Nagetier Verhaltens Tests, um funktionelle Defizite verursacht durch Mikroelektrode Implantation im motorischen Kortex Ratte bewerten

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich des Neural Engineering zu beantworten, z. B. ob die Implantation von Geräten Auswirkungen auf die langfristige motorische Funktion hat. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass im Gegensatz zur Endpunkt-Histologie das fortlaufende Verhalten eine Echtzeit- und globale Messung der motorischen Funktion während des gesamten Studienverlaufs ermöglicht. Um dieses Verfahren zu beginnen, injizieren Sie dem Tier subkutan ein Cephalosporin-Antibiotikum, um eine Infektion zu verhindern, und ein nichtsteroidales entzündungshemmendes Mittel zur Schmerzbehandlung.

Tragen Sie anschließend eine Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um ein Austrocknen zu verhindern. Schneiden Sie mit einem Nagelknipser für kleine Tiere die Zehennägel ab, um zu verhindern, dass das Tier während der Wundheilung nach der Operation die Nähte zerkratzt. Anschließend wird ein lokales Analgetikum mit einer subkutanen Injektion von Bupivacain in den Bereich des Schnitts am Kopf des Tieres verabreicht.

Befestigen Sie das Tier mit Ohrstangen auf einem stereotaktischen Rahmen, um zu verhindern, dass sich der Kopf während der Operation bewegt. Legen Sie dann ein zirkulierendes Wasserheizkissen unter das Tier, um seine Innentemperatur zu halten. Anschließend schrubben Sie den Operationsbereich mit einer abwechselnden Betadin-Lösung und Isopropanol-Peelings.

Führen Sie dann eine Zehenkneifung gemäß dem institutionellen Protokoll durch, um sicherzustellen, dass sich das Tier unter der Operationsebene befindet. Um das Tier auf die Implantation vorzubereiten, machen Sie einen Schnitt von etwa einem Zoll entlang der Mittellinie, um den Schädel freizulegen. Entfernen Sie das Periost stumpf mit einem Applikator mit Wattespitze und stoppen Sie Blutungen mit einem Stück Gaze.

Ziehen Sie dann das umliegende Gewebe mit Krokodilklemmen oder Hämostaten zurück. Nachdem der Schädel gereinigt wurde, tragen Sie einige Tropfen Gewebekleber auf Cyanacrylatbasis auf den freiliegenden Schädel auf, um die Zahnzementverklebung in späteren Schritten zu verbessern. Markieren Sie in der gewählten Hemisphäre die Region des motorischen Kortex, die der Bewegung der Vorderpfote entspricht, indem Sie eine Kerbe in den Knochen schlagen.

Entfernen Sie einen Teil des Schädels mit einem 1,75 Millimeter langen Zahnbohrer mit abgerundeter Spitze, wobei besonders darauf zu achten ist, nicht zu schnell oder zu tief zu bohren. Der Bohrer sollte intermittierend auf den Schädel aufgetragen werden, um eine Überhitzung zu vermeiden. Entfernen Sie mit Kochsalzlösung und leichtem Saugen alle Knochenreste vom Schädel.

Achten Sie darauf, die Dura beim Bohren nicht zu beschädigen. Verwenden Sie dann feine Rongeure oder gebogene Mikrozangen, um den restlichen Knochen zu entfernen. Reflektieren Sie anschließend die Dura mit einem feinen Haken mit 45-Grad-Dura-Plektrum.

Reinigen Sie Blutungen mit einem Applikator mit Wattespitze und Kochsalzlösung und achten Sie darauf, die Gehirnoberfläche nicht direkt zu berühren. Um die Mikroelektrode in den Motorkortex einzuführen, montieren Sie die sterilisierte Mikroelektrode vorsichtig in der Universalhalterung auf dem stereotaktischen Rahmen und achten Sie darauf, den Schaft der Elektrode nicht zu stoßen. Stellen Sie sicher, dass der Schnittstellenstecker der Elektrode fest von der Halterung gehalten wird.

Positionieren Sie mit dem Mikromanipulator auf dem stereotaktischen Rahmen vorsichtig die Spitze der Elektrode über der offenen Kraniotomie. Senken Sie die Elektrode vorsichtig etwa zwei Millimeter in das Gehirn ab. Seien Sie vorsichtig, um sichtbare Gefäße nach Möglichkeit zu vermeiden.

Für das manuelle/manuelle Einführen, wie hier gezeigt, wird eine Mikrozange verwendet, um die nicht funktionsfähige Dummy-Mikroelektrode aus Silikon einzuführen. Sobald die Elektrode eingesetzt ist, lösen Sie den Stecker vorsichtig aus der Universalhalterung und ziehen Sie den Einführarm ein. Reinigen Sie vorsichtig alle Blutungen um die Elektrode herum mit einem Applikator mit Wattespitze und Kochsalzlösung.

Anschließend schließen Sie die Kraniotomie um die implantierte Elektrode mit einem Silikonelastomer ab. Befestigen Sie dann die Elektrode mit Zahnzement am Schädel. Sobald der Zement vollständig trocken ist, bringe die Ränder des Einschnitts an der Vorder- und Rückseite der Zementkopfkappe zusammen und nähe sie zu.

Bei nicht funktionierenden Implantaten kann der gesamte Schnitt verschlossen werden. Um mit dem Test im Freiland zu beginnen, platzieren Sie das Tier in der Mitte des Gitters und zeigen vom Tester abgewandt. Lassen Sie das Tier drei Minuten lang frei laufen, während Sie ein Video aufnehmen.

Wenn das Tier die Tests abgeschlossen hat, nehmen Sie es aus dem Gitter und reinigen Sie das Gitter gründlich mit Sterilisationsmittel auf Chlordioxidbasis. Analysieren Sie die Anzahl der gekreuzten Gitterlinien, die zurückgelegte Gesamtstrecke und die maximale Geschwindigkeit des Tieres als Metriken der Grobmotorik mit einer Video-Tracking-Software. Für Leitertests ist eine einwöchige Schulung erforderlich, bevor die Ausgangswerte vor der Operation aufgezeichnet werden.

Bringen Sie das Tier dann in einen provisorischen, sauberen Käfig, um mit dem Leitertest zu beginnen. Stellen Sie die Leiter so auf, dass sie zwei Käfige überbrückt. Das Startende der Leiter ruht auf einem sauberen Käfig, und das Zielende ruht im Heimkäfig des Tieres, um als Motivation für den Abschluss des Laufs zu dienen.

Positionieren Sie die Videokamera, mit der die Leiterprüfung gefilmt wird, auf einem Stativ in der Mitte der Leiter um die Sprossenhöhe. Halten Sie das Tier mit einer laufenden Videokamera an der Startlinie der Leiter fest, sodass seine Vorderpfoten die erste Sprosse berühren können. Lassen Sie die Ratte die Leiter in ihrem eigenen Tempo überqueren.

Die Zeit, die zwischen dem Moment, in dem die Pfote des Tieres die erste Sprosse berührt, und der Ziellinie der drittletzten Sprosse verstrichen ist, bestimmt die Zeit des Tieres zum Überqueren. Wenn sich das Tier auf der Leiter umdreht oder sich 20 Sekunden lang nicht bewegt, gehen Sie davon aus, dass das Tier versagt. Weisen Sie ihm für jeden fehlgeschlagenen Lauf eine Strafpunktzeit zu und bestimmen Sie die Strafzeit anhand der langsamsten Leistung, die während des Tests vor der Operation aufgezeichnet wurde.

Lassen Sie jedes Tier die Leiter fünfmal pro Testtag überqueren, mit einer Pause von etwa einer Minute zwischen jedem Lauf. Durchschnittlich die schnellsten drei Läufe pro Tag als Metrik für die Feinmotorik. Erfassen Sie außerdem, wie oft jede der Vorderpfoten mit einer Video-Tracking-Software von den Sprossen rutscht.

Positionieren Sie für die Prüfung der Griffkraft das Griffkraftmessgerät an der Kante der Theke, wobei der Grifflenker über den Boden hinausragt. Lassen Sie das Tier dann mit beiden Vorderpfoten den Lenker greifen, während Sie das Tier an der Basis des Schwanzes festhalten. Sobald das Tier mit jeder Pfote einen festen Griff hat, ziehen Sie es mit langsamer und gleichmäßiger Kraft an der Basis des Schwanzes vom Messgerät weg.

Notieren Sie die maximale Greifkraft, die das Tier mit dem Greifkraftmessgerät ausübt. Testen Sie jedes Tier dreimal pro Testtag mit einer Pause von etwa zwei Minuten zwischen jedem Test. Als Metrik für die Feinmotorik ist die maximale Griffkraft aus jedem der drei Versuche aufzuzeichnen und zu mitteln.

Ein signifikanter Unterschied in der Leistung des Freilandgitters zwischen Kontrolltieren und implantierten Tieren wurde nur in der ersten Testwoche nach der Erholungsphase beobachtet. Für den Rest der Studie gab es keinen Unterschied in der Leistung, was auf kein langfristiges Defizit der Bruttomotorik hindeutet. Abgesehen von der ersten Woche der Tests nach der Genesung überqueren die Kontrolltiere die Leiter deutlich schneller als implantierte Tiere.

Die implantierten Tiere waren nicht in der Lage, die Leiterüberquerungsgeschwindigkeit vor der Operation aufrechtzuerhalten, was auf mögliche Defizite in der Feinmotorik hinweist. Dies wird auch durch das vermehrte Auftreten von Ausrutschern der rechten Pfote bei implantierten Tieren unterstützt, die mit der Region des Gehirns korrelieren, die ein Implantat erhält. Kontrolltiere erzielten im Verlauf der Studie oft signifikant höhere Grifffestigkeitsergebnisse im Vergleich zu implantierten Tieren.

Darüber hinaus schnitten implantierte Tiere unmittelbar nach der Genesung signifikant schlechter ab als der Ausgangswert, verbesserten sich jedoch im Laufe der Zeit und kehrten zur Ausgangsleistung zurück. Hier ist die Korrelation zwischen der Leistung der Leiter und der Immunglobulin-G-Fluoreszenzintensität dargestellt, einem Marker für die Permeabilität der Blut-Hirn-Schranke. Es wurde ein Korrelationskoeffizient von 0,901 gefunden, was auf eine sehr starke Korrelation hinweist.

Sobald diese Technik beherrscht ist, kann sie in etwa 30 Minuten pro Tier und Versuchssitzung durchgeführt werden. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, Umweltvariablen zu reduzieren, da diese die Tiere von der anstehenden Aufgabe ablenken können. Im Anschluss an dieses Verfahren können andere Methoden, einschließlich Immunhistochemie oder andere lichtbildgebende Verfahren, durchgeführt werden, um die Reaktion von Zellen oder Geweben auf implantierte Mikroelektronik zu untersuchen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie einen schnellen, einfachen und wiederholbaren Assay für grob- und feinmotorische Defizite durchführen können, die durch eine Geräteimplantation oder Verletzungen im primären motorischen Kortex entstehen können.