Name: Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-02T14:30:00.000+00:00
Duration: 16 min 20 s
Description: Erfahren Sie die Herstellung bioprintbarer Alginat/Gelatine-Hydrogel für 3D-Tumormodelle mit MDA-MB-231-Zellen und Fibroblasten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorstroma-Interaktionen und Sphäroidbildung.

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Tao Jiang Dank der China Scholarship Council (201403170354) und McGill Engineering Promotion Award (90025) für ihre Stipendium Finanzierung. Jose G. Munguia-Lopez Dank CONACYT (250279, 290936 und 291168) und FRQNT (258421) für ihre Stipendium Finanzierung. Salvador Flores-Torres Dank CONACYT für ihr Stipendium finanziert (751540). Joseph M. Kinsella Dank der National Science und Engineering Research Council, der kanadischen Stiftung für Innovation, die Townshend-Lamarre Family Foundation und die McGill University für ihre Finanzierung. Wir möchten Allen Ehrlicher danken für die Erlaubnis, seine Rheometer, Dan Nicolau für die Überlassung seiner confocal Mikroskop und Morag Park für die Gewährung von Zugang zu eindringmittel beschrifteten Zelllinien zu verwenden.

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Die Autoren haben nichts preisgeben.

Zelle-beladenen Strukturen können beeinträchtigt werden, wenn Kontamination (biologische oder chemische) an jedem Punkt im Prozess auftritt. In der Regel Biologische Kontamination gilt nach zwei oder drei Tage der Kultur als eine Farbe ändern in den Kultur-Medien oder die Bioprinted-Struktur. Daher ist die Sterilisation (physikalische und chemische Desinfektion) ein wichtiger Schritt für alle Handy-bezogenen Prozesse. Bemerkenswert, Autoklavieren Gelatine ändert seine gelierende Eigenschaften, wodurch es langsamer gel in...

Obwohl 2D Zellkultur in der Krebsforschung verbreitet ist, gibt es Einschränkungen, wie die Zellen in einem monomolekularen Film-Format mit einer einheitlichen Konzentration von Nährstoffen und Sauerstoff angebaut werden. Diese Kulturen fehlen wichtige Zell-Zell und Zellmatrix Interaktionen in der nativen Tumor Mikroumgebung (TME). Diese Modelle rekapitulieren infolgedessen schlecht physiologische Bedingungen, wodurch aberranten Zelle Verhalten, einschließlich unnatürlich Morphologien, unregelmäßige Rezeptor Organisation, Membran-Polarisation und abnorme Genexpression, unter anderem Bedingungen1,2,3,4. Auf der anderen Seite bietet 3D Zellkultur, wo Zellen in einem volumetrischen Raum als Aggregate, Sphäroide oder Organellen erweitert werden, eine alternative Technik erstellen genauere in-vitro- Umgebungen um grundlegende Zellbiologie und Physiologie zu studieren. 3D zellmodelle Kultur können auch Zelle-ECM Interaktionen fördern, die kritischen physiologischen Eigenschaften des nativen TME in-vitro-1,4,5. Die neue 3D Bioprinting Technologie bietet Möglichkeiten Modelle zu bauen, die die heterogene TME zu imitieren.
3D Bioprinting ist abgeleitet von rapid-Prototyping und ermöglicht die Herstellung von 3D Mikrostrukturen, die imitiert einige von der Komplexität des Lebens können Gewebe Proben6,7. Die aktuellen Bioprinting Methoden beinhalten Inkjet, Extrusion und Lasergestützte Druck8. Unter ihnen kann die Extrusion-Methode die Heterogenität innerhalb der gedruckten Matrizen durch die präzise Positionierung verschiedene Arten von Materialien an verschiedenen ursprünglichen Standorten gesteuert werden. Daher ist es der beste Ansatz für heterogene in-vitro- Modelle mit mehreren Arten von Zellen oder Matrizen zu fabrizieren. Extrusion Bioprinting hat erfolgreich zur Ohrmuschel geformte Gerüste9, vaskulären Strukturen10,11,12, zu bauen und die Haut Gewebe13, was zu hohen Druck Treue und Zelle Lebensfähigkeit. Die Technologie bietet auch vielseitige Material Auswahlen, die Möglichkeit, Materialien mit Zellen eingebettet mit einem bekannten Dichte und hohe Reproduzierbarkeit14,15,16,17 zu hinterlegen . Natürliche und synthetische Hydrogele dienen häufig als Bioinks für 3D Bioprinting wegen ihrer Bioverträglichkeit, Bioaktivität und ihre hydrophilen Netzwerke, die entwickelt werden können, um die ECM7,18 strukturell ähneln ,19,20,21,22,23. Hydrogele sind auch vorteilhaft, da sie können Klebestellen für Zellen, Strukturelemente, Durchlässigkeit für Nährstoffe und Gase enthalten, und die entsprechenden mechanischen Eigenschaften fördern Entwicklung24 Zelle. Zum Beispiel bieten Kollagen Hydrogele Integrin Anchorage-Websites, die Zellen verwenden können, um die Matrix zuordnen. Gelatine, denaturiertes Kollagen, behält sich ähnliche Zelle Adhäsion Websites. Im Gegensatz dazu Alginat ist Bioinert bietet aber mechanische Integrität durch die Bildung von Querverbindungen mit zweiwertigen Ionen25,26,27,28.
In dieser Arbeit entwickelten wir eine zusammengesetzte Hydrogel als ein Bioink, bestehend aus Alginat und Gelatine, Ähnlichkeiten mit der mikroskopischen Architektur eine native Tumor-Stroma. Brustkrebs-Zellen und Fibroblasten waren eingebettet in die Hydrogele und gedruckt über eine Extrusion-basierte Bioprinter um ein 3D-Modell zu erstellen, die in Vivo Mikroumgebung imitiert. Veränderte 3D-Umgebung kann Krebszellen zu mehrzelligen Tumor Sphäroide (MCTS) bilden mit einer hohen Rentabilität für lange Zeitspannen der Zellkultur (> 30 Tage). Dieses Protokoll zeigt die Methoden der Synthese zusammengesetzter Hydrogele, Charakterisierung der Materialien Mikrostruktur und Bedruckbarkeit, heterogene zellmodellen Bioprinting, und beobachten die Bildung von MCT-Fette. Diese Methoden können genutzt werden, um andere Bioinks in Extrusion Bioprinting sowie über verschiedene Ausführungen von heterogenen Gewebemodelle mit Anwendungsmöglichkeiten in Drogen-Screening, Zelle Migration Tests und Studien, die sich auf grundlegende Zelle physiologischen Funktionen.

<table><tbody><tr><td>Natriumalginat</td><td>FMC BioPolymer</td><td>CAS-Nr.: 9005-38-3</td><td>Protanal LF 10/60 FT</td></tr><tr><td></td><td>Gelatine Sigma-Aldrich</td><td>G9391</td><td>Typ B Gelatine aus Rinderhaut</td></tr><tr><td>Dubelcco's phosphatgepufferte Kochsalzlösung (DPBS 1X)</td><td>Gibco</td><td>LS14190136</td><td>1&mal;, ohne Kalzium, ohne Magnesium</td></tr><tr><td>Magnetische Heizplatte</td><td>Corning&nbsp;</td><td>N/A</td><td>Rührer/Heizplatte Modell PC-420</td></tr><tr><td>50 mL Zentrifugenröhrchen</td><td>Corning</td><td>352098</td><td>Falcon&reg; 50 mL High Clarity PP Zentrifugenröhrchen, konischer Boden, sterile</td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>GMI</td><td>N/A</td><td>Sorvall RT6000D, GMI, USA</td></tr><tr><td>Calciumchlorid wasserfrei</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1016</td><td></td></tr><tr><td>MilliQ Wasser</td><td>Millipore</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Millipore 0,22 &Mikro; m filters</td><td>Millipore</td><td>SLGS033SB</td><td>Millex-GS Spritzenvorsatz-Filtereinheit, 0,22&nbsp; &Mikro; M, gemischte Celluloseester, 33&nbsp; mm, Ethylenoxid sterilisiert</td></tr><tr><td>Oszillationsrheometer MCR 302</td><td>Anton Paar</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Rheometer Messgerät CP25</td><td>Anton Paar</td><td>79038</td><td>Konische Plattengeometrie für Rheometer</td></tr><tr><td>RheoCompass</td><td>Anton Paar</td><td>N/A</td><td>Software zur Steuerung des Rheometers MCR 302</td></tr><tr><td>Rasterelektronenmikroskop</td><td>Hitachi</td><td>N/A</td><td>REM, Hitachi SU-3500 Variabler Druck</td></tr><tr><td>Paraformaldehyd, 96%, extra rein</td><td>Acros Organics</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco modifiziertes Adlermedium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotika-/Antimykotische Lösung (100X) stabilisiert</td><td>Sigma</td><td>A5955</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Wisent Bioproducts</td><td>080-150</td><td></td></tr><tr><td>Zellkultur-T-75-Kolben</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430641</td><td>75 cm2 TC-behandelte Oberflächenbehandlung</td></tr><tr><td>3D-Biodrucker BioScaffolder 3.1</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>GeSim Software</td><td>GeSiM</td><td>N/A</td><td>Software Steuerung BioScaffolder 3.1</td></tr><tr><td>10cc Kartusche UV-Resist</td><td>EFD Nordson</td><td>7012126</td><td></td></tr><tr><td>Endkappe</td><td>EFD Nordson</td><td>7014472</td><td></td></tr><tr><td>Spitzenkappe</td><td>EFD Nordson</td><td></td><td></td>7014469</tr><tr><td>Kolben&nbsp;</td><td>EFD Nordson</td><td>7012182</td><td></td></tr><tr><td>Edelstahldüse G25</td><td>EFD Nordson</td><td>7018345</td><td></td></tr><tr><td>Wasserbad</td><td>VWR</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9539</td><td>Bioreagenz, für die Molekularbiologie</td></tr><tr><td>Costar 6-Well-Platten&nbsp;</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>TC-behandelte Multi-Well-Platten, einzeln verpackt, steril&nbsp;</td></tr><tr><td>Konfokales inverses Mikroskop mit rotierender Scheibe</td><td>Olympus Life Science N</td><td>/A</td><td>Olympus IX83</td></tr><tr><td>MTS Assay Kit</td><td>Promega</td><td>G3582</td><td>CellTiter 96&reg; AQueous&nbsp; One Solution Zellproliferations-Assay&nbsp;</td></tr><tr><td>Lebend/tot Zytotoxizitätskit</td><td>Molekulare Sonden, ThermoFisher Scientific</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin 0,25/EDTA 1X</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Corning 96-Well-Platte</td><td>Corning</td><td>3595</td><td>Durchsichtige Mikroplatte aus Polystyrol mit flachem Boden, TC-behandelt, einzeln verpackt, mit Deckel mit geringer Verdampfung, steriler</td></tr><tr><td>Autoklav Tuttnauer</td><td>Heidolph Brinkmann</td><td>N/A</td><td>Heidolph Tuttnauer 2540E Autoklaven-Sterilisator Elektronisches Modell mit 4 Edelstahlschalen, 23L Fassungsvermögen</td></tr><tr><td>Trypanblau</td><td>Invitrogen&nbsp;</td><td>T10282</td><td>0,4%ige Lösung</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Gewerbliche Alkohole</td><td>P016EA95</td><td>Greenfield Spezialalkohole</td></tr><tr><td>CO2 Inkubator</td><td>Panasonic</td><td>N/A</td><td>MCO 19AIC-PA</td></tr><tr><td>Lyophilisator&nbsp;</td><td>SP Scientific</td><td>N/A</td><td>Virtis Sentry 2.0</td></tr><tr><td>SolidWorks</td><td>Dassault Systems</td><td>N/A</td><td>Eine CAD-Software zum Erstellen eines propellerähnlichen Demonstrationsmodells</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Die MathWorks</td><td>N/A</td><td>Eine Programmiersoftware zur Generierung von G-Code für BioScaffolder 3.1</td></tr></tbody></table>

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Bioprintable Alginate/Gelatin Hydrogel 3D In Vitro Model Systems Induce Cell Spheroid Formation

Die zelluläre, Biochemische und biophysikalische Heterogenität der native Tumor Mikroumgebung ist nicht durch wachsende verewigt Krebszelllinien, die mit herkömmlichen zweidimensionalen (2D) Zellkultur zusammengefaßt. Durch den Einsatz von Bioprinting Techniken die um heterogene dreidimensionale (3D) Tumor Modelle zu bauen, wobei verschiedene Arten von Zellen eingebettet sind, können diese Herausforderungen bewältigt werden. Alginat und Gelatine sind zwei der am häufigsten verwendeten Biomaterialien in Bioprinting aufgrund ihrer Biokompatibilität, Bionik und mechanischen Eigenschaften eingesetzt. Durch die Kombination der beiden Polymere, erzielten wir ein Bioprintable zusammengesetzte Hydrogel Ähnlichkeiten mit der mikroskopischen Architektur eine native Tumor-Stroma. Wir studierten die Bedruckbarkeit der zusammengesetzten Hydrogel über Rheologie und erhalten die optimale Druck-Fenster. Brustkrebs-Zellen und Fibroblasten waren eingebettet in die Hydrogele und gedruckt werden, um ein 3D-Modell imitiert die Mikroumgebung in Vivo zu bilden. Das Bioprinted heterogenen Modell erreicht eine hohe Rentabilität für langfristige Zellkultur (> 30 Tage) und fördert die Selbstorganisation von Brustkrebszellen in mehrzelligen Tumor Sphäroide (MCTS). Wir beobachteten die Migration und die Interaktion der Krebs-assoziierten fibroblastenzellen (CAFs) mit MCTS in diesem Modell. Bioprinted Zelle Kultur Plattformen als kokultur Systeme verwenden, bietet es ein einzigartiges Werkzeug, um die Abhängigkeit der Tumorgenese Stroma Komposition zu studieren. Diese Technik verfügt über einen hohen Durchsatz, niedrige Kosten und hohe Reproduzierbarkeit kann, und es auch ein alternatives Modell zu herkömmlichen Zellkulturen Monolage und tierischen Tumormodellen Krebsbiologie zu studieren.

Die Temperatur-Sweep zeigt einen deutlichen Unterschied der A3G7 Vorstufe bei 25 ° C und 37 ° C. Die Vorstufe ist bei 37 ° C flüssig und hat eine komplexe Viskosität von 1938.1 ± 84,0 mPa x s, die durch eine größere G überprüft wird "über G'. Da die Temperatur abnimmt, erfährt der Vorläufer physischen Gelierung durch die spontane körperliche verfangen der Gelatine Moleküle in einem Tri-Helix Bildung29,30. Sowohl die G' und G "erhö...

Wir entwickelten eine heterogene Brust-Krebs-Modell, bestehend aus verewigt Tumor und Fibroblasten-Zellen eingebettet in ein Bioprintable Alginat/Gelatine Bioink. Das Modell der in Vivo Tumor Mikroumgebung rekapituliert und erleichtert die Bildung von mehrzelligen Tumor Sphäroide, Einblick in die Mechanismen fahren Tumorgenese nachgeben.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

The cellular, biochemical, and biophysical heterogeneity of the native tumor microenvironment is not recapitulated by growing immortalized cancer cell ...

Diese Methode kann dazu beitragen, wichtige Fragen im Bereich der Krebsbiologie zu beantworten, wie z. B. Tumorbildung, Verfolgung der Zellmigration sowie Signalübertragung von Krebs und gesunden Zellen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie es uns ermöglicht, die Tumorgenese in einer 3D-Umgebung zusammen mit Stromazellen, wie z. B. Fibroblasten, kostengünstig und mit hoher Reproduzierbarkeit zu untersuchen. Es ist wichtig, sicherzustellen, dass die Materialien sowohl biodruckbar als auch biofunktional sind, was eine quantitative Untersuchung ihrer rheologischen Eigenschaften und Zellverträglichkeit erfordert.Die visuelle Demonstration dieser Methode ist von entscheidender Bedeutung, da die Schritte zur Hydrogelvorbereitung und zum Mischen des Zellhydrogels schwer zu erlernen sind, da die Blasenbildung die Wiedergabetreue des gedruckten Modells beeinträchtigt. Mischen Sie in einer Biosicherheitswerkbank drei Gramm Alginat und sieben Gramm Gelatinepulver in einem 250-Milliliter-Becherglas. Fügen Sie einen Magnetrührer und 100 Milliliter DPBS hinzu.Verschließen Sie das Becherglas mit steriler Paraffinfolie und Aluminiumfolie, um eine Kontamination zu vermeiden. Zeig

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Das folgende Protokoll stellt Techniken zur Verkapselung Pankreas β-Zellen in Schritt-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele durch Thiol-En-Foto-Klick-Reaktionen gebildet. Dieses Material-Plattform bietet nicht nur eine cytocompatible Mikroumgebung für Zellverkapselung, sondern erlaubt auch benutzergesteuerten rasche Erholung von Zellstrukturen innerhalb der Hydrogele gebildet.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Ein bioprinter wurde verwendet, um strukturierte Hydrogele auf einem Opfer-Form zu erstellen. Das Poloxamer Form wurde mit einem zweiten Hydrogel verfüllt und dann eluiert, so dass Hohlräume, die mit einem dritten Hydrogel gefüllt wurden. Diese Methode verwendet schnelle Elution und gute Bedruckbarkeit von Poloxamers zu komplexen Architekturen aus Biopolymeren zu generieren.

Drucken Thermoresponsive Reverse-Formen für die Erstellung von Gemusterte Zweikomponenten-Hydrogele für 3D Zellkultur

Hier beschreiben wir ein schnelles und flexibles Protokoll für die Bildung von 3D-Zellsphäroiden durch Zellaggregation. Dies lässt sich leicht an mehrere Zelltypen anpassen und eignet sich für den Einsatz in einer Vielzahl von Anwendungen, einschließlich Zellmigrations-, Invasions- oder Anoikis-Assays sowie für die Bildgebung und Quantifizierung von Zell-Matrix-Interaktionen.

Eine effiziente und flexible Zellaggregationsmethode für 3D-Sphäroid-Produktion

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von elastischen 3D makroporöse Microcryogels durch die Integration von Microfabrication mit Cryogelation Technologie. Beim Laden mit Zellen, entstehen 3D Microtissues, die kann leicht injizierte in Vivo , regenerative Therapie zu erleichtern oder zu Arrays für in-vitro- Hochdurchsatz-Drogen-Screening montiert.

3D Microtissues für injizierbare Regenerative Therapie und Hochdurchsatz-Drogen-Screening

Präsentiert hier ist eine Methode für den 3D-Bioprinting von Gelatine Methacryloyl.

Protokolle des 3D-Bioprintings von Gelatine Methacryloyl Hydrogel-basierten Bioinks

Das Ziel dieses Protokolls ist es, Brustepithelzellen als multizelluläre Sphäroide direkt auf vorgeformte endotheliale Netzwerke zu bioprinten, um schnell 3D-Brust-Endothel-Kokulturmodelle zu erstellen, die für Arzneimittelscreening-Studien verwendet werden können.

Direkter Bioprinting von 3D Multizellulären Brustsphäroiden auf Endotheliale Netzwerke

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine Technik zur kostengünstigen Herstellung von Gewebesphäroiden in großem Maßstab unter Verwendung eines 3D-gedruckten stempelähnlichen Geräts.

Erzeugung von Gewebesphäroiden über ein 3D-gedrucktes stempelähnliches Gerät

Die Scherverarbeitung während der Hydrogelbildung führt zur Herstellung von Mikrogelsuspensionen, die scherdünn sind, sich aber nach Beseitigung der Scherkräfte schnell restrukturieren. Solche Materialien wurden als Stützmatrix für das Bioprinting komplexer, zellbeladener Strukturen verwendet. Hier werden Verfahren zur Herstellung des Stützbettes und kompatibler Biotinten beschrieben.

Agarose-Flüssiggele, die durch Scherverarbeitung während der Gelierung für suspendierten 3D-Biodruck gebildet werden

Hier stellen wir ein Protokoll vor, das eine schnelle, robuste und kostengünstige Herstellung von Tumorsphäroiden mit anschließender Hydrogelverkapselung ermöglicht. Es ist weit verbreitet, da es keine spezielle Ausrüstung erfordert. Es wäre besonders nützlich für die Erforschung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen und die Erstellung von In-vitro-Gewebephysiologie - oder Pathologiemodellen.

Herstellung und Verkapselung von Tumorsphäroiden in Polyethylenglykol-Hydrogelen zur Untersuchung von Sphäroid-Matrix-Wechselwirkungen

In dieser Studie wird eine kostengünstige und effiziente Methodik zur Generierung von 3D-Zellstrukturen unter Verwendung eines stempelbasierten Systems zur Erstellung von Mikrovertiefungen in Agaroseformen vorgestellt. Das System fördert die Bildung einheitlicher Sphäroide/Organoide und verbessert so die Zellinteraktionen. Dieser Ansatz reduziert die experimentelle Variabilität und unterstützt Anwendungen in der Wirkstoffdiagnostik und im Tissue Engineering.

Erzeugung von dreidimensionalen Sphäroiden/Organoiden aus zweidimensionalen Zellkulturen mit Hilfe eines neuartigen Stempelgeräts

Erfahren Sie die Herstellung bioprintbarer Alginat/Gelatine-Hydrogel für 3D-Tumormodelle mit MDA-MB-231-Zellen und Fibroblasten. Diese Methode ermöglicht die Untersuchung von Tumorstroma-Interaktionen und Sphäroidbildung.

Bioprintable Alginat/Gelatine Hydrogel 3D In-vitro- Modellsysteme induzieren Sphäroid Zellbildung

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