Eine Microphysiologic Plattform für menschliches Fett: weißen Fettgewebe eingeklemmt

Diese bahnbrechende Methode ermöglicht es uns zum ersten Mal, Fett ex vivo für mehrere aufeinanderfolgende Wochen am Leben zu erhalten, um die Fettbiologie zu untersuchen. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Gewebe über acht Wochen in der Kultur stabil bleibt, während die Fettmikroumgebung einschließlich der umgebenden nativen Fettstroma-Stützzellen rekapituliert wird. Beginnen Sie mit der Aussaat von ASC mit einer Konfluenz von etwa 80 % in Gewebekulturplatten.

Für jede gewünschte Vertiefung von SWAT wird eine konventionelle Gewebekulturvertiefung und eine Vertiefung entsprechender Größe auf eine PNIPAAm-beschichtete Gewebekultur-Kunststoffplatte ausgesät. Halten Sie das ASC sechs bis acht Tage lang in vollständigem Kulturmedium bei 37 Grad Celsius und 5 % CO2 und wechseln Sie das Medium alle zwei Tage. Vierundzwanzig Stunden vor der SWAT-Aussaat den Rand der Kolbenscheibe jedes Kolbens für das SWAT-Sägerät mindestens zweimal mit Laborklebeband umwickeln, um ein Auslaufen der Gelatinelösung zu verhindern.

Sprühen Sie in einer mit Ethanol desinfizierten Biosicherheitswerkbank ein konisches 15-Milliliter-Röhrchengestell mit leeren, unverschlossenen konischen 15-Milliliter-Röhrchen sowie jeden mit 70 % Ethanol umwickelten Kolben ab und legen Sie jeden Kolben während der Desinfektion in ein leeres Röhrchen. Sprühen Sie etwa 6,3 Gramm schwere Unterlegscheiben ein und legen Sie sie zusammen mit einer Hakenzange auf das Gestell. Schließen Sie dann den Schrankflügel und schalten Sie das UV-Licht ein, um das Trocknen und Sterilisieren der Sägeräte über Nacht zu erleichtern.

Wenn die Zellen eine Konfluenz von 100 % erreichen und ein gestreiftes Muster aufweisen, fügen Sie 0,75 Gramm Gelatinepulver zu 10 Millilitern HBSS hinzu. Und gleichen Sie den pH-Wert der Lösung mit 100 Mikrolitern Natriumhydroxid aus. Geben Sie die Gelatine in ein 75 Grad Celsius heißes Wasserbad und schütteln Sie die Tube alle fünf Minuten kräftig, bis sich das Pulver in Lösung aufgelöst hat.

Die homogene Gelatinelösung durch einen Spritzenfilter abseihen und die Gelatine auf die Kolben auftragen. Die verklebten Kanten der Kolben dienen als Form, während die Gelatine erstarrt. Wenn die Gelatine fest geworden ist, wickeln Sie das Klebeband ab und verwenden Sie die Hakenzange, um die Gelatine von der Außenkante des Kolbens zu entfernen, wobei Sie darauf achten, dass die verbleibende Gelatine in der Mitte des Kolbens vollständig waagerecht ist, um den Kontakt mit der ASC-Folie zu maximieren.

Sobald die Gelatine von allen Kolben entfernt wurde, tragen Sie jeden Kolben vorsichtig auf eine PNIPAAm-beschichtete ASC-Platte auf, indem Sie die Metallscheiben verwenden, um die Kolben zu beschweren. Nach einer 1,5-stündigen Inkubation bei Raumtemperatur werden die Platten für weitere 1,5 Stunden in ein Eiswasserbad überführt, um die Dissoziation des Zellblatts von der PNIPAAm-beschichteten Plattenoberfläche abzuschließen. Reinigen Sie dann die Unterseite der PNIPAAm-beschichteten Platten, um unsteriles Wasser zu entfernen.

Nach Erhalt des menschlichen Fettgewebes wird kaltes Zellkulturmedium in ein 1,5-Milliliter-Mikrozentrifugenröhrchen pro zu bepflanzender Kultur gegeben. Und waschen Sie große Teile des Fettgewebes dreimal in sterilem PBS, wobei Sie zwischen den Wäschen so viel PBS wie möglich entfernen. Nach der letzten Wäsche das Gewebe mit einer Pinzette und einem sterilen Rasierer grob zerkleinern und dabei so viele Gefäße und Faszien wie möglich entfernen, bis die Lösung eine dickflüssige Konsistenz mit möglichst wenigen sichtbaren Einzelsegmenten aus weißem Fettgewebe annimmt.

Sobald eine geeignete Gewebekonsistenz erreicht ist, verwenden Sie eine modifizierte P1000-Mikropipettenspitze, um das entsprechende Volumen des gehackten Gewebes in jedes zuvor vorbereitete 1,5-Milliliter-Röhrchen zu übertragen und mischen Sie das gehackte Gewebe kurz mit dem Medium in den Röhrchen. Ersetzen Sie als Nächstes das Medium in jeder ASC-Kultur durch ein Volumen weißer Fettgewebelösung und übertragen Sie die Gelatinekolben vorsichtig auf die weiße Fettgewebemischung auf den Basis-ASC-Platten. Untersuchen Sie die Monoschichten in den PNIPAAm-beschichteten Platten unter einem Mikroskop, um die zelluläre Ablösung zu bestätigen, und bewegen Sie die Platten auf die Oberfläche eines 37 bis 40 Grad Celsius heißen Wärmeblocks in der Biosicherheitswerkbank.

Fügen Sie dann zwei bis drei Milliliter erwärmtes Kulturmedium hinzu, um die Zellen zu inkubieren und das Schmelzen von Gelatine zu erleichtern. Entfernen Sie nach 30 Minuten vorsichtig die Kolben von der Plattenoberfläche, decken Sie die Kulturen mit den entsprechenden Plattendeckeln ab und legen Sie die Platten in den Zellkultur-Inkubator. Wenn sich die Gelatine vollständig verflüssigt hat, aspirieren Sie das Zellkulturmedium und ersetzen Sie es durch das entsprechende Volumen an phenolrotfreiem M199-Medium, das mit Insulin, Dexamethason und Antibiotika ergänzt wird.

Über 7,5 Wochen Kultur bleiben die SWAT-Cluster auf der Monoschicht an Ort und Stelle, wobei nur geringfügige morphologische Veränderungen in einzelnen Adipozyten beobachtet werden konnten. Die klare Nilrot-Färbung von unilokulären Adipozytenclustern nach zweiwöchiger Kultur zeigt, dass es sich bei den Zellen tatsächlich um Adipozyten mit intakten Membranen handelt und nicht um Artefakte, Zysten oder tote Adipozyten. Die Propidiumiodid-Färbung von 53 Tage alten SWAT-Kulturen und die Öl-Rot-O-Färbung von 51 Tage alten SWAT-Kulturen bestätigen, dass die Adipozyten auch zu fortgeschrittenen Zeitpunkten lebensfähig bleiben.

Die Immunzytochemie zeigt die angemessene erwartete Proteinexpression und Lokalisation reifer Adipozytenmarker innerhalb des SWAT, und die quantitative PCR zeigt die Expression wichtiger Adipozytengene auf transkriptioneller Ebene an. Die Bewertung der endokrinen Funktion von Basilikum deutet auf die Leptinsekretion von Basilikum aus den SWAT-Kulturen hin, wie sie mittels ELISA nachgewiesen wurde, und die Glycerinfreisetzung kann auch als Reaktion auf chemische Stimulation induziert werden. Die Xenotransplantation von SWAT-kultivierten Adipozyten zeigt deutlich sichtbare und leicht wiedergefundene Fettdepots 10 Tage nach der Transplantation, die sich für menschliche, aber nicht für Maus-Adipozytenmarker färben.

Einmal gemeistert, kann diese Technik in etwa fünf Stunden abgeschlossen werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Es ist wichtig, daran zu denken, das Primärgewebe schnell zu verarbeiten, um den Zelltod zu minimieren. Im Anschluss an dieses Verfahren können weitere Methoden wie quantitative Echtzeit-PCR, Immunfärbung oder funktionelle Assays durchgeführt werden, um zusätzliche Fragen darüber zu beantworten, wie Adipozyten auf verschiedene Medikamente oder Toxine reagieren.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie die SWAT-Kultur als stabile und zuverlässige Plattform für Ihre Fettforschung durchführen können. Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit primärem menschlichem Gewebe gefährlich sein kann und dass bei der Durchführung dieses Verfahrens immer Vorsichtsmaßnahmen wie das Tragen der richtigen PSA und der Umgang mit dem Gewebe unter Biosicherheitswerkbänken getroffen werden sollten.