Quantitative Analyse der alternativen Pre-mRNA Spleißen in Maus Gehirn Abschnitten mit RNA In Situ Hybridisierung Assay

Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen auf dem Gebiet des alternativen Prä-mRNA-Spleißens zu beantworten. Insbesondere bietet es ein robustes, sensitives Assay-System, um alternative Spleißmuster in situ in Gewebeschnitten zu untersuchen. Mit dieser Methode kann alternatives Spleißen gleichzeitig in vielen Subtypen analysiert werden, die in komplexen biologischen Strukturen wie einem Mäusegehirn enthalten sind.

Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schockantistatische Exon-Übergangssonden bei der mRNA-in-situ-Hybridisierung verwendet, um isoformspezifische Hybridisierungssignale zu erzeugen. Die Gebäudesignalverstärkungstechnologie erhöht die Empfindlichkeit der Detektion, um robuste Hybridisierungssignale bereitzustellen. Bei den detektierten Signalen handelte es sich um Exon-Einschluss, die aus spezifischen Sonden entwichen, die zur Berechnung des prozentualen Spleißens in den Vitalwerten in verschiedenen anatomischen Bereichen eines Mäusegehirns verwendet werden.

In dieser Arbeit wird das NF1-Exon 23a als Beispiel verwendet, um den Einsatz des Assay-Systems zu veranschaulichen. Das System kann jedoch angepasst werden, um Expressionsmuster vieler alternativer Exons zu analysieren. Um die Paraffinisierung des Mausgehirns in Abschnitt D zu starten, füllen Sie zwei Spülgeschirr mit 250 Millilitern Xylol.

Und zwei weitere mit 250 Millilitern 100%igem Ethanol in einem Abzug. Legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer. Stellen Sie dann den Wäscheständer in eine Xylol-haltige Schale und inkubieren Sie ihn fünf Minuten lang, während Sie den Rost mindestens dreimal auf und ab bewegen, und wiederholen Sie den Vorgang mit der zweiten Xylolschale.

Stellen Sie dann das Gestell in eine ethanolhaltige Schale und inkubieren Sie es zwei Minuten lang mit den gleichen Auf- und Abbewegungen und wiederholen Sie dann mit der zweiten Ethanolschale. Um die Objektträger zu trocknen, nehmen Sie das Gestell aus der zweiten Ethanolschale und legen Sie es für fünf Minuten in einen Inkubator bei 60 Grad Celsius. Zeichnen Sie mit einem hydrophoben Barrierestift eine 0,75 Zoll x 0,75 Zoll große Barriere um den Gewebeschnitt und trocknen Sie sie drei Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft.

Schalten Sie den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie die Temperatur auf 40 Grad Celsius ein. Nachdem Sie das Befeuchtungspapier vollständig mit destilliertem Wasser benetzt haben, legen Sie es in eine Feuchtigkeitskontrollschale. Setzen Sie dann die Feuchtigkeitskontrollschale in den Hybridisierungsofen ein.

Nachdem Sie die getrockneten Objektträger auf eine Bank gelegt haben, bedecken Sie die Gewebeschnitte auf jedem Objektträger vollständig mit fünf bis acht Tropfen Wasserstoffperoxidlösung. 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren. Klopfen Sie die Objektträger nacheinander auf ein saugfähiges Papier, um die Wasserstoffperoxidlösung zu entfernen, und legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer.

Tauchen Sie das Gestell in eine Spülschüssel mit Wasser, während Sie es drei- bis fünfmal auf und ab bewegen, um die Objektträger zu waschen. Füllen Sie einen Ein-Liter-Glasbecher, der auf einer heißen Platte steht, mit 700 Millilitern 1X Target-Removal-Behandlung und decken Sie ihn mit Folie ab. Führen Sie ein Thermometer durch die Folienabdeckung und schalten Sie die Heizplatte ein, die 10 bis 15 Minuten lang auf hohe Temperatur eingestellt ist.

Sobald die Temperatur des Entnahmereagenzes 98 Grad Celsius erreicht, stellen Sie die Heizplatte auf niedrige Temperatur, um einen milden Siedezustand aufrechtzuerhalten. Entfernen Sie dann vorsichtig die Folie und legen Sie das Gestell in das Becherglas. Den Becher mit Folie abdecken und 15 Minuten inkubieren.

Schieben Sie das Gestell mit einer Pinzette aus dem Becherglas in eine Spülschüssel mit 200 Millilitern destilliertem Wasser und inkubieren Sie es 15 Sekunden lang. Legen Sie das Gestell nach 15 Sekunden in eine Waschschüssel mit 100 % Ethanol und inkubieren Sie es drei Minuten lang. Den Rost aus der Form nehmen und bei 60 Grad Celsius 10 Minuten trocknen.

Nachdem Sie die Objektträger auf ein Fleckengestell gelegt haben, bedecken Sie die Gewebeschnitte mit fünf Tropfen Protease 3 pro Objektträger. Legen Sie den Rost vorsichtig in die Feuchtigkeitskontrollschale, setzen Sie die Schale in den Hybridisierungsofen ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius. Nachdem Sie das Gestell aus dem Tablett genommen haben, klopfen Sie auf die Objektträger, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen, und legen Sie sie in einen Waschständer.

Stellen Sie den Rost in eine Spülschüssel mit destilliertem Wasser und bewegen Sie den Rost drei- bis fünfmal auf und ab, um die Objektträger zu waschen. Zur Vorbereitung der In-situ-Hybridisierung inkubieren Sie die Sonden und AMP-Reagenzien 30 Minuten lang bei Raumtemperatur. Setzen Sie die Feuchtigkeitskontrollschale in den Hybridisierungsofen ein und stellen Sie sie auf 40 Grad Celsius ein.

Für die Sondenhybridisierung nehmen Sie die Objektträger vom Waschgestell und klopfen Sie darauf, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Legen Sie die Objektträger auf ein Fleckengestell. Verwenden Sie einen Bleistift, um die Folien mit dem Namen des Prüfpunkts zu beschriften.

Platzieren Sie drei nebeneinander geschnittene Hirngewebeobjektträger, die mit drei verschiedenen Nervenfaser-Mitose-Typ-1-Sonden hybridisiert werden sollen. Da es sehr unterschiedliche isoformspezifische Sonden gibt, verwende ich nebeneinander geschnittene Gewebeschnitte. Es ist wichtig, dass diese Abschnitte in den Hybridisierungs-, Amplifikations- und Signaldetektionsschritten genau gleich behandelt werden, um die Genauigkeit des prozentualen Spleißes bei der Berechnung zu gewährleisten.

Decken Sie die Gewebeschnitte mit vier Tropfen Sonde pro Schnitt ab, jeweils einen Objektträger, um ein Austrocknen der Schnitte zu verhindern. Legen Sie dann den Fleckenrost in die Feuchtigkeitskontrollschale und legen Sie ihn für zwei Stunden in den 40 Grad Celsius heißen Ofen. Stellen Sie anschließend einen Wäscheständer in eine Waschschüssel, die mit 200 Millilitern 1X Waschpuffer gefüllt ist.

Tippen Sie dann nacheinander auf ein Papiertuch, um überschüssige Flüssigkeit zu entfernen. Und stecken Sie sofort jede Folie in den Wäscheständer. Inkubieren Sie zwei Minuten lang bei Raumtemperatur in einer mit frischem Waschpuffer gefüllten Schale, während Sie den Rost drei- bis fünfmal auf und ab bewegen, und wiederholen Sie dann den Waschgang in einer neuen Schale.

Um das Signal zu verstärken, klopfen Sie auf jeden Objektträger, um überschüssigen Waschpuffer zu entfernen, und legen Sie ihn auf ein Fleckengestell. Decken Sie den Gewebeabschnitt auf jedem Objektträger mit vier Tropfen AMP Null-Reagenz ab. Legen Sie dann den Rost in die Feuchtigkeitskontrollschale, setzen Sie die Schale in den Ofen ein und inkubieren Sie sie 30 Minuten lang bei 40 Grad Celsius.

Waschen Sie den Objektträger zweimal mit Waschpuffer, wie zuvor in diesem Experiment. Wiederholen Sie den Signalverstärkungsschritt mit den AMP-Reagenzien eins bis sechs, wie im Textprotokoll beschrieben, und waschen Sie die Objektträger nach jedem Schritt. Zur Signalerkennung entfernen Sie überschüssigen Waschpuffer durch Klopfen von den Objektträgern und legen Sie sie auf ein Fleckengestell.

Mischen Sie anschließend zwei Mikroliter Fast Red B mit 120 Mikrolitern Fast Red A in einem Mikrozentrifugenröhrchen. Geben Sie die Lösung zu den Gewebeabschnitten auf jedem Objektträger, um sie vollständig zu bedecken. Stellen Sie den Fleckenkorb in die Feuchtigkeitskontrollschale, decken Sie die Schale ab und inkubieren Sie sie 10 Minuten lang bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie dann die Lösung und legen Sie die Objektträger in einen Wäscheständer. Legen Sie das Gestell in eine Spülschüssel mit Leitungswasser, um die Objektträger zu waschen, und wiederholen Sie den Waschvorgang. Klopfen Sie nach dem zweiten Waschen auf ein saugfähiges Papier, um überschüssiges Wasser zu entfernen.

Stellen Sie dann das Gestell in eine Schüssel mit 50 % Hämatoxylin-Färbelösung. Bewegen Sie das Gestell mehrmals auf und ab. Und zwei Minuten bei Raumtemperatur inkubieren.

Schieben Sie den Rost in eine Spülschüssel mit Leitungswasser. Bewegen Sie das Gestell fünfmal auf und ab und wiederholen Sie die Wäsche, bis die Objektträger klar werden, während die Gewebeschnitte violett bleiben. Schieben Sie dann den Rost in eine Schüssel mit 0,02 % Ammoniakwasser.

Bewegen Sie das Gestell zwei- bis viermal auf und ab, bis die Abschnitte blau werden. Waschen Sie die Objektträger drei- bis fünfmal mit Leitungswasser in der Färbeschale. Stellen Sie dann das Gestell in einen Inkubator und inkubieren Sie es 15 Minuten lang bei 60 Grad Celsius, um die Objektträger zu trocknen.

Wenn es vollständig trocken ist, geben Sie einen Tropfen Einbettmittel auf jede Folie, um die Scheibe zu bedecken. Legen Sie dann vorsichtig ein 24 x 50 Millimeter großes Deckglas über die Gewebeschnitte auf jedem Objektträger. Nachdem Sie die Objektträger 30 Minuten lang bei Raumtemperatur an der Luft getrocknet haben, fahren Sie mit der Datenerfassung fort.

Zur Berechnung des prozentualen Spleißens oder des PSI-Werts für Exon 23a wird die Anzahl der Zellen und Punkte in drei Unterregionen des Kortex und des Hippocampus CA3 gezählt. Der RNA-in-situ-Hybridisierungsassay wird in Gehirnschnitten von CD1-Wildtyp-Mäusen unter Verwendung von drei verschiedenen NF1-spezifischen Sonden durchgeführt. Rote punktförmige Punkte, die in den Abschnitten Kortex und Hippocampus beobachtet wurden, zeigen positive Signale von NF1-Gesamt-, Inklusions- und Skipping-spezifischen Sonden an.

Die ISH-Signale der drei Sonden werden dann gezählt und zur Berechnung des PSI verwendet. Der RNA-in-situ-Hybridisierungsassay wird im Kortex von C57 schwarzen 6J-Wildtyp-Mäusen und C57 schwarzen 6J-mutierten Mäusen durchgeführt, wobei Exon 23a in allen Zelltypen enthalten ist. Rote punktförmige Punkte, die in der Hirnrinde von C57-Mäusen mit schwarzem 6J-Wildtyp beobachtet wurden, deuten auf positive Signale von NF1-Gesamt-, Einschluss- und Überspringen-spezifischen Sonden hin

In C57-schwarzen 6J-mutierten Mäusen werden ähnliche Signale durch NF1-Gesamt- und Einschluss-spezifische Sonden erhalten. Bei der Verwendung einer spezifischen Sonde mit Überspringen wird jedoch kein Signal erkannt, was darauf hinweist, dass zwei Sonden, die auf den Exon-Einschluss oder das Überspringen abzielen, hochspezifisch sind. Da für dieses Verfahren noch keine mehrfarbige Markierung auf denselben Gewebeobjektträgern verfügbar ist, werden auf den verschiedenen Gewebeobjektträgern unterschiedliche Sonden verwendet.

Um die genauen prozentualen Spleißwerte zu erhalten, ist es wichtig, nebeneinander geschnittene Objektträger zu verwenden und die Objektträger während dieses Verfahrens auf genau die gleiche Weise zu behandeln. Ergänzend zu diesem Verfahren können Messungen wie die Immunhistochemie durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen zur Lokalisation und Funktion differentiell exprimierter Spleißisoformen zu beantworten.