Methode Einblicke in die Netzhautbildgebung geben kann, kann sie auch auf andere Bildgebungssysteme mit herkömmlichen Objektiven angewendet werden.Wie zum Beispiel die In-vivo-Bildgebung der Hirnrinde der Maus. Eine Superkontinuums-Laserquelle wird als Systemlaserquelle für den Schrägscanning-Laser-Ophthalmoskopie- oder oSLO-Aufbau verwendet. Der Bereich des sichtbaren Lichts wird durch den ersten dichroitischen Spiegel vom Bereich des höheren Wellenlängenbereichs getrennt.Das Lichtspektrum wird mit einem Paar dispersiver Prismen erweitert, nachdem der Strahl einen Polarisationsstrahlteiler passiert hat. Über einen Schlitz wird der Wellenlängenbereich der Anregung ausgewählt. Und ein reflektierender Spiegel reflektiert den gefilterten Strahl zurück zum Prismenpaar, um das Licht in eine Singlemode-Faser einzukoppeln.Ein Spektrometer wird verwendet, um die Wellenlängenauswahl am Ausgang der Singlemode-Faser zu bestätigen. Die Singlemode-Faser ist mit zwei kaskadierten Glasfaserkopplern verbunden. Einer der Faserausgänge des zweiten Faserkopplers liefert das Licht an das oSLO-System.Um den Laser im oSLO-System zu kollimieren, wird der Laser durch einen Galvanometerspiegel abgelenkt. Ein Eins-zu-Eins-Teleskopsystem leitet den Laser an einen zweiten Galvanometerspiegel weiter, und ein Drei-zu-Eins-Teleskopsystem leitet den Laser weiter an die Pupille des Auges weiter. Ein dichroitischer Spiegel innerhalb des Drei-zu-Eins-Teleskopsystems reflektiert die Fluoreszenzsignale.Das Drei-zu-Eins-Teleskopsystem und der dichroitische Spiegel sind auf einem maßgeschneiderten Schwalbenschwanzschieber montiert, um die optische Achse zu versetzen und die schräge Abtastbeleuchtung zu erzeugen. Die schräge Beleuchtung ermöglicht die volumetrische Fluoreszenzbildgebung, ohne dass Schnitte erforderlich sind. Durch Versetzen des Lasers wird ein schräger Strahl auf die Netzhaut fokussiert, und dann kann die Schrägdetektion ein tomographisches Fluoreszenzbild entlang des schrägen Strahlengangs aufnehmen.Um den Strahlengang der Fluoreszenzabbildung zu erzeugen, wird die Fluoreszenz vom dichroitischen Spiegel reflektiert und an den dritten Galvanometerspiegel weitergeleitet. Das Fluoreszenzlicht wird dann von einem weiteren Eins-zu-Eins-Teleskopsystem an eine abbildende Objektivlinse weitergeleitet. Unter dem dritten Galvanometerspiegel sind zwei zusätzliche Translationsstufen installiert, um Redundanz in den Freiheitsgraden für die Optimierung des Bildes zu gewährleisten.Das endgültige Bildgebungssystem ist auf einem Tisch montiert, der über drei Freiheitsgrade verfügt. Drehung und zwei Translationsachsen. Für die Aufnahme der Querschnitts-Fluoreszenzbilder wird eine planare Kamera verwendet.Ein weiterer dichroitischer Spiegel trennt den hinteren Infrarotbereich vom restlichen Licht. Ein Langpassfilter wird verwendet, um die Bandbreite weiter auf 800 bis 900 Nanometer zu begrenzen. Einkoppeln Sie den Strahl in eine Singlemode-Faser.Die Singlemode-Faser wird mit dem anderen Eingangsport der beiden kaskadierten Glasfaserkoppler verbunden, um sie mit der blauen oSLO-Erregung zu kombinieren. Das Licht vom zweiten Ausgangsanschluss des zweiten Faserkopplers wird auf den OCT-Referenzarm gerichtet. Das verfügt über Dispersionsausgleichsplatten, einen variablen Neutraldichtefilter und einen reflektierenden Spiegel.Die Lichtrückführung vom Referenzarm und dem Auge rekombiniert am zweiten Glasfaserkoppler und wird an das OCT-Spektrometer abgegeben, um das Signal zu sammeln. Verwenden Sie eine in Labview geschriebene Datenerfassungssystemsoftware, die aus dem Scan-OCTA-Scanprotokoll modifiziert wurde. Für jeden b-Scan wird ein Sägezahn mit 80 % Tastverhältnis und 500 Schritten von einer analogen Ausgangskarte ausgegeben, um den x-prime Fast Scanning Spiegel zu steuern.Lösen Sie die Zeilenkamera bei jedem Schritt aus, um Daten für das OAT zu erfassen, und zwar nur, wenn sich der Spiegel in Vorwärtsrichtung befindet. Stellen Sie die Belichtungszeit für die Zeilenkamera auf 17 Mikrosekunden ein. Um das OCTA-Signal zu erfassen, wiederholen Sie die Messung fünfmal an derselben b-Scan-Stelle.Stellen Sie die AO-Ausgangsrate auf 100 Kilohertz und die OCT-A-Leitungsrate auf 50 Kilohertz ein. Steuern Sie den langsam scannenden Y-Prime-Spiegel, GM1, durch eine rampierende Wellenform. Synchronisieren Sie den Descan-Spiegel, GM3, mit GM1, um den langsamen Scanvorgang zu untersuchen.Triggern Sie die planare Kamera über eine weitere analoge Ausgangskarte, um ein Fluoreszenzbild an jeder Y-Prime-Position aufzunehmen. Schneiden Sie die Bildgröße ab oder sortieren Sie die benachbarten Pixel, um die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit wie gewünscht zu erhöhen. Beginnen Sie damit, ein angemessenes Maß an Anästhesie bei der Ratte durch das Fehlen eines Entzugsreflexes während einer intradigitalen Kneifung zu bestätigen.Legen Sie die Ratte nach der Narkoseeinleitung auf eine Halterung. Setzen Sie einen Nasenkonus ein, um die Anästhesie während des restlichen Experiments aufrechtzuerhalten. Tragen Sie 5 Tetracainhydrochlorid ophthalmische Lösung zur Lokalanästhesie auf das Auge der Ratte auf.Erweitern Sie dann die Pupille mit 1%iger Tropicamid-Augenlösung. Nach zweiminütiger Dilatation injizieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 29-Gauge-Nadel 10 % Fluorescein oder 10 % FITC, verdünnt in Kochsalzlösung, durch die Schwanzvene. Schalten Sie dann die Laserquelle ein und platzieren Sie einen Neutraldichtefilter, um die Anregung des blauen Lichts während der Ausrichtung zu dämpfen.Messen Sie die Leistung von blauem Licht und stellen Sie sicher, dass sie weniger als 10 Mikrowatt beträgt. Schalten Sie dann auf die optische Kohärenztomographie-Leuchte um und stellen Sie sicher, dass sie nahe 8 Milliwatt beträgt. Schalten Sie die Stromversorgung des Galvanometerspiegels ein, mit dem die Richtung des Lasers gesteuert wird.Passen Sie die Höhe des Augapfels an, um einen stationären Laserfleck auf der Hornhaut zu erzeugen. Passen Sie die Augenposition so an, dass der Rand der Pupille ungefähr senkrecht zum Laser steht. Und versetzen Sie den Laser auf etwa 1,5 Millimeter von der apikalen Mitte des Auges.Stellen Sie den Tierhalter weiter ein, bis die optischen Kohärenztomographie-Bilder eine optimale Qualität erreichen. Stellen Sie in der schnellen Scanrichtung x-prime sicher, dass das Schnittbild des b-Bildes flach erscheint. Wenn Sie zur langsamen Scanrichtung mit y-Festbrennweite wechseln, stellen Sie sicher, dass das Querschnittsbild des b-Bildes aufgrund des schrägen Scannens geneigt erscheint.Entfernen Sie den Neutraldichtefilter zur Blaulichtanregung. Und überwachen Sie den Echtzeit-Feed der Kamera. Es sollte ein Fluoreszenzschnittbild erscheinen, das Blutgefäße in unterschiedlichen Tiefen zeigt.Passen Sie den Fokus des endgültigen Fluoreszenzbildgebungssystems an, um den optimalen Fokus zu erreichen. Und nehmen Sie Feineinstellungen der Augenposition in der lateralen Ebene vor, um eine optimale Bildqualität für die Schrägscanning-Laser-Ophthalmoskopie zu erreichen. Beginnen Sie nach der Ausrichtung mit der gleichzeitigen optischen Kohärenztomographie, Angiographie und volumetrischen Fluoreszenzangiographie.Dieses Bild zeigt eine optische Kohärenztomographie eines Querschnitts der Netzhaut einer Ratte. Hierbei handelt es sich um eine optische Kohärenztomographie-Angiographie (OCTA-Bild) derselben Region. Und eine Schrägscanning-Laser-Ophthalmoskopie und eine volumetrische Fluoreszenzangiographie, Bildquerschnitts-Fluoreszenzangiographie (oSLO-VFA).Analog zur optischen Kohärenztomographie b-scan. Im Vergleich zu OCTA sind mit der schräg scannenden Laser-Ophthalmoskopie und dem volumetrischen Fluoreszenzangiographie-Schnittbild die Kapillaren in der äußeren plexiformen Schicht eindeutig zu erkennen. Die oberflächliche Schicht der Netzhaut ist hier in einem OCTA-Bild dargestellt.Artefakte in Form von vertikalen Streifen sind im Bild sichtbar. oSLO-VFA vermeidet Bewegungsartefakte durch die Verwendung von Fluoreszenzemissionskontrast. Innerhalb der retinalen Zwischenschicht sind die vertikal tauchenden Gefäße auf dem oSLO FA-Bild deutlich zu sehen.Aber in OCTA nicht ersichtlich. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine kontinuierliche Laserexposition des Auges für mehr als zwei Minuten zu vermeiden. Vermeiden Sie ein Austrocknen der Hornhaut und lassen Sie das Auge zwischen den Bildgebungsschnitten mindestens 30 Sekunden ruhen, indem Sie das Licht blockieren.Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Bildgebung genetisch veränderter Mäuse zur Expression von Fluoreszenzproteinen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, wie sich bestimmte Zelltypen der Netzhaut verändern können, und wie man bei bekannten Krankheiten die Variablen hinter sich lässt.

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