In Situ Messung und Korrelation der Zelldichte und Lichtemission von Biolumineszenten Bakterien

Diese Methode kann helfen, wichtige Fragen im Bereich der Biolumineszenz zu beantworten. Zum Beispiel die Suche nach optimalen Wachstumsbedingungen für die maximale Lichtintensität von biolumineszierenden Bakterien und die Bestimmung des Regulationsmechanismus. Der Hauptvorteil dieser Technik ist die einfache Einrichtung, die für verschiedene Stämme und Organismen verwendet werden kann, sowie die einfachen und schnellen Einstellmöglichkeiten.

Die Befolgung dieser Methode kann Aufschluss über die Eigenschaften des Lux-Operons geben. Es kann auch auf andere Systeme angewendet werden, z. B. auf Bakterien-, Umwelt-, Berichtssysteme oder Sensoren. Bereiten Sie zunächst eine Übernachtkultur vor, indem Sie 100 Milliliter LB-Medium mit Kanamycin, mit Lux-Operon-transformierten E.coli BL21-Zellen aus Glycerinstamm oder direkt von einer Transformationsplatte inokulieren.

Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 120 U/min über Nacht. Am nächsten Tag impfen Sie 800 Milliliter LB-Kanamycin-Medium mit 8 Millilitern der Nachtkultur. Inkubieren Sie die Kultur bei 37 Grad Celsius und 120 U/min in einem Inkubatorschüttler, bis die Zelldichte einen OD600 von 0,6 bis 0,8 erreicht.

Reduzieren Sie die Inkubationstemperatur auf 28 Grad Celsius und induzieren Sie die Proteinexpression durch Zugabe von 0,1 Millimolar IPTG. Beobachten Sie dann die Zellen, bis sie zu glänzen beginnen. Nach der Aufbereitung des Mediums gemäß dem Textprotokoll werden die bakteriellen biolumineszierenden Stämme auf Agarplatten mit künstlichem Meerwassermedium gestreift und über Nacht bei 24 bis 30 Grad Celsius inkubiert.

Bereiten Sie eine Übernachtkultur vor, indem Sie 100 Milliliter künstliches Meerwassermedium mit einer einzigen Kolonie von der Platte beimpfen. Dann wird die Kultur über Nacht bei 24 bis 30 Grad Celsius und 120 U/min inkubiert. Am nächsten Tag beimpfen Sie 800 Milliliter künstliches Meerwassermedium mit 8 Millilitern Übernachtkultur.

Inkubieren Sie die Bakterienzellen bei 24 bis 30 Grad Celsius und 120 U/min und beobachten Sie die Zellen, bis sie zu glänzen beginnen. Streichen Sie den gewünschten biolumineszierenden Bakterienstamm oder modifizierten E.coli-Stamm auf eine Agarplatte und inkubieren Sie die Kultur über Nacht bei 28 Grad Celsius. Beimpfen Sie 3 Milliliter Medium mit einer einzigen Kolonie von der Nachtplatte und inkubieren Sie die Zellen bei 28 Grad Celsius und 180 U/min für etwa ein bis zwei Stunden.

Messen Sie die Zelldichte einer Verdünnung der Flüssigkultur von eins bis zehn bei 650 Nanometern. Berechnen Sie dann das Verhältnis und das Volumen für einen Milliliter Kultur mit einem OD650 von 0,05. Pipettieren Sie das berechnete Volumen der Kultur und des Mediums in eine 24-Well-Platte mit schwarzen Wandwänden und Glasboden.

Um sicherzustellen, dass der pET28a-Vektor, der das gesamte Lux-Operon enthält und im modifizierten E.coli-Stamm exprimiert wird, nicht verloren geht, fügen Sie den Proben einen Mikroliter Kanamycin und einen Mikroliter IPTG hinzu. Legen Sie dann einen Deckel auf die Platte, um eine Verdunstung während der Messungen zu vermeiden. Verwenden Sie schließlich einen auf 28 Grad Celsius eingestellten Plattenleser und ein Skript im Textprotokoll, um alle 10 Minuten Absorptions- und Biolumineszenzmessungen durchzuführen, wobei zwischen den Datenpunkten Verwacklungen auftreten.

Diese Abbildung vergleicht OD650-Messungen von E.coli BL21-Zellen, BL21-Zellen mit einem leeren pET28a-Vektor und BL21-Zellen mit einem pET28a-Vektor mit dem Lux-Rib-Operon-Insert, jedoch ohne Induktion. Alle drei Referenzmessungen für die Lichtemission zeigen eine sigmoidale Wachstumskurve mit verzögerten, exponentiellen und stationären Wachstumsphasen, aber keine Lichtemission, mit Ausnahme der letztgenannten Probe, die aufgrund einer Leckage des T7-Promotors nach 300 Minuten eine Lichtemission zeigt. Hier wurden die Wachstumskurven und Lichtintensitäten des in E. coli exprimierten Lux-Operons und des biolumineszierenden Bakterienstamms Photobacterium mandapamensis 27561 bei 28 Grad Celsius in LB oder künstlichem Meerwassermedium verglichen.

Der modifizierte E.coli-Stamm und P.mandapamensis wachsen sowohl in künstlichem Meerwassermedium als auch in LB-Medium und zeigen beide eine Lichtemission. Aber im LB-Medium emittiert P.Mandapamensis überhaupt kein Licht. Bemerkenswert ist, dass der modifizierte E.coli-Stamm eine höhere maximale Lichtintensität aufweist als die biolumineszierenden Bakterien.

In diesem Experiment wurde die Genexpression des auf E.coli basierenden Lux-Rib-Operons über 24 Stunden gemessen, um seine Langlebigkeit zu analysieren. Die Lichtemission dauerte 19 1/2 Stunden, viel länger als bei den Bakterienstämmen, bei denen eine allmähliche Abnahme beobachtet wurde, was zu einer sehr geringen Lichtemission nach 10 Stunden führte. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Biolumineszenz, um Lux-Operone in Modellorganismen wie E.Coli zu erforschen.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie man mit biolumineszierenden Bakterien arbeitet.