Name: Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-10-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 9 s
Description: Lernen Sie die Konstruktion stabiler 3D-Zellverbände ohne künstliche Gerüste mithilfe von optischen Pinzetten und hydrophilen Polymeren. Diese Methode ermöglicht präzise Manipulation einzelner Zellen für Anwendungen in der Geweberegeneration.

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Die Autoren danken Shu Hashimoto, Aoi Yoshida und Taeko Ohta an der Doshisha Universität für ihre großzügige Unterstützung mit dem Versuchsaufbau. Diese Arbeit wurde durch KAKENHI (15 H 02121, 15 K 05400, 25103012, 50587441) und das MEXT-Supported-Programm für die strategische Forschungsgemeinschaft an privaten Hochschulen unterstützt. Diese Studie wurde auch unterstützt durch einen polnischen Zuschuss aus dem Wissen (führende National Research Centre) wissenschaftlichen Konsortium "Gesunde Tiere – sichere Lebensmittel" Entscheidung des Ministeriums für Wissenschaft und Hochschulwesen Nr. 05-1/KNOW2/2015...

1. Vorbereitung der Zellen
<ol><li>Pflegen Sie NAMRU Maus Brustdrüse epitheliale Zellen (NMuMG) mit 5 mL von D-MEM mit 10 % (V) fetalen bovine Serum (FBS) und 1 % (V) Penicillin-Streptomycin (P/S) in einem 25 cm3 Kolben. Entfernen Sie Dulbecco geändert Adlers Medium (D-MEM) mit 10 % FBS und 1 % P/S.</li>
	<li>Fügen Sie 3-5 mL von 37 ° C Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (PBS) (-) in den Kolben. Beachten Sie, dass der pH-Wert des PBS 7.1-7.3.</li>
	<li>Entfernen Sie alle PBS aus der Flasche mit einer Absauganlage.</li>
	<li>1,5 mL 37 ° C Trypsin (0,25 %, w/V) in den Kolben hinzugeben.</li>
	<li>Ca. 1 bis 2 Minuten bei 37 ° C in einem CO2 Inkubator inkubieren Sie die Küvette.</li>
	<li>Fügen Sie 3,5 mL D-MEM mit 10 % FBS und 1 % P/S in den Kolben. Pipette zum Mischen.</li>
	<li>Die Zellsuspension auf eine 15 mL Zentrifugenröhrchen übertragen und für 3 min bei Raumtemperatur zentrifugieren. Beachten Sie, dass die Drehungsradius und die Rotationsgeschwindigkeit der Zentrifuge 16,6 cm bzw. 1500 u/min, betragen. Unter dieser Bedingung ist die relative Zentrifugalkraft 417 X g.</li>
	<li>Fügen Sie 5 mL frisch D-MEM (10 % FBS und 1 % P/S) in den Kolben nach dem Absaugen des Mediums (ggf. Tiefgefrieren der Zellen mit Kryokonservierung Lösung, nach den Anweisungen des Herstellers).</li>
</ol>2. Vorbereitung von Dextran (DEX)
<ol><li>Bereiten Sie 80 mg/mL DEX Lösung durch Mischen 10 mL von D-MEM (10 % FBS, 1%P/S) und 0,8 g Dex. Beachten Sie, dass die DEX-Lösung mit einer Spritze Filter (0,22 µm) gefiltert werden kann nach der Zellen für eine ausreichende Zeit kultiviert haben.</li>
	<li>Bereiten Sie eine Zellsuspension mit 40 mg/mL DEX Medium durch Mischen von DEX Lösung 200 µL und 200 µL Zellsuspension in 2.1 vorbereitet. Beachten Sie, dass die Dichte der Zellen in die Lösung etwa 2,3 × 105 Zellen/mL.</li>
</ol>3. Vorbereitung für Laser- und Mikroskopie
<ol><li>Schalten Sie den Laser (kontinuierliche Welle, 1.064 nm Wellenlänge) (Abbildung 1(ein). Beachten Sie, dass die Verwendung von einem Laserstrahl mit einer Wellenlänge im roten Nahinfrarot-Region am effektivsten ist; dieser Wellenlängenbereich wird die diagnostische und therapeutische Fenster10 genannt, da es minimal von den Zellen aufgenommen wird.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf Software.</li>
	<li>Doppelklicken Sie auf die Symbole für Kamera ①, ② Light Emitting Diode (LED), ③ Fokus einstellen und ④ Bühne bewegen. Die Displays entsprechend ① ④ werden (Abbildung 1b) angezeigt.</li>
</ol>(4) Zelle Manipulation mit dem Laser-Trapping-System
<ol><li>Platz 20 µL der Probe vorbereitet in Schritt 2.2 auf der unteren Abdeckung Glas (0,17 mm Stärke, Größe = 30 mm × 40 mm), und mit dem oberen Deckglas abdecken (0,17 mm Stärke, Größe = 18 mm × 18 mm), mit Trennung von zwei Abstandshalter (0,17 mm Dicke zur Verfügung gestellt Größe = 10 mm × 24 mm), wie in Abbildung 2dargestellt. Beachten Sie, dass diese Gläser keine spezielle Beschichtung benötigen.</li>
	<li>Legen Sie die Sample-Zelle im Schritt 4.1 auf den unteren Objektiv vorbereitet (Wasser eintauchen mit ca. 10 μl, Vergrößerung = 60 X, Arbeitsabstand = 0,28 mm, numerische Apertur = 1,2)).</li>
	<li>Befestigen Sie die oberen Objektivlinse (Wasser eintauchen mit ca. 10 μl, Vergrößerung = 60 X, Arbeitsabstand = 2 mm, numerische Apertur = 1.0) am oberen Rand der Sample-Zelle.</li>
	<li>Schalten Sie die LED Licht durch Anklicken 2 (Abbildung 1b).</li>
	<li>Stellen Sie den Abstand zwischen der Probe und der unteren Objektiv durch Klicken auf die Symbole auf Platte 3 (Abbildung 1b) bis es im Fokus ist.</li>
	<li>Die Laserstrahlen auf Position 1 und Position 2 (Abbildung 1B) der Probe durch Klicken auf Symbole I, II und III (Abbildung 1b) zu bestrahlen.</li>
	<li>Stellen Sie die Intensität der einzelnen Laserstrahl auf 1.500 mW durch Eingabe dieser Value-at-Symbol IV (Abbildung 1b).</li>
	<li>Umzug der Probentisch, indem Sie auf Symbol 4 zeigt Richtungen (Abbildung 1b) bis eine Zelle an Position 1 (Abbildung 1b) gefangen ist.</li>
	<li>Ziehen Sie der Cursor auf Position 2 (Abbildung 1b) bis zu einer anderen Zelle an Position 2 gefangen ist.</li>
</ol>(5) Bau einer 3-dimensionalen (3D) Zelle Struktur
<ol><li>Eine einzelne Zelle zu manipulieren, so dass es in Kontakt mit einer anderen Zelle. Dieser Zustand für 300 s; d. h., jede Zelle einem Laser für 300 unterliegt, s.</li>
	<li>Notieren Sie die X-Y-Achse gezeigt in der Abbildung 1b.</li>
	<li>Konstruieren Sie eine beliebige 2D Cell Assembly durch Überfüllung und einer anderen Zelle, die Zellen zu transportieren.</li>
	<li>Konstruieren Sie eine zelluläre 3D-Baugruppe von der Bühne auf und ab bewegt.</li>
	<li>Bestätigen Sie, dass die Versammlung stabil bleibt, nachdem der Laser abgeschaltet ist.</li>
</ol>

<ol><li>Aloysious, N., Nair, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+survival+and+function+of+islet-like+clusters+differentiated+from+adipose+stem+cells+on+a+three-dimensional+natural+polymeric+scaffold%3A+an+in+vitro+study%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering+Part+A%22%5BJournal%5D)">Enhanced survival and function of islet-like clusters differentiated from adipose stem cells on a three-dimensional natural polymeric scaffold: an in vitro study.</a> Tissue Engineering Part A. 20 (9-10), 1508-1522 (2014).</li>
<li>Fatehullah, A., Tan, S. H., Barker, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organoids+as+an+in+vitro+model+of+human+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Organoids as an in vitro model of human development and disease.</a> Nature Cell Biology. 18 (3), 246-254 (2016).</li>
<li>Kirkham, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precision+assembly+of+complex+cellular+microenvironments+using+holographic+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">Precision assembly of complex cellular microenvironments using holographic optical tweezers.</a> Scientific Reports. 5, 8577(2015).</li>
<li>Liu, Y., Rayatpisheh, S., Chew, S. Y., Chan-Park, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+endothelial+cells+on+3D+cultured+smooth+muscle+cells+in+a+biomimetic+hydrogel%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Applied+Materials+%26+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Impact of endothelial cells on 3D cultured smooth muscle cells in a biomimetic hydrogel.</a> ACS Applied Materials & Interfaces. 4 (3), 1378-1387 (2012).</li>
<li>Liu, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dextran-based+hydrogel+formed+by+thiol-Michael+addition+reaction+for+3D+cell+encapsulation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surfaces+B%22%5BJournal%5D)">Dextran-based hydrogel formed by thiol-Michael addition reaction for 3D cell encapsulation.</a> Colloids and Surfaces B. 128, 140-148 (2015).</li>
<li>McKee, C., Perez-Cruet, M., Chavez, F., Chaudhry, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+three-dimensional+culture+system+for+long-term+expansion+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22World+Journal+of+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Simplified three-dimensional culture system for long-term expansion of embryonic stem cells.</a> World Journal of Stem Cells. 7 (7), 1064-1077 (2015).</li>
<li>Sadovska, L., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29248729">A novel 3D heterotypic spheroid model for studying extracellular vesicle-mediated tumor and immune cell communication.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. , (2017).</li>
<li>Srinivasan, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+Salivary+Human+Stem%2FProgenitor+Cells+Undergo+Microenvironment-Driven+Acinar-Like+Differentiation+in+Hyaluronate+Hydrogel+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Translational+Medicine%22%5BJournal%5D)">Primary Salivary Human Stem/Progenitor Cells Undergo Microenvironment-Driven Acinar-Like Differentiation in Hyaluronate Hydrogel Culture.</a> Stem Cells Translational Medicine. 6 (1), 110-120 (2017).</li>
<li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.mdpi.com/2073-4360/9/8/319">Manipulating living cells to construct a 3D single-cell assembly without an artificial scaffold.</a> Polymers. 9, 319(2017).</li>
<li>Anderson, R. R., Parrish, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+photothermolysis%3A+precise+microsurgery+by+selective+absorption+of+pulsed+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Selective photothermolysis: precise microsurgery by selective absorption of pulsed radiation.</a> Science. 220, 524-527 (1983).</li>
<li>Hashimoto, S., et al. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0009261416303207">Formation of Stable Cell-Cell Contact without a Solid/Gel Scaffold: Non-invasive Manipulation by Laser under Depletion Interaction with a Polymer.</a> Chemical Physics Letters. 655, 11-16 (2016).</li>
<li>Rauch, P., Jähnke, T. <a target="_blank" href="https://www.cambridge.org/core/journals/microscopy-today/article/optical-tweezers-for-quantitative-force-measurements-and-live-cell-experiments/D4853D94DFD7AE988E656F49A1DA49FB">Optical Tweezers for Quantitative Force Measurements and Live Cell Experiments.</a> Microscopy Today. 22, 26-30 (2014).</li>
<li>Ichikawa, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18315348">Tilt control in optical tweezers.</a> Journal of Biomedical Optics. 13, 010503(2008).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Die vorliegende Studie zeigt eine konkrete Anwendung von unseren jüngsten Berichte9,11 auf die Verwendung von wasserlöslichen Polymeren für den Bau von einzelligen 3D-Baugruppen. Solche Baugruppen sind stabil in der Bulk-Lösung gebildet, wenn die Anzahl der Zellen bis zu 10 ist und mit einem einzigen Laserstrahl gehalten werden kann. Assemblys Niederschlag auf der Glasoberfläche, wann gibt es mehr als 10 Zellen. Obwohl die Experimente noch in einem primitiven Stadium sind, erwarten wir, dass die neuartige Methodik ein leistungsfähiges Werkzeug für den Bau der nächsten Generation 3D-Baugruppen einzellige sein könnte, die unerlässlich für den Fortschritt auf dem Gebiet der Zellbiologie sind und regenerative Medizin.
In einer Lösung enthalten kein Polymer abstoßen Zellen gegenseitig aufgrund der elektrostatischen Abstoßung der Oberflächenladung, die Hydratation Abstoßung Kraft der Glycocalyx Abstoßung Effekt und Membran Wellenbewegung aus. Unsere früheren Studie zeigte, dass Zelle Paare für eine lange Zeit stabil sein können wenn die Zellen mit PEG behandelt werden. Noch wichtiger ist, zufolge der erfolgreichen Transport eines Paares der Zelle zu einer Region ohne PEG, nachdem die Zellen in Kontakt für 5 Minuten in PEG, stattgefunden hatte zellulärer Kontakt stabil aufrechterhalten wird. Dies ist auch im Hinblick auf die Erschöpfung Effekt11, und im Wesentlichen der gleiche Mechanismus gilt für die zelluläre Assemblys generiert mit DEX9. Unsere aktuellen Ergebnisse deuten darauf hin, dass andere Arten von natürlichen Makromolekülen auch verwendet werden, konnte um stabile zelluläre 3D-Baugruppen zu konstruieren.
Für den schnellen Transport von Zellen ist die Konzentration des Polymers wichtig. In der Regel erhöht die Viskosität der Lösung drastisch, wenn das Polymer über die Überlappung Konzentration gelöst ist. Unter diesen Bedingungen ist es schwierig, Zellen, die optische Pinzette zu manipulieren. Daher sollte das Experiment unter der Überlappung Konzentration durchgeführt werden. Für eine DEX-Lösung, die Überlappung Konzentration beträgt ca. 50 mg/mL (kinetische Viskosität ist 5,5 mm2/s). Wie in Nr. 9, wurde eine stabile zelluläre Versammlung beobachtet, wenn die Konzentration von DEX 10 mg/mL bis 40 mg/mL war. Dieses Ergebnis legt nahe, dass die Erschöpfung Wirkung ausreichend große, stabile Zellezelle Kontakt zu halten, auch wenn die DEX-Konzentration niedriger als die Überlappung-Konzentration ist. Es hat sich gezeigt, dass die Zugabe von DEX Zellviabilität bis zu 40 mg/mL 9nicht beeinträchtigt.
Die Festlegung einer Methode für den Bau von zellulären 3D-Baugruppen ist wichtig im Bereich der regenerativen Medizin, kann seit imitiert eine in Vivo zellulären Mikroumgebung von Einzelzellen Strukturierung Stammzellen gewonnenem Gewebe erleichtern Bildung. Bisher haben wir dieses Protokolls verwendet, zelluläre Baugruppen mit Neuro2A Zellen9 neben NMuMG Zellen zu konstruieren. Wir hoffen, eine experimentelle Methodik für den Bau von zellulärer 3D-Baugruppen einer größeren Anzahl von Zellen der verschiedenen Morphologien herzustellen. Das optische Pinzetten-System entwickelt von Ichikawa Et al. 13 wäre für diesen Zweck anwendbar sein, da die Ausrichtung der Zellen gesteuert werden kann. Weitere Versuche in dieser Richtung sollten vielversprechend sein.

Während menschliche Gewebe aus mehreren Baugruppen von Zellen bestehen und dazu beitragen können, die Homöostase des Körpers, einzelne Zellen selbst auch eine wichtige Rolle über Zell-Zell-Interaktion. Daher ist es wichtig, aufzuklären, wie einzelne Zellen durch externe Signale stimuliert werden können und wie sie solche Signale auf andere adhärenten Zellen übertragen. Zu diesem Zweck wurden verschiedene Methoden für den Bau von Einzel-Zell-basierte 3-dimensionale (3D) Baugruppen1,2,3,4,5,6 eingerichtet ,7,8. Die Materialien, die verwendet werden, um zelluläre Baugruppen konstruieren können jedoch noch verbessert werden. Zum Beispiel Polymere einschließlich Polyethylenglykol (PEG) und synthetischen Gele besitzen bestimmte chemische, physikalisch-chemischen Eigenschaften und Zielzellen (z. B. Toxizität) beeinträchtigen.
Wir berichteten vor kurzem ein neuartiges System, das eine Einzel-Zell-basierte 3D-Baugruppe mit Dextran (DEX) durch die Schaffung stabiler Zellezelle Kontakt9Zellen erzeugen könnte. Wir hielten diese Technologie in mehreren Forschungsbereichen, einschließlich der regenerativen Medizin und sogar Krebsbiologie nützlich sein könnte. In diesem Bericht beschreiben wir, wie wir einzelne Zellen zu manipulieren und 3-dimensionale (3D) zelluläre Baugruppen in Anwesenheit von verschiedenen hydrophilen Biomakromoleküle einschließlich DEX ohne eine künstliche Gerüst zu bauen.

<table><tbody><tr><td>Mikroskop IX71</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Dextran (200.000; molekularbiologischer Grad)</td><td>Wako</td><td>CAS.NO&nbsp; 9004-54-0</td><td></td></tr><tr><td>Laser Trapping System (NanoTracker 2)</td><td>JPK Instruments</td><td>S/N T-05-0200</td><td></td></tr><tr><td>Obere Objektivlinse</td><td>Olympus</td><td>LUMPLFLN60XW</td><td></td></tr><tr><td>Untere Objektivlinse</td><td>Olympus</td><td>UPLSAPO60XW</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas</td><td>MATUNAMI</td><td>C022401</td><td></td></tr><tr><td>Zwischenabdeckglas (Abstandhalter)</td><td>MATUNAMI-Sonderanfertigung</td><td></td> <td>(Größe = 10mm&fach; 10mm, Dicke = 0.17mm)</td></tr><tr><td>Untere Abdeckung Glas</td><td>MATUNAMI</td><td>C030401</td><td></td></tr><tr><td>Kamera</td><td>Die Bildquelle</td><td>DFK 31AF03</td><td></td></tr><tr><td>Software</td><td>JPK Instruments</td><td>NanoTracker2 PFM Software</td><td></td></tr><tr><td>NMuMG Zellen&nbsp;</td><td>RIKEN BRC</td><td>RCB2868</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Wako</td><td>166-23555</td><td></td></tr><tr><td>Cell banker</td><td>Nippon Zenyaku Kogyo</td><td>ZR621</td><td></td></tr><tr><td>D-MEM</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japan</td><td>044-29765</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Cell Culture Biosci., Nichirei Biosci. Inc., Japan</td><td>172012-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Wako Pure Chem. Ind., Japan</td><td>161-23181</td><td></td></tr></tbody></table>

bearbeiten von lebenden zellen, stabile zelluläre 3d-baugruppe ohne künstlichen gerüst zu bauen

Manipulating Living Cells to Construct Stable 3D Cellular Assembly Without Artificial Scaffold

Regenerative Medizin und Tissue Engineering bieten mehrere Vorteile für die Behandlung von hartnäckigen Krankheiten, und mehrere Studien haben gezeigt, wie wichtig es ist, 3-dimensionale (3D) zellulären Baugruppen in diesen Bereichen. Künstliche Gerüste wurden oft zur zelluläre 3D-Baugruppen zu konstruieren. Allerdings verwendet, um zellulare Baugruppen erstellen Gerüste sind manchmal giftig und können ändern Sie die Eigenschaften der Zellen. Daher wäre es vorteilhaft, eine ungiftige Methode zur Erleichterung der Zell-Zell-Kontakt zu etablieren. In diesem Beitrag stellen wir Ihnen eine neue Methode für den Bau von stabiler zellulärer Baugruppen durch optische Pinzette mit Dextran. Ein Vorteil dieser Methode ist, dass es innerhalb weniger Minuten stabil Zell-Zell-Kontakt herstellt. Diese neue Methode ermöglicht den Bau von zellulären 3D-Baugruppen in ein natürliches hydrophiles Polymer und wird voraussichtlich für den Bau der nächsten Generation einzellige 3D-Baugruppen in den Bereichen der regenerativen Medizin und Gewebetechnik nützlich sein.

Abbildung 1 zeigt das Mikroskop und die Software, die in dieser Studie verwendet. Abbildung 2 zeigt eine schematische Darstellung des Verfahrens für die Platzierung der Probenlösung, die Zellen enthält. Abbildung 3 zeigt die Bildung einer Pyramidenstruktur optische Pinzette Doppel-Strahl. Wenn das Experiment gelingt, bleiben diese zellulären Assemblys stabil, auch nachdem der Laser abgeschaltet wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig1.jpg"> Abbildung 1 : (a) das Kontrollsystem für das Trapping-Lasersystem (NanoTracker2 (11)). Das System wird aktiviert, indem Sie folgende Schritte ① ③ Laser-Schalter einschalten. (b) die Software für die Steuerung der Trapping-Lasersystem. Kamera, Licht, Scharfstellen und bewegliche Bühne durch Klicken auf Symbole ①, ② und ③ ④, bzw. aktiviert werden. Das mikroskopische Bild wird im Bedienfeld "1" angezeigt. An/aus-Steuerung für die LED ist im Bedienfeld "2". Der Fokus wird im Bedienfeld "3" gesteuert. Die Laserstrahlen werden an den Positionen 1 und 2 durch Klicken auf Symbole bestrahlt I bis IV. Dieser Laser Trapping Systemare Angaben im Ref (12). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig2.jpg"> Abbildung 2: repräsentative Schaltplan für die Platzierung der Folie Glas. 20 µL der Probe (Zellsuspension mit Dextran) ist auf der Folie platziert und für Laser Manipulation verwendet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57815/57815fig3.jpg"> Abbildung 3 : ein) Baugruppen der Epithelzellen (NMuMG) von einer Form in einem Medium mit DEX (40 mg/mL): eine Pyramide ist als ein Beispiel für ein 3D Cluster dargestellt. b) eine schematische Abbildung der pyramidenförmigen 3D zellulären Versammlung wird ebenfalls angezeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/57815/57815fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

Wir zeigen eine neuartige Methode für das Konstruieren einer Einzel-Zell-basierte 3-dimensionale (3D) Montage ohne eine künstliche Gerüst.

Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

Regenerative medicine and tissue engineering offer several advantages for the treatment of intractable diseases, and several studies have demonstrated the ...

Diese neuartige Methodik ermöglicht es uns, dreidimensionale Baugruppen, die aus gewünschten Einzelzellen angepasst wurden, in einer wässrigen Pufferlösung zu konstruieren, die unspezifisches hydrophiles Polymer enthält, indem ein stabiler Zell-Zell-Kontakt hergestellt wird. In diesem Video zeigen wir, wie wir gewünschte Einzelzellen manipulieren und 3D-Zellbaugruppen ohne künstliches Gerüst konstruieren. Hier zeigen wir das experimentelle Verfahren in unserem Medium mit Dextran als Beispiel.Um zu beginnen, halten Sie NAMRU Maus Brustdrüsen-Epithelzellen mit fünf Milliliter DMEM, die 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin, in einem 25 Kubikzentimeter Kolben für zwei bis drei Tage. Wenn Sie bereit sind, fortzufahren, verwenden Sie einen Aspirator, um das ergänzte DMEM zu entfernen und drei bis fünf Milliliter PBS hinzuzufügen, das auf 37 Grad Celsius vorgewärmt wird, um die Zellen zu waschen. Entfernen Sie mit einem Aspirator alle PBS aus dem Kolben.Fügen Sie 1,5 Milliliter Trypsin hinzu, das bei 37 Grad Celsius vorgewärmt wird. In einem CO2-Inkubator bei 37 Grad Celsius für mindestens ein bis zwei Minuten inkubieren. Danach 3,5 Milliliter DMEM mit 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin hinzufügen.Pipette nach oben und unten zu mischen. Übertragen Sie die Zellsuspension auf ein 15 Milliliter Zentrifugenrohr und zentrifugieren Sie sie bei 417 mal G für drei Minuten bei Raumtemperatur. Dann, aspirieren Sie das Medium.Fügen Sie fünf Millimeter frisches DMEM mit 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin hinzu. Und bei Bedarf verwenden Sie eine Kryokonservierungslösung, um die Zellen gemäß den Anweisungen des Herstellers zu kryoservieren. Mischen Sie zuerst 10 Milliliter DMEM, ergänzt mit 10%FBS und 1%Penicillin-Streptomycin mit 0,8 Gramm Dextran, um eine 80 Milligramm pro Milliliter Dextran-Lösung vorzubereiten.Mischen Sie 200 Mikroliter dieser Dextran-Lösung mit 200 Mikrolitern der zuvor vorbereiteten Zellsuspension, um eine Zellsuspension mit 40 Milligramm pro Milliliter Dextran-Medium zu erzeugen. Um zu beginnen, schalten Sie Laser, beachten Sie, dass die Verwendung eines Laserstrahls mit einer Wellenlänge im roten bis nahen Infrarotbereich am effektivsten ist. Öffnen Sie als Nächstes die Software, indem Sie auf das Softwaresymbol doppelklicken.Doppelklicken Sie auf das Symbol für die Kamera und beachten Sie, dass die entsprechende Anzeige angezeigt wird. Dann doppelklicken Sie auf die Symbole für die Licht emittierende Diode, den Fokus anpassen, und die bewegliche Bühne, um ihre Displays als auch zu öffnen. Platzieren Sie zunächst zwei Glasabstandhalter auf der unteren Abdeckung Glasrutsche.20 Mikroliter, die zuvor vorbereitete Dextran-Ergänzungszellsuspension, auf den unteren Deckelglasschlitten übertragen. Legen Sie dann die obere Abdeckung Glasrutsche auf die Abstandshalter, die die Zellsuspension bedecken. Legen Sie die Probenzelle auf die untere Objektivlinse mit 10 Mikroliter destilliertem Wasser für die Wassertauchmikroskopie.Befestigen Sie die obere Objektivlinse an der Oberseite der Probenzelle mit 10 Mikroliter destilliertem Wasser. Klicken Sie als Nächstes auf die Ein-Aus-Schaltfläche im Fenster zur Mikroskopbeleuchtung, um die LED einzuschalten. Klicken Sie auf die Richtungsschaltflächen im Objektivpositionierungsfenster, um den Abstand zwischen der Probe und der unteren Objektivlinse anzupassen, bis sie im Fokus steht.Stellen Sie die Intensität jedes Laserstrahls im Signaldämpfungsfenster auf 1500 Milliwatt ein. Klicken Sie dann auf die beiden Lasersymbole, um die Laserstrahlen an Position eins und Position zwei zu bestrahlen. Klicken Sie auf die Richtungsschaltflächen im Beispielpositionierungsfenster, um die Beispielstufe zu verschieben, bis eine Zelle an Position 1 gefangen ist.Klicken und ziehen Sie den Cursor, der Position 2 angibt, bis eine andere Zelle an Position 2 gefangen ist. Um zu beginnen, bearbeiten Sie eine einzelne Zelle, sodass sie mit einer anderen Zelle in Kontakt steht. Bewahren Sie diese Bedingung 300 Sekunden lang auf, sodass die Zelle 300 Sekunden lang einem Laser ausgesetzt ist.Zeichnen Sie die x-y-Achse auf. Fangen Sie eine andere Zelle auf, und transportieren Sie sie zu den ersten beiden Zellen, um eine beliebige 2D-Zellenassembly zu erstellen. Bewegen Sie dann die Bühne nach oben und unten, um eine 3D-Zellbaugruppe zu erstellen.Vergewissern Sie sich, dass die Baugruppe auch nach dem Ausschalten des Lasers noch stabil ist. In dieser Studie werden lösliche Polymere bei der Konstruktion von 3D-Einzelzellbaugruppen verwendet. Eine Beispielstruktur, die mit der optischen Doppelstrahl-Pinzette gebildet wurde, wird hier gezeigt.Wenn das Experiment erfolgreich ist, bleiben diese zellulären Baugruppen auch nach dem Ausschalten des Lasers stabil. Diese neue Methode ist für den Bau von 3D-Zellbaugruppen in einem wässrigen Medium mit natürlichem hydrophilem Polymer bestimmt. Es wird mit großer Wahrscheinlichkeit erwartet, mit dem Bau einer solchen Art von Zellbaugruppen der nächsten Generation mit einigen der leistungsstarken Werkzeuge auf dem Gebiet der regenerativen Medizin und Tissue-Engineering zu beginnen.

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Forschung

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Biochemistry

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Ein kartesischer Biodrucker wurde entworfen und hergestellt, um die Abscheidung mehrerer Materialien in präzisen, reproduzierbaren Geometrien zu ermöglichen und gleichzeitig die Kontrolle von Umweltfaktoren zu ermöglichen. Unter Verwendung des dreidimensionalen Biodruckers können komplexe und lebensfähige Konstrukte gedruckt und leicht reproduziert werden.

Lebensfähigkeit Bioprinted Cellular Konstrukte unter Verwendung einer Drei Dispenser kartesischen Drucker

Dieses Protokoll beschreibt eine Plattform für die Herstellung von selbst-zusammengebauten Gewebe Ringe in variablen Größen mit einer angepassten 3D-gedruckten Kunststoff-Formenbau. PDMS-negative sind in der Form 3D-gedruckten geheilt; dann wird Agarose in die ausgehärtete PDMS negative gegossen. Zellen sind in die resultierende Agarose-Brunnen gesät, wo sie ins Gewebe Ringe aggregieren.

Herstellung von benutzerdefinierten Agarose Brunnen für die Aussaat von Zelle und Gewebe Ring Selbstmontage mit 3D-Druck Formen

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll zur 3D-Kultur-Systeme selbst Montage Peptid Gerüste zur Förderung der Differenzierung der entdifferenzierten menschlichen Gelenkknorpel Chondrozyten Knorpel-ähnliches Gewebe zu erhalten.

Kultivierung von Säugerzellen in dreidimensionale Peptid Gerüste

Wir präsentieren Ihnen ein Verfahren zur Steuerung der erste Zellform der Cluster in einer 3D extrazelluläre Matrix, eine wiederholbare Musterbildung zu erhalten. Eine kubische Gerät mit zwei verschiedenen Hydrogele wird eingesetzt, um Multi-direktionalen Imaging für Gewebebildung Muster zu erreichen.

Erste 3D Cluster Zellkontrolle in einem Hybrid Gel Cube Gerät für wiederholbare Muster Formationen

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur Herstellung von drei verschiedenen Arten von Sphäroiden in einer Weise, die sie für ein groß angelegtes High-Content-Screening und -Analyse geeignet macht. Darüber hinaus werden Beispiele vorgestellt, die zeigen, wie sie auf Sphäroid- und Einzelzellebene analysiert werden können.

Eine robuste Methode für die großtechnische Produktion von Sphäroiden für High-Content-Screening- und Analyseanwendungen

Zellsphäroide gelten als ein potenzielles Modell im Bereich biologischer Anwendungen. Dieser Artikel beschreibt Protokolle zur skalierbaren Erzeugung von Zellsphäroiden unter Verwendung eines 3D-Akustik-Assemblierungsgeräts, das eine effiziente Methode für die robuste und schnelle Herstellung einheitlicher Zellsphäroide bietet.

Dreidimensionales akustisches Montagegerät für die Massenfertigung von Zellsphäroiden

Lernen Sie die Konstruktion stabiler 3D-Zellverbände ohne künstliche Gerüste mithilfe von optischen Pinzetten und hydrophilen Polymeren. Diese Methode ermöglicht präzise Manipulation einzelner Zellen für Anwendungen in der Geweberegeneration.

Bearbeiten von lebenden Zellen, stabile zelluläre 3D-Baugruppe ohne künstlichen Gerüst zu bauen

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