Multimodale Volumetrische Retinal Imaging von schrägen Scanning Laser Ophthalmoskopie (oSLO) und optische Kohärenztomografie (OCT)

Hier präsentieren wir ein Protokoll, um ein großes Sichtfeld (FOV) dreidimensionale (3D) Fluoreszenz und OCT Netzhautbild mithilfe eine neuartige bildgebende multimodale Plattform abrufen. Wir werden das System-Setup, die Methode der Ausrichtung und der operativen Protokolle vorstellen. In-Vivo Bildgebung werden demonstriert und repräsentative Ergebnisse zur Verfügung gestellt werden.

Diese Methode kann helfen, zentrale Fragen im Bereich der Ophthalmologie und der Netzhautbildgebung zu beantworten. Dazu gehören die Bildgebung und Quantifizierung der Störung der Blut-Netzhaut-Schranke und der Funktionen der retinalen Kapillaren. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie durch die Verwendung eines schrägen Scanning-Lasers in einem einzigen Rasterscan eine dreidimensionale Multikontrast-Netzhautbildgebung mit großem Sichtfeld erzielen kann.

Die Auswirkungen dieser Technik erstrecken sich auf die Diagnose der diabetischen Retinopathie und anderer präretinaler Erkrankungen. Denn oSLO kann kontrastreiche Bilder von retinalen Mikrogefäßen bis hin zu einzelnen Kapillaren in 3D erhalten. Obwohl diese Methode Einblicke in die Netzhautbildgebung geben kann, kann sie auch auf andere Bildgebungssysteme mit herkömmlichen Objektiven angewendet werden.

Wie zum Beispiel die In-vivo-Bildgebung der Hirnrinde der Maus. Eine Superkontinuums-Laserquelle wird als Systemlaserquelle für den Schrägscanning-Laser-Ophthalmoskopie- oder oSLO-Aufbau verwendet. Der Bereich des sichtbaren Lichts wird durch den ersten dichroitischen Spiegel vom Bereich des höheren Wellenlängenbereichs getrennt.

Das Lichtspektrum wird mit einem Paar dispersiver Prismen erweitert, nachdem der Strahl einen Polarisationsstrahlteiler passiert hat. Über einen Schlitz wird der Wellenlängenbereich der Anregung ausgewählt. Und ein reflektierender Spiegel reflektiert den gefilterten Strahl zurück zum Prismenpaar, um das Licht in eine Singlemode-Faser einzukoppeln.

Ein Spektrometer wird verwendet, um die Wellenlängenauswahl am Ausgang der Singlemode-Faser zu bestätigen. Die Singlemode-Faser ist mit zwei kaskadierten Glasfaserkopplern verbunden. Einer der Faserausgänge des zweiten Faserkopplers liefert das Licht an das oSLO-System.

Um den Laser im oSLO-System zu kollimieren, wird der Laser durch einen Galvanometerspiegel abgelenkt. Ein Eins-zu-Eins-Teleskopsystem leitet den Laser an einen zweiten Galvanometerspiegel weiter, und ein Drei-zu-Eins-Teleskopsystem leitet den Laser weiter an die Pupille des Auges weiter. Ein dichroitischer Spiegel innerhalb des Drei-zu-Eins-Teleskopsystems reflektiert die Fluoreszenzsignale.

Das Drei-zu-Eins-Teleskopsystem und der dichroitische Spiegel sind auf einem maßgeschneiderten Schwalbenschwanzschieber montiert, um die optische Achse zu versetzen und die schräge Abtastbeleuchtung zu erzeugen. Die schräge Beleuchtung ermöglicht die volumetrische Fluoreszenzbildgebung, ohne dass Schnitte erforderlich sind. Durch Versetzen des Lasers wird ein schräger Strahl auf die Netzhaut fokussiert, und dann kann die Schrägdetektion ein tomographisches Fluoreszenzbild entlang des schrägen Strahlengangs aufnehmen.

Um den Strahlengang der Fluoreszenzabbildung zu erzeugen, wird die Fluoreszenz vom dichroitischen Spiegel reflektiert und an den dritten Galvanometerspiegel weitergeleitet. Das Fluoreszenzlicht wird dann von einem weiteren Eins-zu-Eins-Teleskopsystem an eine abbildende Objektivlinse weitergeleitet. Unter dem dritten Galvanometerspiegel sind zwei zusätzliche Translationsstufen installiert, um Redundanz in den Freiheitsgraden für die Optimierung des Bildes zu gewährleisten.

Das endgültige Bildgebungssystem ist auf einem Tisch montiert, der über drei Freiheitsgrade verfügt. Drehung und zwei Translationsachsen. Für die Aufnahme der Querschnitts-Fluoreszenzbilder wird eine planare Kamera verwendet.

Ein weiterer dichroitischer Spiegel trennt den hinteren Infrarotbereich vom restlichen Licht. Ein Langpassfilter wird verwendet, um die Bandbreite weiter auf 800 bis 900 Nanometer zu begrenzen. Einkoppeln Sie den Strahl in eine Singlemode-Faser.

Die Singlemode-Faser wird mit dem anderen Eingangsport der beiden kaskadierten Glasfaserkoppler verbunden, um sie mit der blauen oSLO-Erregung zu kombinieren. Das Licht vom zweiten Ausgangsanschluss des zweiten Faserkopplers wird auf den OCT-Referenzarm gerichtet. Das verfügt über Dispersionsausgleichsplatten, einen variablen Neutraldichtefilter und einen reflektierenden Spiegel.

Die Lichtrückführung vom Referenzarm und dem Auge rekombiniert am zweiten Glasfaserkoppler und wird an das OCT-Spektrometer abgegeben, um das Signal zu sammeln. Verwenden Sie eine in Labview geschriebene Datenerfassungssystemsoftware, die aus dem Scan-OCTA-Scanprotokoll modifiziert wurde. Für jeden b-Scan wird ein Sägezahn mit 80 % Tastverhältnis und 500 Schritten von einer analogen Ausgangskarte ausgegeben, um den x-prime Fast Scanning Spiegel zu steuern.

Lösen Sie die Zeilenkamera bei jedem Schritt aus, um Daten für das OAT zu erfassen, und zwar nur, wenn sich der Spiegel in Vorwärtsrichtung befindet. Stellen Sie die Belichtungszeit für die Zeilenkamera auf 17 Mikrosekunden ein. Um das OCTA-Signal zu erfassen, wiederholen Sie die Messung fünfmal an derselben b-Scan-Stelle.

Stellen Sie die AO-Ausgangsrate auf 100 Kilohertz und die OCT-A-Leitungsrate auf 50 Kilohertz ein. Steuern Sie den langsam scannenden Y-Prime-Spiegel, GM1, durch eine rampierende Wellenform. Synchronisieren Sie den Descan-Spiegel, GM3, mit GM1, um den langsamen Scanvorgang zu untersuchen.

Triggern Sie die planare Kamera über eine weitere analoge Ausgangskarte, um ein Fluoreszenzbild an jeder Y-Prime-Position aufzunehmen. Schneiden Sie die Bildgröße ab oder sortieren Sie die benachbarten Pixel, um die Geschwindigkeit und Empfindlichkeit wie gewünscht zu erhöhen. Beginnen Sie damit, ein angemessenes Maß an Anästhesie bei der Ratte durch das Fehlen eines Entzugsreflexes während einer intradigitalen Kneifung zu bestätigen.

Legen Sie die Ratte nach der Narkoseeinleitung auf eine Halterung. Setzen Sie einen Nasenkonus ein, um die Anästhesie während des restlichen Experiments aufrechtzuerhalten. Tragen Sie 5 Tetracainhydrochlorid ophthalmische Lösung zur Lokalanästhesie auf das Auge der Ratte auf.

Erweitern Sie dann die Pupille mit 1%iger Tropicamid-Augenlösung. Nach zweiminütiger Dilatation injizieren Sie mit einer Ein-Milliliter-Spritze und einer 29-Gauge-Nadel 10 % Fluorescein oder 10 % FITC, verdünnt in Kochsalzlösung, durch die Schwanzvene. Schalten Sie dann die Laserquelle ein und platzieren Sie einen Neutraldichtefilter, um die Anregung des blauen Lichts während der Ausrichtung zu dämpfen.

Messen Sie die Leistung von blauem Licht und stellen Sie sicher, dass sie weniger als 10 Mikrowatt beträgt. Schalten Sie dann auf die optische Kohärenztomographie-Leuchte um und stellen Sie sicher, dass sie nahe 8 Milliwatt beträgt. Schalten Sie die Stromversorgung des Galvanometerspiegels ein, mit dem die Richtung des Lasers gesteuert wird.

Passen Sie die Höhe des Augapfels an, um einen stationären Laserfleck auf der Hornhaut zu erzeugen. Passen Sie die Augenposition so an, dass der Rand der Pupille ungefähr senkrecht zum Laser steht. Und versetzen Sie den Laser auf etwa 1,5 Millimeter von der apikalen Mitte des Auges.

Stellen Sie den Tierhalter weiter ein, bis die optischen Kohärenztomographie-Bilder eine optimale Qualität erreichen. Stellen Sie in der schnellen Scanrichtung x-prime sicher, dass das Schnittbild des b-Bildes flach erscheint. Wenn Sie zur langsamen Scanrichtung mit y-Festbrennweite wechseln, stellen Sie sicher, dass das Querschnittsbild des b-Bildes aufgrund des schrägen Scannens geneigt erscheint.

Entfernen Sie den Neutraldichtefilter zur Blaulichtanregung. Und überwachen Sie den Echtzeit-Feed der Kamera. Es sollte ein Fluoreszenzschnittbild erscheinen, das Blutgefäße in unterschiedlichen Tiefen zeigt.

Passen Sie den Fokus des endgültigen Fluoreszenzbildgebungssystems an, um den optimalen Fokus zu erreichen. Und nehmen Sie Feineinstellungen der Augenposition in der lateralen Ebene vor, um eine optimale Bildqualität für die Schrägscanning-Laser-Ophthalmoskopie zu erreichen. Beginnen Sie nach der Ausrichtung mit der gleichzeitigen optischen Kohärenztomographie, Angiographie und volumetrischen Fluoreszenzangiographie

Dieses Bild zeigt eine optische Kohärenztomographie eines Querschnitts der Netzhaut einer Ratte. Hierbei handelt es sich um eine optische Kohärenztomographie-Angiographie (OCTA-Bild) derselben Region. Und eine Schrägscanning-Laser-Ophthalmoskopie und eine volumetrische Fluoreszenzangiographie, Bildquerschnitts-Fluoreszenzangiographie (oSLO-VFA).

Analog zur optischen Kohärenztomographie b-scan. Im Vergleich zu OCTA sind mit der schräg scannenden Laser-Ophthalmoskopie und dem volumetrischen Fluoreszenzangiographie-Schnittbild die Kapillaren in der äußeren plexiformen Schicht eindeutig zu erkennen. Die oberflächliche Schicht der Netzhaut ist hier in einem OCTA-Bild dargestellt.

Artefakte in Form von vertikalen Streifen sind im Bild sichtbar. oSLO-VFA vermeidet Bewegungsartefakte durch die Verwendung von Fluoreszenzemissionskontrast. Innerhalb der retinalen Zwischenschicht sind die vertikal tauchenden Gefäße auf dem oSLO FA-Bild deutlich zu sehen.

Aber in OCTA nicht ersichtlich. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, eine kontinuierliche Laserexposition des Auges für mehr als zwei Minuten zu vermeiden. Vermeiden Sie ein Austrocknen der Hornhaut und lassen Sie das Auge zwischen den Bildgebungsschnitten mindestens 30 Sekunden ruhen, indem Sie das Licht blockieren.

Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie die Bildgebung genetisch veränderter Mäuse zur Expression von Fluoreszenzproteinen durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zu beantworten. Zum Beispiel, wie sich bestimmte Zelltypen der Netzhaut verändern können, und wie man bei bekannten Krankheiten die Variablen hinter sich lässt.