Name: Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 22 s
Description: Erfahren Sie die quantitative Analyse alternativer Pre-mRNA-Spleißmuster in Maus-Hirnschnitten mit RNA-In-Situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion verschiedener Spleißvarianten in komplexen neuronalen Strukturen.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Diese Arbeit wurde unterstützt von der American Heart Association [Beihilfe 0365274B H.L], National Cancer Institute [GI SPORE P50CA150964, Z.W.], National Institutes of Health [Büro der Forschung Infrastruktur gemeinsam Instrumentierung Grant S10RR031845, die Lichtmikroskopie Imaging-Anlage an der Case Western Reserve University], und China Scholarship Council [zu X.G.]. Die Autoren danken Richard Lee in Light Microscopy Imaging Core für seine Hilfe mit Dia scannen.

Alle hier beschriebenen Experimente, bei denen Mäuse wurden von der Case Western Reserve University institutionelle Animal Care und Use Committee genehmigt. Der Titel des Protokolls 2016-0068 (PI: Hua Lou) ist "Role of alternative Pre-mRNA Spleißen in vertebrate Entwicklung".
Hinweis: Informationen aller Ausrüstung, Reagenzien und Verbrauchsmaterialien, die in diesem Protokoll verwendeten sind in Tabelle der Materialienenthalten.
1. bereiten Sie Formalin feste Paraffin eingebettet (FFPE) Abschnitte
<ol><li>
1 CD1-Maus und 1 C57BL/6J Maus durch zervikale Dislokation einschläfern. Schneiden Sie vorsichtig auf, den Schädel mit chirurgische Scheren und Pinzetten. Das Gehirn mit einer Schaufel zu entfernen. Hinweis: 5-Monate-alten CD1 männliche Mäuse und 3-Monate-alten C57BL/6J männliche Mäuse wurden eingesetzt und zeigten ähnliche Ergebnisse.<ol>
<li>Waschen Sie das Gehirn mit PBS. Befestigen Sie das ganze Gehirn mit einer Lösung, die 10 % Formalin bei Raumtemperatur (RT) für 30 h indem man das ganze Gehirn in 50 mL Formalin-Lösung.</li>
		<li>Ändern Sie die festlegunglösung auf PBS und inkubieren das Gehirn mit PBS-Puffer über Nacht bei 4 ° c Entwässern und das Gehirn mit Xylol und Paraffin mit Standardverfahren18einbetten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Verwenden Sie ein Mikrotom, um eingebettete Gewebe 5 µm Ablängen. Setzen Sie das Paraffin-Band in eine RT-Wasserbad, zuerst, und dann im Wasserbad 45 ° C, die Multifunktionsleiste zu verbreiten.
	<ol>
<li>Wenn die Runzeln und Falten in der Multifunktionsleiste verschwinden, sofort montieren Sie Abschnitte auf Glasobjektträger. Luft trockenere Folien über Nacht bei RT Bake Folien für 1 h bei 60 ° C vor dem Gebrauch.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Beispiel-Vorbehandlung
<ol><li>
Deparaffinize Gewebeschnitten. Führen Sie diese Schritte in einer Dampfhaube.
	<ol>
<li>Füllen Sie zwei abwaschen (Abbildung 1A) mit 250 mL frischem Xylol und zwei mit 250 mL 100 % Ethanol. Einfügen von Gewebe Folien in einer waschen Rack (Abbildung 1A) und das Waschen rack in abwaschen, die nach der Bestellung und Inkubation Zeit in Tabelle 1angegeben.</li>
		<li>Während jeder Inkubation heben Sie waschen Rack rauf und runter mehr als 3 Mal in der Wasch-Schale. Nach jeder Inkubation bewegen sich schnell waschen Rack in die nächsten waschen Schüssel die Gewebeschnitte vor dem Austrocknen zu verhindern.</li>
		<li>Entfernen Sie nach Abschluss der inkubationsschritte waschen Rack mit Folien aus der Schale waschen. Platzieren Sie die Zahnstange in einem Inkubator von 60 ° C für 5 Minuten oder bis die Folien vollständig trocken sind.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Zeichnen Sie eine 0,75 '' x 0,75 '' Barriere rund um den Gewebe-Abschnitt mit einem Stift hydrophobe Barriere. Luft trocknen die Barriere für 3 min bei RT</li>
	<li>
Vorbehandeln Scheiben
	<ol>
<li>Reagenzien und Geräte vorbereiten<ol>
<li>Einschalten der Hybridisierung Ofen (Abbildung 1 b) und Temperatur auf 40 ° C 30 min vor Gebrauch.</li>
			<li>Die befeuchtenden Papier (Abbildung 1E) mit destilliertem Wasser komplett nass und steckte es in Feuchtigkeit Kontrolle Tablett (Abbildung 1, Links). Halten Sie Feuchtigkeit Kontrolle Fach in der Hybridisierung-Ofen.</li>
			<li>Bereiten Sie 700 mL frische 1 X Target Retrieval Reagenzien durch Zugabe von 630 mL dH2O bis 70 mL 10 X Target Retrieval Reagenzien vor.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Anwendung von Wasserstoffperoxid.<ol>
<li>Setzen Sie die deparaffinized Rutschen auf der Bank. Fügen Sie 5 – 8 Tropfen Wasserstoffperoxid zu einem Abschnitt auf das Gewebe vollständig zu bedecken. 10 min bei RT inkubieren</li>
			<li>Tippen Sie auf die Folien auf einem Stück Küchenpapier, Wasserstoffperoxid-Lösung, eine Folie zu einem Zeitpunkt zu entfernen. Sofort legen Sie die Folie einbauen möchten waschen und nach ein waschen Schale gefüllt mit dH2O. rack</li>
			<li>Waschen Sie die Folien durch Verschieben der Zahnstange rauf und runter in destilliertem Wasser für 3 – 5 Mal. Ein waschen Schale gefüllt mit frischem destilliertem Wasser und waschen Folien noch einmal waschen Rack ans.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Führen Sie Ziel abrufen<ol>
<li>Legen Sie eine 1.000 mL-Becherglas auf einer heißen Platte. Fügen Sie 700 mL frische 1 X Target Retrieval Reagenzien in das Becherglas und mit Folie abdecken. Legen Sie einen Thermometer in den Becher durch die Folienabdeckung (Abbildung 1). Schalten Sie die Heizplatte und hoch für 10 – 15 Minuten angesetzt.</li>
			<li>Wenn die Temperatur der Abruf Reagenzien 98 ° C erreicht hat, wechseln Sie die Temperaturregelung der Heizplatte von hoch zu niedrig um milde Kochen zu halten. Nicht kochen Sie mehr als 15 min.</li>
			<li>Unterdessen sorgfältig öffnen Sie die Folie und legen Sie das Waschen Rack mit Scheiben im Inneren der Abruf Regent. Das Becherglas wieder abdecken und 15 min inkubieren.</li>
			<li>Verwendung Zange Rack aus den Becher auf einen Teller waschen entfernen gefüllt mit 200 mL dH2O und spülen für 15 s.</li>
			<li>Verschieben der Zahnstange in eine Wasch-Schale mit 100 % frischem Ethanol und für 3 min. Folien entfernen und trocknen Sie sie in einem 60 ° C Inkubator für 10 min. stehen lassen.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Protease III gelten<ol>
<li>Legen Sie die Folien auf den Fleck Rost (Abbildung 1, rechts). Tropfen Sie 5 Protease III um das Gewebe zu decken. Vorsichtig legen Sie die Zahnstange in die Luftfeuchtigkeit Kontrolle Schublade (Abbildung 1, Links) und setzen Sie die Schale in den Ofen 40 ° C Hybridisierung. 30 min inkubieren.</li>
			<li>Entfernen Sie die Folie Rack und stellte das Tablett wieder in den Ofen. Tippen Sie auf die Folien, um die überschüssige Flüssigkeit, eine Folie zu einem Zeitpunkt zu entfernen. Legen Sie die Folie in einem waschen Rack und Ort das Rack in einem waschen Schale voller dH2O. Move Rack rauf und runter, um die Folien für Waschen 3-5 Mal.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>(3) ISH Assay
<ol><li>
Bereiten Sie Materialien
	<ol>
<li>Wärmen Sie 50 x Waschpuffer in einem Inkubator 40 ° C für 20 min. Mix 2,94 L dH2O und 60 mL 50 x Waschpuffer, 1 x Waschpuffer zu machen vor.</li>
		<li>Bereiten Sie 50 % Hämatoxylin Färbelösung durch Zugabe von 100 mL Gills Hämatoxylin ich bis 100 mL dH2O. Prepare 0,02 % (w/V) Ammoniak Wasser durch Zugabe von 1,43 mL 1 N Ammonium Hydroxid, 250 mL von dH2O. Mix in einem Behälter gut vor.</li>
		<li>Setzen Sie die Sonden und AMP 0 – 6 Reagenzien bei RT 30 min vor Gebrauch. Halten Sie die Luftfeuchtigkeit Kontrolle Fach im 40 ° C Hybridisierung Ofen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
ISH-Verfahren Hinweis: Um die Expression von Nf1 Spleißen Isoformen prüfen und berechnen die Prozent (PSI) Wert für Exon 23a, drei verschiedene ISH-Sonden, die auf Exon 23a enthalten Isoform gespleißt sind, Exon 23a ausgeschlossen Isoform oder beide Isoformen verwendet (Abbildung 2 ). Die Sonden werden benachbart geschnittenen Gewebeschnitte verwendet. Um die Genauigkeit der Berechnung zu gewährleisten, ist es wichtig, dass die drei Gewebeschnitte behandelt werden genauso in der Hybridisierung, Verstärkung und Signal-Erkennung-Schritten.<ol>
<li>Sonde Hybridisierung.<ol>
<li>Entfernen Sie die Folien aus dem Waschen Rack und tippen Sie auf die überschüssige Flüssigkeit aus den Folien. Legen Sie die Folien in der Fleck-Rack.</li>
			<li>Benutzen Sie einen Bleistift, um die Folien mit der Sonde Namen zu beschriften. Setzen Sie die drei benachbart geschnittene Gehirn Gewebe Folien zusammen mit drei verschiedenen Nf1 Sonden (Abbildung 2) hybridisiert werden. Führen Sie die nachfolgenden Schritte in der gleichen Reihenfolge von Folien.</li>
			<li>4 Tropfen der Sonde um das Gewebe zu decken. Tun Sie diese eine Folie zu einem Zeitpunkt zu die Abschnitten Austrocknen verhindert wird. Legen Sie die Fleck-Rack in der Feuchtigkeit Kontrolle Fach und fügen Sie es in den 40 ° C Backofen für 2 h.</li>
			<li>Waschen Sie die Objektträger zweimal mit Waschpuffer. Füllen Sie für jedes waschen die Färbung Schüssel mit 200 mL 1 x Waschpuffer und platzieren Sie Regales waschen drin. Tippen Sie auf überschüssige Flüssigkeit auf ein Papier Handtuch eine Folie gleichzeitig und einfügen Sie schnell waschen Rack. Bewegen der Folie Rack rauf und runter in die Schüssel für 3 – 5 Mal für 2 min bei RT</li>
			<li>Verwenden Sie für die zweite Wäsche frisch Waschpuffer.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Signalverstärkung.<ol>
<li>Tippen Sie auf die überschüssigen Waschpuffer von Folien und legen Sie sie in das Fleck-Rack. Tropfen Sie 4 AMP 0 um das Gewebe zu decken. Legen Sie die Fleck-Rack in der Feuchtigkeit Kontrolle Fach und legen Sie sie in den Ofen für 30 min. bei 40 ° C.</li>
			<li>Waschen Sie die Folien zweimal mit Waschpuffer wie oben beschrieben.</li>
			<li>Wiederholen Sie diesen Schritt mit AMP 1 – 6 Anschluss an die Bestellung und den Zustand der Tabelle 2. Waschen Sie die Folien zweimal nach jedem Schritt Hybridisierung.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Signalerkennung<ol>
<li>Tippen Sie auf die überschüssigen Waschpuffer von den Folien und legen Sie sie in Fleck Rack. Fast Red 120 µL 2 µL schnell rot B hinzufügen (Verhältnis 1: 60) in einem Microcentrifuge Schlauch. Mischen Sie gut und um Abschnitt Gewebe vollständig zu decken. Hinweis: Das Gesamtvolumen der roten A / B Mix basiert auf der Anzahl und Größe der Gewebeschnitte. Für einen 0,75 '' x 0,75 '' reicht 120 µL für einen Abschnitt. Verwenden Sie die Mischung innerhalb von 5 min und direktem Sonnenlicht oder UV-Licht meiden Sie der Mischung.</li>
			<li>Schließen Sie das Fach und inkubieren Sie für 10 min bei RT. entfernen Sie die Lösung für einen Abfallcontainer und sofort waschen Rack einfügen Sie die Folien und platzieren Sie die Zahnstange in einer Wasch-Schale mit Leitungswasser gefüllt. Wieder mit frischem Leitungswasser abspülen.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Gegenfärbung der Folien
	<ol>
<li>Entfernen Sie das Waschen Rack aus Leitungswasser und schnell tippen auf saugfähigem Papier, extra Wasser zu entfernen. Das Rack in einem 50 % Hämatoxylin Färbelösung und sofort bewegen Sie das Gestell nach oben und unten mehrmals. 2 min bei RT inkubieren</li>
		<li>Überweisen Sie Folie-Rack zurück auf das Leitungswasser Gericht. Waschen Sie 3 – 5 Mal durch das Rack rauf und runter bewegen und frisches Leitungswasser zu wechseln, bis die Folien deutlich werden, während das Hirngewebe lila bleiben.</li>
		<li>Bewegen Sie das Rack, eine Schale mit 0,02 % Ammoniakwasser. Das Rack hoch und runter bewegen Sie 2 – 3 Mal bis das Gewebe blau leuchten. Waschen Sie die Objektträger 3 – 5 Mal mit frischem Leitungswasser in einer Färbung Schale.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Montage der Proben
	<ol>
<li>Verschieben der Folie-Rack aus der Färbung Schale in einem 60 ° C Inkubator und mindestens 15 min inkubieren, bis die Folien vollständig trocken sind.</li>
		<li>40 µL Eindeckmedium auf der Folie und legen Sie ein 24 mm x 50 mm-Deckglas vorsichtig über Abschnitt Gewebe. Luft trocken Folien für 30 min bei RT</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Datenerhebung und-Analyse
Hinweis: Verwenden Sie einen Diascanner zum Scannen von Bildern bei 40 X Vergrößerung.
<ol><li>
Positive und negative Kontrollen
	<ol>
<li>Für jedes Experiment sind positive und negative Kontrollen (Abbildung 3). Als eine gute positive Kontrolle sollte Signal als punktförmige Punkte bei 20-40 X Vergrößerung sichtbar sein.</li>
		<li>Verwendung der Maus (Mm) - PPIB - 1ZZ als Positivkontrolle. Diese Sonde zielt auf einen gemeinsamen Haushalt gen PPIB. Für negative Kontrolle geht einen Punkt für jeden 20 Zellen mit Hintergrund Färbung pro 20 X Mikroskop-Feld angezeigt.</li>
		<li>Verwenden Sie die DapB-1ZZ Sonde als Negativkontrolle. Diese Sonde zielt auf die bakterielle gen DapB. Diese Kontrolle Sonden wurden in vielen ISH Assays19verwendet.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Signalerkennung und Analyse von als Expressionsmuster von Nf1 Exon 23a
	<ol>
<li>Zählen Sie die Hybridisierung Signale als punktförmige Punkte angegeben sind, die Punkte manuell. Die Anzahl der Punkte korreliert mit dem Niveau der Abschriften, die von einer speziellen Sonde erkannt wird. Beachten Sie, dass die Anzahl der Punkte auch mit ImageJ oder SpotStudio Software analysiert werden kann.</li>
		<li>Verwenden Sie drei Sonden um zu hybridisieren Exon 23a-haltigen, Exon 23a fehlt Isoformen oder total Nf1 Transkripte (Abbildung 2). Da die drei Sonden gleichzeitig verwendet werden können, verwenden Sie drei angrenzende Gehirn Gewebeschnitte für jede Sonde hybridisieren.<ol>
<li>Um Prozent gespleißt in (PSI) für Exon 23a zu berechnen, die Anzahl der Zellen und Punkte in verschiedenen Hirnregionen. Zählen Sie für jede Region von Interesse mehr als 400 Zellen aus mehreren Sub-Regionen wie in Abbildung 4dargestellt.</li>
			<li>Sammeln von Daten aus den gleichen Subregionen für jede der drei Sonden. PSI als Anzahl der Punkte pro Zelle zu berechnen, mit der Exon 23a Aufnahme Sonde / (Anzahl der Punkte pro Zelle mit dem Exon 23a Aufnahme Sonde + Anzahl der Punkt pro Zelle mit der exon23a Sonde überspringen) x 100 %.</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Wang, E. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+isoform+regulation+in+human+tissue+transcriptomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Alternative isoform regulation in human tissue transcriptomes.</a> Nature. 456, 470-476 (2008).</li>
<li>Pan, Q., Shai, O., Lee, L. J., Frey, B. J., Blencowe, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+surveying+of+alternative+splicing+complexity+in+the+human+transcriptome+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Genetics%22%5BJournal%5D)">Deep surveying of alternative splicing complexity in the human transcriptome by high-throughput sequencing.</a> Nature Genetics. 40, 1413-1415 (2008).</li>
<li>Cieply, B., Carstens, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+roles+of+alternative+splicing+factors+in+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+RNA%22%5BJournal%5D)">Functional roles of alternative splicing factors in human disease.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: RNA. 6, 311-326 (2015).</li>
<li>Xiong, H. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+splicing.+The+human+splicing+code+reveals+new+insights+into+the+genetic+determinants+of+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">RNA splicing. The human splicing code reveals new insights into the genetic determinants of disease.</a> Science. 347, 1254806(2015).</li>
<li>Shirai, Y., Watanabe, M., Sakagami, H., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+splice+variants+in+the+5%27UTR+of+Gtf2i+expressed+in+the+rat+brain%3A+alternative+5%27UTRs+and+differential+expression+in+the+neuronal+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Novel splice variants in the 5'UTR of Gtf2i expressed in the rat brain: alternative 5'UTRs and differential expression in the neuronal dendrites.</a> Journal of Neurochemistry. 134, 578-589 (2015).</li>
<li>Cui, Y., Liu, J., Irudayaraj, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+quantification%3A+in+situ+analysis+of+transcriptome+and+pre-mRNA+alternative+splicing+at+the+nanoscale%5BTitle%5D)+AND+%22Wiley+Interdisciplinary+Reviews%3A+Nanomedicine+and+Nanobiotechnology%22%5BJournal%5D)">Beyond quantification: in situ analysis of transcriptome and pre-mRNA alternative splicing at the nanoscale.</a> Wiley Interdisciplinary Reviews: Nanomedicine and Nanobiotechnology. 9, (2017).</li>
<li>Trifonov, S., Yamashita, Y., Kase, M., Maruyama, M., Sugimoto, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamic+acid+decarboxylase+1+alternative+splicing+isoforms%3A+characterization%2C+expression+and+quantification+in+the+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Glutamic acid decarboxylase 1 alternative splicing isoforms: characterization, expression and quantification in the mouse brain.</a> BMC Neuroscience. 15, 114(2014).</li>
<li>Hollander, D., Naftelberg, S., Lev-Maor, G., Kornblihtt, A. R., Ast, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+Are+Short+Exons+Flanked+by+Long+Introns+Defined+and+Committed+to+Splicing%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Genetics%22%5BJournal%5D)">How Are Short Exons Flanked by Long Introns Defined and Committed to Splicing?</a> Trends in Genetics. 32, 596-606 (2016).</li>
<li>Cassidy, A., Jones, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+in+situ+hybridisation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Developments in in situ hybridisation.</a> Methods. 70, 39-45 (2014).</li>
<li>Meshorer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+splicing+and+neuritic+mRNA+translocation+under+long-term+neuronal+hypersensitivity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alternative splicing and neuritic mRNA translocation under long-term neuronal hypersensitivity.</a> Science. 295, 508-512 (2002).</li>
<li>Wang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope%3A+a+novel+in+situ+RNA+analysis+platform+for+formalin-fixed%2C+paraffin-embedded+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Diagnostics%22%5BJournal%5D)">RNAscope: a novel in situ RNA analysis platform for formalin-fixed, paraffin-embedded tissues.</a> Journal of Molecular Diagnostics. 14, 22-29 (2012).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAscope+for+in+situ+detection+of+transcriptionally+active+human+papillomavirus+in+head+and+neck+squamous+cell+carcinoma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">RNAscope for in situ detection of transcriptionally active human papillomavirus in head and neck squamous cell carcinoma.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2014).</li>
<li>Zhu, H., Hinman, M. N., Hasman, R. A., Mehta, P., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+neuron-specific+alternative+splicing+of+neurofibromatosis+type+1+pre-mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Regulation of neuron-specific alternative splicing of neurofibromatosis type 1 pre-mRNA.</a> Molecular and Cellular Biology. 28, 1240-1251 (2008).</li>
<li>Hinman, M. N., Sharma, A., Luo, G., Lou, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras+signaling+in+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+and+Cellular+Biology%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras signaling in neurons.</a> Molecular and Cellular Biology. 34, 2188-2197 (2014).</li>
<li>Nguyen, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurofibromatosis+type+1+alternative+splicing+is+a+key+regulator+of+Ras%2FERK+signaling+and+learning+behaviors+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Molecular+Genetics%22%5BJournal%5D)">Neurofibromatosis type 1 alternative splicing is a key regulator of Ras/ERK signaling and learning behaviors in mice.</a> Human Molecular Genetics. 26, 3797-3807 (2017).</li>
<li>Zhou, H. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hu+proteins+regulate+alternative+splicing+by+inducing+localized+histone+hyperacetylation+in+an+RNA-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Hu proteins regulate alternative splicing by inducing localized histone hyperacetylation in an RNA-dependent manner.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108, E627-E635 (2011).</li>
<li>Sharma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium-mediated+histone+modifications+regulate+alternative+splicing+in+cardiomyocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Calcium-mediated histone modifications regulate alternative splicing in cardiomyocytes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111, E4920-E4928 (2014).</li>
<li>Adzemovic, M. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunohistochemical+Analysis+in+the+Rat+Central+Nervous+System+and+Peripheral+Lymph+Node+Tissue+Sections%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Immunohistochemical Analysis in the Rat Central Nervous System and Peripheral Lymph Node Tissue Sections.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2016).</li>
<li>Shokry, I. M., Callanan, J. J., Sousa, J., Tao, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+In+Situ+Hybridization+using+Oligonucleotide+Probes+on+Paraformaldehyde-prefixed+Brain+of+Rats+with+Serotonin+Syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%22%5BJournal%5D)">Rapid In Situ Hybridization using Oligonucleotide Probes on Paraformaldehyde-prefixed Brain of Rats with Serotonin Syndrome.</a> Journal of Visualized Experiments. , (2015).</li>
<li>Erben, L., He, M. X., Laeremans, A., Park, E., Buonanno, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Novel+Ultrasensitive+In+Situ+Hybridization+Approach+to+Detect+Short+Sequences+and+Splice+Variants+with+Cellular+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Neurobiology%22%5BJournal%5D)">A Novel Ultrasensitive In Situ Hybridization Approach to Detect Short Sequences and Splice Variants with Cellular Resolution.</a> Molecular Neurobiology. , (2017).</li>
</ol>

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Diese Mitteilung berichtet die Verwendung von BaseScope RNA-ISH, als Expressionsmuster Maus Gehirn abschnittsweise zu prüfen. Es wird gezeigt, dass diese Anti-Sense Exon-Exon-Junction-Sonden kürzer als 50 Nukleotide Exon Eingliederung und überspringen Isoformen, robust und speziell ansprechen kannst. Darüber hinaus können die resultierenden Signale zur PSI eine alternative Exon berechnen.
Ein paar Variationen wurden in dem Verfahren getestet. Z. B. wurden gefrorene Gewebeschnitte von Kryostat ...

Alternatives Spleißen (AS) ist ein gemeinsamer Prozess, der auftritt, während der Pre-mRNA-Reifung. In diesem Prozess kann ein Exon differentiell in Reife mRNA aufgenommen werden. So kann durch AS, ein Gen viele mRNAs, dass Code für verschiedene Proteinprodukte generieren. Es wird geschätzt, dass 92 – 94 % der menschlichen Gene alternative Spleißen1,2unterziehen. Abnorme Alternative Spleißen Muster ergab sich aus genetische Mutationen zu einer Vielzahl von Erkrankungen wie Amyotrophe Lateralsklerose, myotonische Dystrophie und Krebs3,4in Verbindung gebracht worden. Es ist somit entscheidend zu untersuchen und zu alternative Spleißen regulatorische Mechanismen besser zu verstehen, in einem Versuch, neue Behandlungen von Krankheiten des Menschen zu finden.
WIE oft in einer Zelle Typ-spezifische Art und Weise geregelt ist. Es ist wichtig, das AS Expressionsmuster eines bestimmten Gens in einem bestimmten biologischen System zu bestimmen. Dies wird jedoch kompliziert, wenn ein komplexes Organ, das viele verschiedene Arten von Zellen, wie Gehirn oder Herz, enthält studiert wird. In diesem Fall ist eine ideale Wahl Testsystem RNA in Situ Hybridisierung (ISH) mit Gewebe Abschnitte so AS Ausdrucksmuster eines bestimmten Gens in vielen Zelltypen gleichzeitig erkannt werden. In der Tat wurden Exon-spezifischen Sonden zur Ausdruck Niveaus ein alternative Exon5,6,7festzusetzen. Dieser Ansatz ist jedoch nicht gut geeignet für als Muster Analyse aus den folgenden Gründen. Erste, konventionelle ISH Methoden verwenden in der Regel länger als 300 Sonden bp, während die durchschnittliche Größe der vertebrate internen Exons (nicht vor- oder Nachnamen Exon) 170 Nukleotide8,9. Zweitens Wenn eine Exon-spezifische Sonde verwendet wird, um das Spleißen Muster eine interne alternative Exon untersuchen, ist die einzige mRNA-Isoform erkannt von der Sonde derjenige, der das Exon, während die mRNA-Isoform enthält, ohne das Exon erkannt werden kann. Berechnung der gespleißt (PSI) Wert für das alternative Exon Prozent ist so kompliziert. Darüber hinaus verbindet konventionelle Leuchtstofflampen ISH ISH oft mit Immunostaining, das reduziert die nachweiseffizienz und Robustheit. Zum Beispiel in einer Studie, die untersucht die stressinduzierte Spleißen Isoform Schalten von Acetylcholinesterase (AChE) mRNA, Digoxigenin wurde in die ISH-Sonde aufgenommen und mit Anti-Digoxigenin-Antikörper nachgewiesen. Alternativ wurde Biotin-markierten Sonde durch eine alkalische Phosphatase/Streptavidin-Konjugat und Substrat für alkalische Phosphatase10festgestellt. Weder-Methode verwendet Verstärkung Strategie, um die Nachweisempfindlichkeit zu erhöhen. Infolgedessen ist es schwierig um zu mRNA Transkripte zu erkennen, die auf einem niedrigen Niveau zum Ausdruck kommen. Daher ist eine einfachere und robustere ISH-Assay-System erforderlich, um als Ausdruck Muster in Situzu analysieren.
BaseScope wurde vor kurzem entwickelt, basierend auf der Plattform des RNAscope, eine gut etablierte und weit verbreitete ISH Testsystem. Beide Test-Systeme setzen eine gezielt Verstärkungstechnologie, die erhöht die Empfindlichkeit der Erkennung11,12. Was man von den anderen unterscheidet, ist die Länge der Zielsequenz, die so kurz wie 50 Nukleotide für BaseScope und 300 – 1.000 Nukleotide für RNAscope ist. Somit ist es möglich, Design-Sonden, die auf Exon-Exon-Kreuzungen, spezifische alternative mRNA-Isoformen zu erkennen. In der aktuellen Studie wurde ein Verfahren eingesetzt, um zu prüfen wie Expressionsmuster der Neurofibromatose 1 (Nf1) Exon 23a, eine alternative Exon ausgiebig studiert in der gleichen Labor13,14,15 Typ , 16 , 17in Maus Gehirn Abschnitten. Die Ergebnisse zeigen, dass BaseScope ein ideales System, Expressionsmuster von Nf1 Exon 23a in Situzu studieren. Da diesem Testsystem analysieren als Expressionsmuster von vielen Alternativen Exons angepasst werden kann, stellt es ein leistungsfähiges neues Tool in den Studien der AS.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hybridisierungsofen</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>241000ACD</td><td></td></tr><tr><td>Feuchtekontrollschale (mit Deckel)</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310012</td><td></td></tr><tr><td>Stain Rack</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>310017</td><td></td></tr><tr><td>Heizplatte</td><td>Fisher Scientific</td><td>1160049SH</td><td></td></tr><tr><td>Imperial III Allzweck-Inkubator</td><td>Lab-Line</td><td>302</td><td></td></tr><tr><td>Objektträgerscanner</td><td>Leica</td><td>SCN400</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td><>Kommentare</td></tr><tr><td>Reagenzien</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vorbehandlungskit</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>322381</td><td></td></tr><tr><td>Wasserstoffperoxid</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000899</td><td></td></tr><tr><td>Protease III*</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2000901</td><td></td></tr><tr><td>10x Target Retrieval</td><td>Advanced Cell Diagnostics</td><td>2002555</td><td></td></tr><tr><td>BaseScope Detection Reagent Kit</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>332910</td><td></td></tr><tr><td>AMP 0</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>2001814</td><td></td></tr><tr><td>AMP 1</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>2001815</td><td></td></tr><tr><td>AMP 2</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>2001816</td><td></td></tr><tr><td>AMP 3</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>2001817</td><td></td></tr><tr><td>AMP 4</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>16229B</td><td></td></tr><tr><td>AMP 5-RED</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>16229C</td><td></td></tr><tr><td>AMP 6-RED</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>2001820</td><td></td></tr><tr><td>Schnelle RED-A</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>2001821</td><td></td></tr><tr><td>Schnelle RED-B</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>16230F</td><td></td></tr><tr><td>50x Wash Buffer</td><td>Erweiterte Zelldiagnose</td><td>310091</td><td></td></tr><tr><td>Negativkontrollsonde - Maus DapB-1ZZ</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>701021</td><td></td></tr><tr><td>Positivkontrollsonde - Maus (mm)-PPIB-1ZZ</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>701081</td><td></td></tr><tr><td>Steuerung Slide-Maus 3T3 Zellpellet</td><td>Erweiterte Zelldiagnostik</td><td>310045</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td><>Unternehmen</td><td>Katalognummer</td><td>Kommentare</td></tr><tr><td>Sonstiges Zubehör</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Befeuchtungspapier</td><td>Fortschrittliche Zelldiagnostik</td><td>310015</td><td></td></tr><tr><td>Waschgestell</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>9837976</td><td></td></tr><tr><td>Geschirrspülen</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>LWS20WH</td><td></td></tr><tr><td>Hydrophober Barrierestift</td><td>Vektorlabor</td><td>H-4000</td><td></td></tr><tr><td>Objektträger</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Deckglas, 24 mm x 50 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>12--545-F</td><td></td></tr><tr><td>Name<</td><td>strong>Unternehmen</td><td><>Katalognummer</td><td>Kommentare</strong</td></tr><tr><td>>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumhydroxid</td><td>Fisher Scientific</td><td>002689</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol (EtOH)</td><td>Decon Labs</td><td>2805</td><td></td></tr><tr><td>formalde Lösung</td><td>Fisher Scientific</td><td>SF94-4</td><td></td></tr><tr><td>Hämatoxylin I</td><td>American Master Tech Scientific</td><td>17012359</td><td></td></tr><tr><td>Eindeckmedium</td><td>Vector Labs</td><td>H-5000</td><td></td></tr><tr><td>Xylol</td><td>Fisher Scientific</td><td>173942</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitative analyse der alternativen pre-mrna spleißen in maus gehirn abschnitten mit rna in situ hybridisierung assay

Quantitative Analysis of Alternative Pre-mRNA Splicing in Mouse Brain Sections Using RNA In Situ Hybridization Assay

Alternatives Spleißen (AS) tritt in mehr als 90 % der menschlichen Gene. Das Muster des Ausdrucks einer Alternativ gespleißten Exon wird oft in einer Zelle Typ-spezifische Art und Weise geregelt. ALS Ausdruck, die Muster sind in der Regel durch RT-PCR und RNA-Seq analysiert mit RNA-Proben von einer Bevölkerung der Zellen isoliert. In Situ Untersuchung als Expressionsmuster für eine bestimmte biologische Struktur kann durch RNA in Situ Hybridisierung (ISH) mit Exon-spezifischen Sonden durchgeführt werden. Jedoch wurde diese besondere Verwendung des ISH beschränkt, weil alternative Exons in der Regel zu kurz, um Exon-spezifischen Sonden zu entwerfen. In diesem Bericht wird die Verwendung von BaseScope, eine neu entwickelte Technologie, die kurze antisense Oligonukleotide in RNA ISH beschäftigt beschrieben als Expressionsmuster in Maus Gehirn Abschnitten zu analysieren. Exon 23a der Neurofibromatose Typ 1 (Nf1) dient als ein Beispiel zur Veranschaulichung, dass kurze Exon-Exon-Junction-Sonden robuste Hybridisierung Signale mit hoher Spezifität in RNA ISH Analyse auf Maus Gehirn Abschnitte aufweisen. Noch wichtiger ist, können Signale mit Exon Aufnahme und überspringen-spezifische Sonden erkannt verwendet werden, die Werte von Nf1 Exon 23a Ausdruck in verschiedenen anatomischen Bereichen des mausgehirns einer gespleißt Prozent zuverlässig berechnen. Die experimentelle Protokoll und Berechnungsmethode für die Analyse werden vorgestellt. Die Ergebnisse zeigen, dass BaseScope bietet ein leistungsfähiges neues Tool als Ausdruck Muster in Situbewerten.

BaseScope ISH erfolgte nach drei Mausstämme: CD1 Wildtyp-Mäusen C57BL/6J Wildtyp-Mäusen und Nf123aIN/23aIN mutierte Mäuse im C57BL/6J Hintergrund, in denen Exon 23a in allen Zelltypen infolge eines enthalten ist entwickelt Spleiß-Website Mutationen-14,-15.
Als ersten Schritt, das ISH Assay System wurde getestet mit Unternehmen zur Verfügung gestellt ...

Eine in Situ Hybridisierung (ISH) Protokoll, die kurze antisense Oligonukleotide verwendet, um alternative Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitte erkennen wird beschrieben.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Alternative splicing (AS) occurs in more than 90% of human genes. The expression pattern of an alternatively spliced exon is often regulated in a cell ...

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des alternativen Prä-mRNA-Spleißens zu beantworten. Insbesondere bietet es ein robustes, sensitives Assay-System, um alternative Spleißmuster in situ in Gewebeschnitten zu untersuchen. Mit dieser Methode kann alternatives Spleißen gleichzeitig in vielen Subtypen analysiert werden, die in komplexen biologischen Strukturen wie einem Mäusegehirn enthalten sind.Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schockantistatische Exon-Übergangssonden bei der mRNA-in-situ-Hybridisierung verwendet, um isoformspezifische Hybridisierungssignale zu erzeugen. Die Gebäudesignalverstärkungstechnologie erhöht die Empfindlichkeit der Detektion, um robuste Hybridisierungssignale bereitzustellen. Bei den detektierten Signalen handelte es sich um Exon-Einschluss, die aus spezifischen Sonden entwichen, die zur Berechnung des prozentualen Spleißens in den Vitalwerten in verschiedenen anatomischen Bereichen eines Mäusegehirns verwendet werden.In dieser Arbeit wird das NF1-Exon 23a als Beispiel verwendet, um den Einsatz des Assay-Systems zu veranschaulichen. Das System kann jedoch angepasst werden, um Expressionsmuster vieler alternativer Exons zu analysieren. Um die Paraffinisierung des Mausgehirns in Abschnitt D zu starten, füllen Sie zwei Spülgeschirr mit 250 Millilitern Xylol.Und zwei weitere mit 250 Millilitern 100%igem Ethanol in einem Abzug. Legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer. Stellen Sie dann den Wäscheständer in eine Xylol-haltige Schale und inkubieren Sie ihn fünf Minuten lang, während Sie den Rost mindestens dreimal auf und ab bewegen, und wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Xylolschale.Stellen Sie dann das Gestell in eine ethanolhaltige Schale und inkubieren Sie es zwei Minuten lang mit den gleichen Auf- und Abbewegungen und wiederholen Sie dann mit der zweiten Ethanolschale. Um die Objektträger zu trocknen, nehmen Sie das Gestell aus der zweiten Ethanolschale und legen Sie es für fünf Minuten in einen Inkubator bei 60 Grad Celsius. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine 0,75 Zoll x 0,75 Zoll große Barriere um den Gewebeschnitt und trocknen Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie die Temperatur auf 40 Grad Celsius ein. Nachdem Sie das Befeuchtungspapier vollständig mit destilliertem Wasser benetzt haben, legen Sie es in eine Feuchtigkeitskontrollschale. Setzen Sie dann die Feuchtigkeitskontrollschale in den Hybridisierungsofen ein.Nachdem Sie die getrockneten Objektträger auf eine Bank gelegt haben, bedecken Sie die Gewebeschnitte auf jedem Objektträger vollständig mit fünf bis acht Tropfen Wasserstoffperoxidlösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Klopfen Sie die Objektträger nacheinander auf ein saugfähiges Papier, um die Wasserstoffperoxidlösung zu entfernen, und legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer.Tauchen Sie das Gestell in eine Spülschüssel mit Wasser, während Sie es drei- bis fünfmal auf und ab bewegen, um die Objektträger zu waschen. Füllen Sie einen Ein-Liter-Glasbecher, der auf einer heißen Platte steht, mit 700 Millilitern 1X Target-Removal-Behandlung und decken Sie ihn mit Folie ab. Führen Sie ein Thermometer durch die Folienabdeckung und schalten Sie die Heizplatte ein, die 10 bis 15 Minuten lang auf hohe Temperatur eingestellt ist.Sobald die Temperatur des Entnahmereagenzes 98 Grad Celsius erreicht, stellen Sie die Heizplatte auf niedrige Temperatur, um einen milden Siedezustand aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie dann vorsichtig die Folie und legen Sie das Gestell in das Becherglas. Den Becher mit Folie abdecken und 15 Minuten inkubieren.Schieben Sie das Gestell mit einer Pinzette aus dem Becherglas in eine Spülschüssel mit 200 Millilitern destilliertem Wasser und inkubieren Sie es 15 Sekunden lang. Legen Sie das Gestell nach 15 Sekunden in eine Waschschüssel mit 100 % Ethanol und inkubieren Sie es drei Minuten lang. Den Rost aus der Form nehmen und bei 60 Grad Celsius 10 Minuten trocknen.Nachdem Sie die Objektträger auf ein Fleckengestell gelegt haben, bedecken Sie die Gewebeschnitte mit fünf Tropfen Protease 3 pro Objektträger. Legen Sie den Rost vorsichtig in die Feuchtigkeitskontrollschale, setzen Sie die Schale in den Hybridisierungsofen ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Nachdem Sie das Gestell aus dem Tablett genommen haben, klopfen Sie auf die Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie in einen Waschständer.Stellen Sie den Rost in eine Spülschüssel mit destilliertem Wasser und bewegen Sie den Rost drei- bis fünfmal auf und ab, um die Objektträger zu waschen. Zur Vorbereitung der In-situ-Hybridisierung inkubieren Sie die Sonden und AMP-Reagenzien 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale in den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie sie auf 40 Grad Celsius ein.Für die Sondenhybridisierung nehmen Sie die Objektträger vom Waschgestell und klopfen Sie darauf, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Objektträger auf ein Fleckengestell. Verwenden Sie einen Bleistift, um die Folien mit dem Namen des Prüfpunkts zu beschriften.Platzieren Sie drei nebeneinander geschnittene Hirngewebeobjektträger, die mit drei verschiedenen Nervenfaser-Mitose-Typ-1-Sonden hybridisiert werden sollen. Da es sehr unterschiedliche isoformspezifische Sonden gibt, verwende ich nebeneinander geschnittene Gewebeschnitte. Es ist wichtig, dass diese Abschnitte in den Hybridisierungs-, Amplifikations- und Signaldetektionsschritten genau gleich behandelt werden, um die Genauigkeit des prozentualen Spleißes bei der Berechnung zu gewährleisten.Decken Sie die Gewebeschnitte mit vier Tropfen Sonde pro Schnitt ab, jeweils einen Objektträger, um ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern. Legen Sie dann den Fleckenrost in die Feuchtigkeitskontrollschale und legen Sie ihn für zwei Stunden in den 40 Grad Celsius heißen Ofen. Stellen Sie anschließend einen Wäscheständer in eine Waschschüssel, die mit 200 Millilitern 1X Waschpuffer gefüllt ist.Tippen Sie dann nacheinander auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Und stecken Sie sofort jede Folie in den Wäscheständer. Inkubieren Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in einer mit frischem Waschpuffer gefüllten Schale, während Sie den Rost drei- bis fünfmal auf und ab bewegen, und wiederholen Sie dann den Waschgang in einer neuen Schale.Um das Signal zu verstärken, klopfen Sie auf jeden Objektträger, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, und legen Sie ihn auf ein Fleckengestell. Decken Sie den Gewebeabschnitt auf jedem Objektträger mit vier Tropfen AMP Null-Reagenz ab. Legen Sie dann den Rost in die Feuchtigkeitskontrollschale, setzen Sie die Schale in den Ofen ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.Waschen Sie den Objektträger zweimal mit Waschpuffer, wie zuvor in diesem Experiment. Wiederholen Sie den Signalverstärkungsschritt mit den AMP-Reagenzien eins bis sechs, wie im Textprotokoll beschrieben, und waschen Sie die Objektträger nach jedem Schritt. Zur Signalerkennung entfernen Sie überschüssigen Waschpuffer durch Klopfen von den Objektträgern und legen Sie sie auf ein Fleckengestell.Mischen Sie anschließend zwei Mikroliter Fast Red B mit 120 Mikrolitern Fast Red A in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie die Lösung zu den Gewebeabschnitten auf jedem Objektträger, um sie vollständig zu bedecken. Stellen Sie den Fleckenkorb in die Feuchtigkeitskontrollschale, decken Sie die Schale ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.Entfernen Sie dann die Lösung und legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer. Legen Sie das Gestell in eine Spülschüssel mit Leitungswasser, um die Objektträger zu waschen, und wiederholen Sie den Waschvorgang. Klopfen Sie nach dem zweiten Waschen auf ein saugfähiges Papier, um überschüssiges Wasser zu entfernen.Stellen Sie dann das Gestell in eine Schüssel mit 50 % Hämatoxylin-Färbelösung. Bewegen Sie das Gestell mehrmals auf und ab. Und zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.Schieben Sie den Rost in eine Spülschüssel mit Leitungswasser. Bewegen Sie das Gestell fünfmal auf und ab und wiederholen Sie die Wäsche, bis die Objektträger klar werden, während die Gewebeschnitte violett bleiben. Schieben Sie dann den Rost in eine Schüssel mit 0,02 % Ammoniakwasser.Bewegen Sie das Gestell zwei- bis viermal auf und ab, bis die Abschnitte blau werden. Waschen Sie die Objektträger drei- bis fünfmal mit Leitungswasser in der Färbeschale. Stellen Sie dann das Gestell in einen Inkubator und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius, um die Objektträger zu trocknen.Wenn es vollständig trocken ist, geben Sie einen Tropfen Einbettmittel auf jede Folie, um die Scheibe zu bedecken. Legen Sie dann vorsichtig ein 24 x 50 Millimeter großes Deckglas über die Gewebeschnitte auf jedem Objektträger. Nachdem Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet haben, fahren Sie mit der Datenerfassung fort.Zur Berechnung des prozentualen Spleißens oder des PSI-Werts für Exon 23a wird die Anzahl der Zellen und Punkte in drei Unterregionen des Kortex und des Hippocampus CA3 gezählt. Der RNA-in-situ-Hybridisierungsassay wird in Gehirnschnitten von CD1-Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von drei verschiedenen NF1-spezifischen Sonden durchgeführt. Rote punktförmige Punkte, die in den Abschnitten Kortex und Hippocampus beobachtet wurden, zeigen positive Signale von NF1-Gesamt-, Inklusions- und Skipping-spezifischen Sonden an.Die ISH-Signale der drei Sonden werden dann gezählt und zur Berechnung des PSI verwendet. Der RNA-in-situ-Hybridisierungsassay wird im Kortex von C57 schwarzen 6J-Wildtyp-Mäusen und C57 schwarzen 6J-mutierten Mäusen durchgeführt, wobei Exon 23a in allen Zelltypen enthalten ist. Rote punktförmige Punkte, die in der Hirnrinde von C57-Mäusen mit schwarzem 6J-Wildtyp beobachtet wurden, deuten auf positive Signale von NF1-Gesamt-, Einschluss- und Überspringen-spezifischen Sonden hin.In C57-schwarzen 6J-mutierten Mäusen werden ähnliche Signale durch NF1-Gesamt- und Einschluss-spezifische Sonden erhalten. Bei der Verwendung einer spezifischen Sonde mit Überspringen wird jedoch kein Signal erkannt, was darauf hinweist, dass zwei Sonden, die auf den Exon-Einschluss oder das Überspringen abzielen, hochspezifisch sind. Da für dieses Verfahren noch keine mehrfarbige Markierung auf denselben Gewebeobjektträgern verfügbar ist, werden auf den verschiedenen Gewebeobjektträgern unterschiedliche Sonden verwendet.Um die genauen prozentualen Spleißwerte zu erhalten, ist es wichtig, nebeneinander geschnittene Objektträger zu verwenden und die Objektträger während dieses Verfahrens auf genau die gleiche Weise zu behandeln. Ergänzend zu diesem Verfahren können Messungen wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Lokalisation und Funktion differentiell exprimierter Spleißisoformen zu beantworten.

quantitative-analysis-alternative-pre-mrna-splicing-mouse-brain

Research

Forschung

JoVE Journal

Genetics

Genetik

Durch die vorübergehende Natur der pre-mRNA, kann es schwierig sein zu isolieren und zu...

Eine schnelle High-Throughput-Verfahren zur Abbildung Ribonukleoproteine ​​(RNPs) on Human pre-mRNA

Dieses Video zeigt den Nachweis der Serotoninrezeptor-RNA-Synthese mit Hilfe von Oligonukleotidsonden in Rattenhirngewebe, das vom Serotonin-Syndrom betroffen ist. Das Protokoll umfasst eine Gewebevorbehandlung, Sondenhybridisierung und enzymatische Detektion, um die RNA-Expression von Serotoninrezeptoren unter einem Mikroskop sichtbar zu machen und zu quantifizieren.

In-situ-Hybridisierung mit Oligonukleotidsonden zur Untersuchung der RNA-Expression in Hirnschnitten von Ratten

Quelle: Jolly, S., et.al. Kombination von Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung mit Immunmarkierung zum Nachweis der Expression von drei Genen in Hirnschnitten von Mäusen. J. Vis. Exp. (2016). Dieses Video zeigt die Verwendung von Doppelfluoreszenz-in-situ-Hybridisierung, um die Expression von zwei RNA-Zielen in Hirnschnitten von Mäusen sichtbar zu machen. Das Protokoll umfasst den sequentiellen Nachweis von RNA mit Sonden, die mit Fluoresceinisothiocyanat und Digoxigenin markiert sind,...

 Durchführung einer Doppelfluoreszenz-In-situ-Hybridisierung zum Nachweis der Genexpression in Gehirnschnitten von Mäusen

Es wurde gezeigt, dass die alternative Spleißregulation zum epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) beiträgt, einem essentiellen zellulären Programm in verschiedenen physiologischen und pathologischen Prozessen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das ein induzierbares EMT-Modell zur Detektion von alternativem Spleißen während der EMT verwendet.

Nachweis von Alternative Splicing Während Epithelial-mesenchymale Transition

RNA in situ Hybridisierung (ISH) ermöglicht die Visualisierung von RNAs in Zellen und Geweben. Hier zeigen wir, wie die Kombination von RNAscope ISH mit immunhistochemischer oder histologischer Farbstoffe erfolgreich eingesetzt werden kann, um mRNAs, die an Axonen lokalisiert sind, in Schnitten des Gehirns von Mäusen und Menschen zu detektieren.

Nachweis von Axonally lokalisierten mRNAs in Gehirnschnitten mittels hochauflösender<em&gt; In-situ-</em&gt; Hybridization

Die Lokalisierung der Genexpression auf bestimmte Zelltypen kann aufgrund des Mangels an spezifischen Antikörpern eine Herausforderung darstellen. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur gleichzeitigen dreifachen Detektion der Genexpression durch Kombination von Doppelfluoreszenz-RNA-in-situ-Hybridisierung mit Immunfärbung.

Die Kombination von Doppel-Fluoreszenz<em&gt; In Situ</em&gt; Die Hybridisierung mit Immunmarkierung für Nachweis der Expression von drei Gene in Mäusehirnschnitten

Hier haben wir ein Protokoll beschreiben bei der Untersuchung der Auswirkungen von anomalen Spleißen auf Medikamentenresistenz bei soliden Tumoren und hämatologischen Malignitäten ausgerichtet. Zu diesem Ziel haben wir analysiert , die transkriptomischen Profile der elterlichen und beständig in - vitro - Modellen durch RNA-seq und gründete eine qRT-PCR - basierte Methode Kandidatengene zu validieren.

Mit RNA-Sequenzierung Neuartige Splice-Varianten zu Arzneimittelresistenz mit Bezug zu erkennen in<em&gt; In Vitro</em&gt; Cancer Models

Hier präsentierten wir eine multiplexierte einzellige mRNA-Sequenzierungsmethode, um die Genexpression in embryonalen Geweben der Maus zu profilieren. Die tropfenbasierte einzelzellbasierte mRNA-Sequenzierung (scRNA-Seq) in Kombination mit Multiplexing-Strategien kann Einzelne Zellen aus mehreren Proben gleichzeitig profilieren, was die Reagenzkosten deutlich reduziert und experimentelle Chargeneffekte minimiert.

Multiplexed Single Cell mRNA Sequenzierungsanalyse von Mausembryonalzellen

Alternative Spleißen (AS) und alternative Polyadenylierung (APA) erweitern die Vielfalt der Transkriptisoformen und ihrer Produkte. Hier beschreiben wir bioinformatische Protokolle zur Analyse von Bulk-RNA-seq und 3'-Endsequenzierungsassays, um AS und APA zu erkennen und zu visualisieren, die unter experimentellen Bedingungen variieren.

Identifizierung von alternativem Spleißen und Polyadenylierung in RNA-seq-Daten

Wir haben einen Duplex-in-situ-Hybridisierungsassay zur Kartierung der Insulinrezeptor-Isoformen IR-A und IR-B im murinen Plexus choroideus etabliert und damit die Einschränkungen traditioneller Methoden überwunden. Dieser hochauflösende Ansatz enthüllt die isoformspezifische Expression und bietet neue Einblicke in die Insulinsignalisierung im Gehirn und potenzielle isoform-gezielte Therapien für neurologische Erkrankungen.

Präzise Visualisierung der Insulinrezeptoren A und B im Gehirn von Mäusen mit einem RNA In Situ Hybridisierungsassay

Dieses Protokoll bietet eine optimierte rechnerische Pipeline zur Quantifizierung von naszierenden Enhancer-Transkripten. Durch die Integration von Chromatinzugänglichkeit, Chromatinmerkmal und Transkriptionsdaten ermöglicht es einen genauen Nachweis und eine strangspezifische Analyse der Enhanceraktivität in komplexen intragenen Regionen, während es für Forscher ohne umfangreiche bioinformatische Ausbildung zugänglich bleibt.

Eine computergestützte Pipeline für die Quantifizierung intergener/intragener Enhancer-RNA in embryonalen Stammzellen der Maus

Erfahren Sie die quantitative Analyse alternativer Pre-mRNA-Spleißmuster in Maus-Hirnschnitten mit RNA-In-Situ-Hybridisierung. Diese Methode ermöglicht die gleichzeitige Detektion verschiedener Spleißvarianten in komplexen neuronalen Strukturen.

Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Weitere Videos entdecken