Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay
August 26th, 2018
Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des alternativen Prä-mRNA-Spleißens zu beantworten. Insbesondere bietet es ein robustes, sensitives Assay-System, um alternative Spleißmuster in situ in Gewebeschnitten zu untersuchen. Mit dieser Methode kann alternatives Spleißen gleichzeitig in vielen Subtypen analysiert werden, die in komplexen biologischen Strukturen wie einem Mäusegehirn enthalten sind.
Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schockantistatische Exon-Übergangssonden bei der mRNA-in-situ-Hybridisierung verwendet, um isoformspezifische Hybridisierungssignale zu erzeugen. Die Gebäudesignalverstärkungstechnologie erhöht die Empfindlichkeit der Detektion, um robuste Hybridisierungssignale bereitzustellen. Bei den detektierten Signalen handelte es sich um Exon-Einschluss, die aus spezifischen Sonden entwichen, die zur Berechnung des prozentualen Spleißens in den Vitalwerten in verschiedenen anatomischen Bereichen eines Mäusegehirns verwendet werden.
In dieser Arbeit wird das NF1-Exon 23a als Beispiel verwendet, um den Einsatz des Assay-Systems zu veranschaulichen. Das System kann jedoch angepasst werden, um Expressionsmuster vieler alternativer Exons zu analysieren. Um die Paraffinisierung des Mausgehirns in Abschnitt D zu starten, füllen Sie zwei Spülgeschirr mit 250 Millilitern Xylol.
Und zwei weitere mit 250 Millilitern 100%igem Ethanol in einem Abzug. Legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer. Stellen Sie dann den Wäscheständer in eine Xylol-haltige Schale und inkubieren Sie ihn fünf Minuten lang, während Sie den Rost mindestens dreimal auf und ab bewegen, und wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Xylolschale.
Stellen Sie dann das Gestell in eine ethanolhaltige Schale und inkubieren Sie es zwei Minuten lang mit den gleichen Auf- und Abbewegungen und wiederholen Sie dann mit der zweiten Ethanolschale. Um die Objektträger zu trocknen, nehmen Sie das Gestell aus der zweiten Ethanolschale und legen Sie es für fünf Minuten in einen Inkubator bei 60 Grad Celsius. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine 0,75 Zoll x 0,75 Zoll große Barriere um den Gewebeschnitt und trocknen Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.
Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie die Temperatur auf 40 Grad Celsius ein. Nachdem Sie das Befeuchtungspapier vollständig mit destilliertem Wasser benetzt haben, legen Sie es in eine Feuchtigkeitskontrollschale. Setzen Sie dann die Feuchtigkeitskontrollschale in den Hybridisierungsofen ein.
Nachdem Sie die getrockneten Objektträger auf eine Bank gelegt haben, bedecken Sie die Gewebeschnitte auf jedem Objektträger vollständig mit fünf bis acht Tropfen Wasserstoffperoxidlösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Klopfen Sie die Objektträger nacheinander auf ein saugfähiges Papier, um die Wasserstoffperoxidlösung zu entfernen, und legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer.
Tauchen Sie das Gestell in eine Spülschüssel mit Wasser, während Sie es drei- bis fünfmal auf und ab bewegen, um die Objektträger zu waschen. Füllen Sie einen Ein-Liter-Glasbecher, der auf einer heißen Platte steht, mit 700 Millilitern 1X Target-Removal-Behandlung und decken Sie ihn mit Folie ab. Führen Sie ein Thermometer durch die Folienabdeckung und schalten Sie die Heizplatte ein, die 10 bis 15 Minuten lang auf hohe Temperatur eingestellt ist.
Sobald die Temperatur des Entnahmereagenzes 98 Grad Celsius erreicht, stellen Sie die Heizplatte auf niedrige Temperatur, um einen milden Siedezustand aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie dann vorsichtig die Folie und legen Sie das Gestell in das Becherglas. Den Becher mit Folie abdecken und 15 Minuten inkubieren.
Schieben Sie das Gestell mit einer Pinzette aus dem Becherglas in eine Spülschüssel mit 200 Millilitern destilliertem Wasser und inkubieren Sie es 15 Sekunden lang. Legen Sie das Gestell nach 15 Sekunden in eine Waschschüssel mit 100 % Ethanol und inkubieren Sie es drei Minuten lang. Den Rost aus der Form nehmen und bei 60 Grad Celsius 10 Minuten trocknen.
Nachdem Sie die Objektträger auf ein Fleckengestell gelegt haben, bedecken Sie die Gewebeschnitte mit fünf Tropfen Protease 3 pro Objektträger. Legen Sie den Rost vorsichtig in die Feuchtigkeitskontrollschale, setzen Sie die Schale in den Hybridisierungsofen ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Nachdem Sie das Gestell aus dem Tablett genommen haben, klopfen Sie auf die Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie in einen Waschständer.
Stellen Sie den Rost in eine Spülschüssel mit destilliertem Wasser und bewegen Sie den Rost drei- bis fünfmal auf und ab, um die Objektträger zu waschen. Zur Vorbereitung der In-situ-Hybridisierung inkubieren Sie die Sonden und AMP-Reagenzien 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale in den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie sie auf 40 Grad Celsius ein.
Für die Sondenhybridisierung nehmen Sie die Objektträger vom Waschgestell und klopfen Sie darauf, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Objektträger auf ein Fleckengestell. Verwenden Sie einen Bleistift, um die Folien mit dem Namen des Prüfpunkts zu beschriften.
Platzieren Sie drei nebeneinander geschnittene Hirngewebeobjektträger, die mit drei verschiedenen Nervenfaser-Mitose-Typ-1-Sonden hybridisiert werden sollen. Da es sehr unterschiedliche isoformspezifische Sonden gibt, verwende ich nebeneinander geschnittene Gewebeschnitte. Es ist wichtig, dass diese Abschnitte in den Hybridisierungs-, Amplifikations- und Signaldetektionsschritten genau gleich behandelt werden, um die Genauigkeit des prozentualen Spleißes bei der Berechnung zu gewährleisten.
Decken Sie die Gewebeschnitte mit vier Tropfen Sonde pro Schnitt ab, jeweils einen Objektträger, um ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern. Legen Sie dann den Fleckenrost in die Feuchtigkeitskontrollschale und legen Sie ihn für zwei Stunden in den 40 Grad Celsius heißen Ofen. Stellen Sie anschließend einen Wäscheständer in eine Waschschüssel, die mit 200 Millilitern 1X Waschpuffer gefüllt ist.
Tippen Sie dann nacheinander auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Und stecken Sie sofort jede Folie in den Wäscheständer. Inkubieren Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in einer mit frischem Waschpuffer gefüllten Schale, während Sie den Rost drei- bis fünfmal auf und ab bewegen, und wiederholen Sie dann den Waschgang in einer neuen Schale.
Um das Signal zu verstärken, klopfen Sie auf jeden Objektträger, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, und legen Sie ihn auf ein Fleckengestell. Decken Sie den Gewebeabschnitt auf jedem Objektträger mit vier Tropfen AMP Null-Reagenz ab. Legen Sie dann den Rost in die Feuchtigkeitskontrollschale, setzen Sie die Schale in den Ofen ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.
Waschen Sie den Objektträger zweimal mit Waschpuffer, wie zuvor in diesem Experiment. Wiederholen Sie den Signalverstärkungsschritt mit den AMP-Reagenzien eins bis sechs, wie im Textprotokoll beschrieben, und waschen Sie die Objektträger nach jedem Schritt. Zur Signalerkennung entfernen Sie überschüssigen Waschpuffer durch Klopfen von den Objektträgern und legen Sie sie auf ein Fleckengestell.
Mischen Sie anschließend zwei Mikroliter Fast Red B mit 120 Mikrolitern Fast Red A in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie die Lösung zu den Gewebeabschnitten auf jedem Objektträger, um sie vollständig zu bedecken. Stellen Sie den Fleckenkorb in die Feuchtigkeitskontrollschale, decken Sie die Schale ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.
Entfernen Sie dann die Lösung und legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer. Legen Sie das Gestell in eine Spülschüssel mit Leitungswasser, um die Objektträger zu waschen, und wiederholen Sie den Waschvorgang. Klopfen Sie nach dem zweiten Waschen auf ein saugfähiges Papier, um überschüssiges Wasser zu entfernen.
Stellen Sie dann das Gestell in eine Schüssel mit 50 % Hämatoxylin-Färbelösung. Bewegen Sie das Gestell mehrmals auf und ab. Und zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.
Schieben Sie den Rost in eine Spülschüssel mit Leitungswasser. Bewegen Sie das Gestell fünfmal auf und ab und wiederholen Sie die Wäsche, bis die Objektträger klar werden, während die Gewebeschnitte violett bleiben. Schieben Sie dann den Rost in eine Schüssel mit 0,02 % Ammoniakwasser.
Bewegen Sie das Gestell zwei- bis viermal auf und ab, bis die Abschnitte blau werden. Waschen Sie die Objektträger drei- bis fünfmal mit Leitungswasser in der Färbeschale. Stellen Sie dann das Gestell in einen Inkubator und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius, um die Objektträger zu trocknen.
Wenn es vollständig trocken ist, geben Sie einen Tropfen Einbettmittel auf jede Folie, um die Scheibe zu bedecken. Legen Sie dann vorsichtig ein 24 x 50 Millimeter großes Deckglas über die Gewebeschnitte auf jedem Objektträger. Nachdem Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet haben, fahren Sie mit der Datenerfassung fort.
Zur Berechnung des prozentualen Spleißens oder des PSI-Werts für Exon 23a wird die Anzahl der Zellen und Punkte in drei Unterregionen des Kortex und des Hippocampus CA3 gezählt. Der RNA-in-situ-Hybridisierungsassay wird in Gehirnschnitten von CD1-Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von drei verschiedenen NF1-spezifischen Sonden durchgeführt. Rote punktförmige Punkte, die in den Abschnitten Kortex und Hippocampus beobachtet wurden, zeigen positive Signale von NF1-Gesamt-, Inklusions- und Skipping-spezifischen Sonden an.
Die ISH-Signale der drei Sonden werden dann gezählt und zur Berechnung des PSI verwendet. Der RNA-in-situ-Hybridisierungsassay wird im Kortex von C57 schwarzen 6J-Wildtyp-Mäusen und C57 schwarzen 6J-mutierten Mäusen durchgeführt, wobei Exon 23a in allen Zelltypen enthalten ist. Rote punktförmige Punkte, die in der Hirnrinde von C57-Mäusen mit schwarzem 6J-Wildtyp beobachtet wurden, deuten auf positive Signale von NF1-Gesamt-, Einschluss- und Überspringen-spezifischen Sonden hin
.In C57-schwarzen 6J-mutierten Mäusen werden ähnliche Signale durch NF1-Gesamt- und Einschluss-spezifische Sonden erhalten. Bei der Verwendung einer spezifischen Sonde mit Überspringen wird jedoch kein Signal erkannt, was darauf hinweist, dass zwei Sonden, die auf den Exon-Einschluss oder das Überspringen abzielen, hochspezifisch sind. Da für dieses Verfahren noch keine mehrfarbige Markierung auf denselben Gewebeobjektträgern verfügbar ist, werden auf den verschiedenen Gewebeobjektträgern unterschiedliche Sonden verwendet.
Um die genauen prozentualen Spleißwerte zu erhalten, ist es wichtig, nebeneinander geschnittene Objektträger zu verwenden und die Objektträger während dieses Verfahrens auf genau die gleiche Weise zu behandeln. Ergänzend zu diesem Verfahren können Messungen wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Lokalisation und Funktion differentiell exprimierter Spleißisoformen zu beantworten.
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Übersicht
Dieser Artikel beschreibt ein in situ Hybridisierungsprotokoll (ISH) unter Verwendung kurzer Antisense-Oligonucleotide zum Nachweis alternativer pre-mRNA-Spleißmuster in Mausgehirnschnitten. Diese Methode ermöglicht die simultane Analyse von Spleißmustern in verschiedenen Subtypen innerhalb komplexer biologischer Strukturen.
Wichtige Studienkomponenten
Wissenschaftsbereich
- Neurowissenschaften
- Genetik
- Molekularbiologie
Hintergrund
- Alternatives pre-mRNA-Spleißen ist entscheidend für die Erzeugung von Proteinvielfalt.
- Das Verständnis von Spleißmustern kann Einblicke in die Gehirnfunktion und -störungen geben.
- In situ Hybridisierungstechniken sind wesentlich für das Studium des Spleißens in Gewebekontexten.
- Diese Studie konzentriert sich auf Mausgehirnschnitte, um Spleißvariationen zu erforschen.
Zweck der Studie
- Entwicklung eines empfindlichen Assays zum Nachweis alternativen Spleißens in situ.
- Analyse von Spleißmustern in verschiedenen Hirnregionen.
- Verbesserung des Verständnisses von Spleißmechanismen im Gehirn.
Verwendete Methoden
- In situ Hybridisierung unter Verwendung kurzer Antisense-Oligonucleotide.
- Schock-Anti-Statik-Exon-Junction-Sonden für isoformenspezifische Signale.
- Signalverstärkungstechnologie zur Erhöhung der Nachweisempfindlichkeit.
- Analyse der Exon-Einschluss- und Spleißprozentsätze in verschiedenen anatomischen Bereichen.
Hauptergebnisse
- Robuste Hybridisierungssignale wurden mit der entwickelten Methode erzielt.
- Alternative Spleißmuster wurden erfolgreich in Mausgehirnschnitten nachgewiesen.
- Die Technik ermöglicht die simultane Analyse mehrerer Spleißereignisse.
- Die Ergebnisse tragen zum Verständnis der Komplexität des Spleißens in neuronalen Geweben bei.
Schlussfolgerungen
- Das ISH-Protokoll bietet ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung alternativen Spleißens.
- Die Ergebnisse erweitern das Wissen über Spleißmechanismen im Gehirn.
- Diese Methode kann weitere Forschung zu Spleiß-bezogenen neurologischen Erkrankungen erleichtern.
Häufig gestellte Fragen
Executive Industry Relevance
This method enables spatially resolved quantification of alternative splicing events in complex tissues, addressing a critical gap in target validation where bulk RNA approaches mask cellular heterogeneity. By providing isoform-specific signals at single-cell resolution in anatomically defined brain regions, it supports mechanistic de-risking of splicing-dependent targets in neuroscience drug discovery. The ability to calculate percent spliced in (PSI) values from exon inclusion and skipping signals offers a quantitative, reproducible metric for assessing target engagement and pathway modulation in preclinical models.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by linking specific splice isoforms to cell-type-specific expression patterns in disease-relevant brain regions.
- Operational Value: Provides a robust, sensitive assay system for examining alternative splicing patterns in situ within tissue slices, reducing reliance on dissociated cell models that lose spatial context.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Uses shock anti-static exon junction probes to generate isoform-specific hybridization signals, enabling simultaneous analysis of multiple subtypes within complex biological structures.
- Operational Value: Signal amplification technology increases detection sensitivity, producing robust signals suitable for quantitative imaging and automated analysis workflows.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Facilitates disease-relevant system analysis by mapping splicing patterns across anatomical areas such as cortex and hippocampus, supporting biomarker discovery for neuropsychiatric indications.
- Operational Value: Enables parallel processing of adjacently cut tissue sections under identical conditions, ensuring data accuracy for cross-sectional comparisons in preclinical studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase, where spatially resolved splicing data informs target selection and mechanistic understanding before assay development for high-throughput screening.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by revealing cell-type-specific alternative splicing patterns that may be obscured in bulk tissue analyses.
- Screening: Generates quantitative, spatially resolved readouts (e.g., PSI values) that can inform assay design for splicing-modulating compounds.
- Analytics: Enables calculation of percent spliced in from exon inclusion and skipping signal counts, providing a normalized metric for comparing conditions across brain regions.
- Translational Research: Connects discovery findings to preclinical continuity by validating splicing changes in anatomically defined regions relevant to disease models.
- Enterprise Reuse: The probe-based approach is adaptable to multiple alternative exons, positioning it as a reusable platform for splicing analysis across diverse targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity by linking specific splice isoforms to defined anatomical locations, increasing confidence in target-disease relationships.
- Operational Value: Standardized protocol with built-in controls (e.g., adjacently cut slides, identical processing) enhances reproducibility across sites and users.
- Strategic Value: Supports better go/no-go decisions by providing spatially resolved efficacy and mechanism data early in the discovery pipeline.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of targets based on validated splicing expression in disease-relevant neural circuits.
Implementation Considerations
- Requires expertise in RNA in situ hybridization, tissue sectioning, and quantitative image analysis for punctate dot counting.
- Dependent on hybridization ovens, humidity control trays, and reagent systems for probe hybridization, signal amplification, and detection (e.g., Fast Red).
- Necessitates standardization across teams for slide preparation, probe incubation, and washing steps to ensure comparability of PSI calculations.
- Adaptation to new exons requires design and validation of exon junction-specific probes, with sensitivity to target sequence accessibility.
- Practical limitation: Multi-color labeling is not currently available, requiring sequential analysis on separate slides, which increases tissue sectioning and processing demands.
