Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, wie z. B. Tumorbildung, Verfolgung der Zellmigration sowie Signalübertragung von Krebs und gesunden Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Tumorgenese in einer 3D-Umgebung zusammen mit Stromazellen, wie z. B. Fibroblasten, kostengünstig und mit hoher Reproduzierbarkeit zu untersuchen. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Materialien sowohl biodruckbar als auch biofunktional sind, was eine quantitative Untersuchung ihrer rheologischen Eigenschaften und Zellverträglichkeit erfordert.

Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Hydrogelvorbereitung und zum Mischen des Zellhydrogels schwer zu erlernen sind, da die Blasenbildung die Wiedergabetreue des gedruckten Modells beeinträchtigt. Mischen Sie in einer Biosicherheitswerkbank drei Gramm Alginat und sieben Gramm Gelatinepulver in einem 250-Milliliter-Becherglas. Fügen Sie einen Magnetrührer und 100 Milliliter DPBS hinzu.

Verschließen Sie das Becherglas mit steriler Paraffinfolie und Aluminiumfolie, um eine Kontamination zu vermeiden. Zeigen Sie dann dem Teilnehmer die einzigartigen und spezifischen Polardiagramme, die seinen Elektromyographie- oder EMG-Mustern entsprechen. Danach das Rühren bei Raumtemperatur zwei Stunden lang fortsetzen.

Erhitzen Sie die Lösung auf 37 Grad Celsius, bis das Gel einen Phasenübergang in den flüssigen Zustand durchläuft. Füllen Sie dann die Lösung in sterile konische 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen um und verschließen Sie diese. Zentrifugieren Sie die Röhrchen fünf Minuten lang bei 834 mal g, um Gasblasen zu entfernen.

Als nächstes aspirieren Sie den Hydrogel-Vorläufer in 10-Milliliter-Spritzen. Verschließen Sie die Spritzen mit Kappen und Paraffinfolie. Bis zur Verwendung bei vier Grad Celsius lagern.

Wenn Sie bereit sind, mit dem Testen zu beginnen, legen Sie eine Spritze mit dem vorbereiteten Hydrogel-Vorläufer eine Stunde lang in ein 37 Grad Celsius heißes Wasserbad. Während sich die Spritze erwärmt, schalten Sie das Rheometer ein und initialisieren Sie es. Nehmen Sie nach einer Stunde die Spritze aus dem Wasserbad.

Extrudieren Sie etwa 0,5 Milliliter des Vorläufers auf die Rheometerplattform. Klicken Sie in der Systemsteuerung auf die Schaltfläche mit dem Dreieck nach unten. Warten Sie, bis sich das Messwerkzeug in die Trimmposition bewegt hat.

Schneiden Sie mit einem Spachtel überschüssige Vorläufer ab, die aus der Kante des Messwerkzeugs ausgetreten sind, und entsorgen Sie das überflüssige Material. Pipettieren Sie dann Mineralöl auf den Rand des Messwerkzeugs. Warten Sie, bis das Öl die Begrenzung vollständig abgedichtet hat.

Klicken Sie in der Systemsteuerung auf Weiter. Klicken Sie dann auf die Schaltfläche Start. Lassen Sie nach Abschluss des Tests das Messwerkzeug los und klicken Sie auf die Schaltfläche mit dem Dreieck nach oben.

Entfernen Sie das Messwerkzeug. Reinigen Sie sowohl das Messwerkzeug als auch die Plattform mit 70% Ethanol. Führen Sie zunächst Amplituden- und Temperatur-Sweeps durch, wie im Textprotokoll beschrieben.

Um einen isothermen Zeitdurchlauf zu starten, klicken Sie auf Meine Apps und dann auf die Vorlage für Isothermer Zeit-Temperatur-Test. Klicken Sie im Workflow auf den Schritt Messung. Klicken Sie dann auf die variable Oszillationsdehnung und rufen Sie das Setup-Fenster auf.

Stellen Sie die Schwingungsdehnung auf 0,1 % und die Schwingungsfrequenz auf ein Hertz ein. Legen Sie im Pullup-Fenster die Anzahl der Datenpunkte auf 120 fest. Legen Sie die Häufigkeit der Datenerfassung auf einen Punkt pro Minute fest.

Klicken Sie auf die Schaltfläche Hinzufügen, um die Temperaturvariable hinzuzufügen. Klicken Sie auf die variable Temperatur und stellen Sie sie auf 25 Grad Celsius ein. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Schritt Gerät, Zu Messpunkt verschieben im Workflow.

Klicken Sie auf Löschen. Klicken Sie dann auf den Schritt Gerät, Wert setzen. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Warten, bis der Wert erreicht ist, und stellen Sie den Wert auf 25 Grad Celsius ein.

Klicken Sie auf Bild, Titel, Schaltflächen im unteren Bildschirm. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Weiter. Klicken Sie dann auf den Schritt Start, benennen Sie das Projekt und speichern Sie es.

Laden Sie nun die Probe auf die Rheometerplattform und starten Sie den Test gemäß dem zuvor beschriebenen allgemeinen Testprotokoll. Beobachten Sie danach die G-Primzahl und die G-Doppelprimzahl in Abhängigkeit von der Zeit. Ermitteln Sie den Kreuzungspunkt von G-Primzahl und G-Doppelprimzahl, und bestimmen Sie die Zeit am Kreuzungspunkt.

Klicken Sie dann auf Tabelle, kopieren Sie alle Daten, und fügen Sie sie in eine Textdatei ein. Um die Streckgrenze zu verschiedenen Gelierzeitpunkten zu messen, klicken Sie auf Meine Apps. Klicken Sie auf die Vorlage für Streckgrenze und Fließspannung, Gel-ähnlich.

Benennen Sie dieses Projekt. Klicken Sie anschließend auf den Schritt Start im Workflow. Klicken Sie im oberen Menü auf Einfügen.

Wählen Sie dann im Dropdown-Menü die Option Warten aus. Rufen Sie das Setup-Fenster auf und legen Sie die Wartezeit auf 50 Minuten fest. Klicken Sie auf "Start" und dann erneut auf "Einfügen".

Wählen Sie Gerät aus dem Dropdown-Menü aus. Rufen Sie das Setup-Fenster auf, wählen Sie Temperatur und stellen Sie den Wert auf 25 Grad Celsius ein. Deaktivieren Sie das Kontrollkästchen Warten, bis der Wert erreicht ist.

Wählen Sie im Workflow den Schritt Messung aus. Wählen Sie die Variable Schubspannung aus, und rufen Sie das Setup-Fenster auf. Legen Sie die anfängliche und die endgültige Schubspannung auf null bzw. 10.000 Pascal fest.

Klicken Sie dann auf Rechner und stellen Sie die Punktdichte auf 0,2 Punkt pro Pascal ein. Legen Sie auf der Registerkarte Datenpunkte auf der linken Seite einen Punkt pro Sekunde fest. Wählen Sie am unteren Rand des Pull-up-Fensters die Registerkarte Ereignissteuerung aus, und legen Sie das Kriterium Messung stoppen, wenn die Scherrate größer als 100 pro Sekunde ist.

Laden Sie die Probe auf die Rheometerplattform und beginnen Sie den Test gemäß dem zuvor beschriebenen allgemeinen Testprotokoll. Klicken Sie nach Abschluss des Tests auf Diagramm, um die Dehnungs-Spannungs-Kurve zu beobachten. Wiederholen Sie diesen Test für Wartezeiten von 30, 40 und 50 Minuten.

Die folgenden Schritte müssen unter sterilen Bedingungen durchgeführt werden. Sterilisieren Sie zunächst den Biodrucker, indem Sie ihn gründlich mit 70 % Ethanol besprühen und dann über Nacht UV-Licht aussetzen. Nehmen Sie eine Spritze mit Hydrogel-Vorläufer aus dem Lager und erwärmen Sie sie eine Stunde lang in einem 37 Grad Celsius warmen Wasserbad.

Übertragen Sie einen T-Kolben mit zuvor kultivierten Zellen aus einem CO2-Inkubator in die Biosicherheitswerkbank. Verwerfen Sie das Kulturmedium und spülen Sie die Zellen zweimal mit DPBS. Geben Sie eine erwärmte Trypsin-EDTA-Lösung in die Zellen.

Inkubieren Sie sechs Minuten lang bei 37 Grad Celsius. Deaktivieren Sie danach das Trypsin, indem Sie das gleiche Volumen FBS hinzufügen. Nehmen Sie die Spritze mit dem Hydrogel-Vorläufer aus dem Wasserbad und reinigen Sie sie.

Sterilisieren Sie die Spritze mit 70 % Ethanol, bevor Sie sie in die Biosicherheitswerkbank überführen. Extrudieren Sie etwa drei Milliliter Hydrogel-Vorläufer in eine 10-Milliliter-Druckpatrone. Mischen Sie den Vorläufer mit MDA-MB-231-GFP-Zellen in einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter, indem Sie ihn langsam pipettieren, um Blasenbildung zu vermeiden.

Decken Sie die Patrone mit dem Ende und den oberen Kappen ab und verschließen Sie sie mit Paraffinfolie. Dann zentrifugieren Sie es eine Minute lang bei 834 mal g, um Gasblasen zu entfernen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die anderen Vorläufer.

Danach sterilisieren Sie alle drei Kartuschen mit 70% Ethanol. Legen Sie die sterilisierten Patronen in die Kammern des Biodruckers ein. Klicken Sie in der Steuerungssoftware des Druckers auf Manuell.

Erweitern Sie dann die Registerkarte Werkzeugkopf in der Steuerungssoftware des Druckers. Klicken Sie auf eine Kartusche in der grafischen Benutzeroberfläche auf der linken Seite, stellen Sie die Kartuschentemperatur auf 25 Grad Celsius ein und warten Sie 35 Minuten, bis der Vorläufer druckbare Bedingungen erreicht. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die beiden anderen Patronen.

Erweitern Sie in der Steuerungssoftware des Druckers die Registerkarte Werkzeugkopf. Klicken Sie auf eine Patrone in der grafischen Benutzeroberfläche und dann auf die Schaltfläche "Kurz messen", um die Position der Düsenspitze zu messen. Wiederholen Sie diesen Vorgang für die beiden anderen Patronen.

Positionieren Sie als Nächstes eine durchsichtige Mikroplatte aus Polystyrol auf dem Druckertisch. Öffnen Sie die G-Code-Datei und ändern Sie den Druck für alle Patronen auf 200 Kilopascal. Kehren Sie zur Steuerungssoftware zurück und klicken Sie auf die Registerkarte Gerüstordner-Generator.

Wählen Sie einen Punkt aus, an dem der Druck gestartet werden soll, und klicken Sie dann auf die Schaltfläche Ausführen. Wiederholen Sie diesen Vorgang, um drei Replikate zu erhalten. Fügen Sie danach eine 100-millimolare Calciumchloridlösung für eine Minute hinzu, um die Modelle zu vernetzen.

Zweimal mit DPBS spülen. Übertragen Sie die Modelle dann mit einem Spatel vorsichtig auf eine mit Agarose beschichtete Sechs-Well-Platte. Geben Sie fünf Milliliter DMEM in jede Vertiefung und inkubieren Sie bei 37 Grad Celsius und 5 % Kohlendioxid, wobei das Zellkulturmedium alle drei Tage ausgetauscht wird.

In dieser Studie werden dreidimensionale Hydrogelsysteme hergestellt, um in vivo Tumormikroumgebungen zu rekapitulieren und die Bildung von mehrzelligen Tumorsphäroiden zu erleichtern. Ein Temperatur-Sweep des A3G7-Vorläufers zeigt, dass die G-Doppelprimzahl bei 37 Grad Celsius größer ist als die G-Primzahl, was die bekannten Eigenschaften des Vorläufers bestätigt. Wenn die Temperatur sinkt, erfährt der Vorläufer aufgrund der spontanen physikalischen Verschränkung der Gelatinemoleküle zu einer Trihelix-Bildung eine physikalische Gelierung.

Sowohl die G-Primzahl als auch die G-Doppelprimzahl erhöhen, die Temperatur sinkt und konvergiert bei 30,6 Grad Celsius, was auf einen Sol-Gel-Übergang hinweist. Die konfokale Mikroskopie des gedruckten Propellermodells zeigt, dass die MDA-MB-231-GFP-Zellen nach 15 Tagen der Kulturperiode beginnen, Sphäroide zu entwickeln, und die Sphäroide bis zum 30. Tag weiter an Größe und Anzahl zunehmen. Einige der IMR-90-mCherry-Zellen bilden auch Agglomerationen.

Nach 30-tägiger Kultivierung konnten IMR-90-mCherry-Zellen in der Region beobachtet werden, die ursprünglich von den MDA-MB-231-GFP-Zellen besetzt war, während MDA-MB-231-GFP-Zellen in der IMR-90-mCherry-dominierten Region zu sehen waren. Dies impliziert mögliche Migrationsereignisse im Modell. Die konfokale Mikroskopie des Scheibenmodells zeigt, dass sich MDA-MB-231-GFP-Zellen ähnlich wie im Propellermodell verhalten, was nach 21 Tagen Kultur zu einem sphäroidbeladenen Hydrogel führt.

Einmal gemeistert, kann diese Technik zum Drucken von Modellen in zwei Stunden durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, daran zu denken, Hydrogel und Zellen so frisch wie möglich zu halten, alte Hydrogelchargen nicht mit neuen zu mischen und unter sterilen Bedingungen zu arbeiten, um irreführende Ergebnisse zu vermeiden. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie Rasterelektronen- und Zeitraffermikroskopie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen wie Materialporosität, Zellmigrationsrate und Matrixumbau zu beantworten.

Die Implikation dieser Technik erstreckt sich auch auf die Krebstherapie, da dieses in vitro-Modell systematisch kontrollierte Studien der Tumorbildung und des Tumorverhaltens in Co-Kultursystemen ermöglicht. Neben Brustkrebszellen kann das Modell auch problemlos auf Systeme angewendet werden, die andere Zelltypen an verschiedenen Ausgangsorten verwenden. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie heterogene 3D-Krankheitsmodelle erstellen können, indem Sie Hydrogele richtig vorbereiten, Zellen in das Material einbetten und das Material innerhalb des optimalen Druckfensters drucken.

Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit biologischen Proben äußerst gefährlich sein kann und Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen persönlicher Schutzausrüstung wie Handschuhe, Laborkittel und Schutzbrille bei der Durchführung dieses Verfahrens