Erkennung von Protein subzelluläre Lokalisation durch grüne Fluoreszenz Protein Tagging und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole Färbung in Caenorhabditis elegans
30. Juli 2018
Dieses Protokoll wird veranschaulicht, wie eine Protein nuklearen Translokation unter Hitzestress nachverfolgen mithilfe eine grüne Fluoreszenz-Protein (GFP)-Fusionsprotein als Marker und 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) Färbung. Das DAPI Färbeprotokoll rückt und bewahrt die GFP und Protein subzelluläre Lokalisation Signale.
Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen im Bereich der C.elegans, wie z.B. der Zellbiologie, zu beantworten. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie schnell und effizient ist, um Signale für Kernfärbung, GFP und subzelluläre Lokalisationsänderungen gleichzeitig zu erhalten. Generieren Sie zunächst ein extrachromosomales Array, das mit einem translationalen Konstrukt von Zielgenen ausgerichtet ist.
Alternativ können Sie solche Linien vom Caenorhabditis Genetic Center beziehen, das eine öffentliche Ressource für die C.elegans-Forschung ist. Oder aus einem zuvor veröffentlichten Forschungslabor. Nachdem Sie die Würmer Gammastrahlung ausgesetzt haben, um die extrachromosomalen Linien in das Genom zu integrieren, wählen Sie die stabil exprimierten Linien so aus, dass jedes Tier ein Markerprotein wie ein GFP oder eine Walze exprimiert.
Um Mutationen zu entfernen, die während der Bestrahlung entstehen, kreuzen Sie die Linien mindestens zweimal. Verwenden Sie die resultierende transgene Linie, um Veränderungen des Proteinexpressionsmusters unter Stress zu erkennen. Nachdem Sie die NGM-Wurmplatten gemäß dem Textprotokoll vorbereitet haben, streichen Sie einen OP50-Klon und kultivieren Sie die Bakterien über Nacht in flüssiger LB-Brühe.
Besäen Sie die NGM-Platten mit flüssiger OP50-Kultur und inkubieren Sie die Platten über Nacht in einem 37 Grad Celsius heißen Inkubator, um den Bakterienrasen als Nahrungsquelle für die Würmer anzubauen. Kühlen Sie die Platten vor Gebrauch mindestens 30 Minuten bei Raumtemperatur ab. Die transgene Linie wird mindestens zwei Generationen vor dem Hitzestress-Assay bei 20 Grad Celsius ohne Hunger gezüchtet.
Pflücken Sie acht bis zehn junge, trächtige erwachsene Tiere auf eine neue Wurmplatte. Lassen Sie sie dann etwa drei bis fünf Stunden lang Eier legen und nehmen Sie alle erwachsenen Tiere von den Tellern. Um die Würmer zu synchronisieren, lassen Sie die Eier schlüpfen und wachsen Sie die Larven etwa 48 Stunden lang bis zum vierten Larvenstadium oder L4.
Das erkennt man an der Vulva, bei der es sich um eine Halbmondstruktur handelt. Dann wird der Würmer hitzegestresst, indem man die Platten mit den L4-Larven zwei bis fünf Stunden lang bei 35 Grad Celsius inkubiert. Bauen Sie ein Thermometer in einen Inkubator ein, um die Temperatur genau zu messen.
Pipettieren Sie 10 Mikroliter M9 in die Mitte eines Objektträgers. Pflücken Sie dann hitzegeschockte Würmer und geben Sie sie in den Puffertropfen. Alternativ kannst du M9 verwenden, um die Würmer von der Platte zu waschen.
Zentrifugieren Sie dann die Probe eine Minute lang bei 1000-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur. Entsorge den Überstand und gib die Würmer in den Objektträger. Verwenden Sie unter einem Präpariermikroskop ein weiches Gewebe, um überschüssige Flüssigkeit abzulassen.
Geben Sie dann, noch unter dem Mikroskop, 10 Mikroliter 95%igen Alkohol auf die Würmer und beobachten Sie sie weiter. Unmittelbar nach dem Trocknen des Ethanols die Zugabe von Ethanol noch zwei Mal wiederholen. Es ist entscheidend für den Prozess, bei dem das Ethanol aus den Tieren unter dem Präpariermikroskop verdunstet.
Sobald sich das Ethanol von den Tieren löst, fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Geben Sie 10 Mikroliter DAPI zu den Würmern. Tragen Sie sofort einen Deckslip auf und versiegeln Sie den Slide mit transparentem Nagellack.
Nachdem Sie den Nagellack etwa 10 Minuten lang einwirken lassen, betrachten Sie die Tiere unter einem Fluoreszenzmikroskop. Um Tiere mit Aceton zu fixieren, waschen Sie die Hitzeschockplatte mit M9 ab und zentrifugieren Sie die Probe eine Minute lang bei 1000-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur. Entsorgen Sie den Überstand und verwenden Sie einen Milliliter destilliertes Wasser, um das Pellet zu waschen.
Nach Entfernen des Überstands werden 400 Mikroliter 30%iges Aceton zugegeben und die Probe 15 Minuten lang inkubiert. Dann zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 1000-facher Schwerkraft bei Raumtemperatur für eine Minute. Nachdem Sie den Überstand entsorgt haben, verwenden Sie 500 Mikroliter destilliertes Wasser, um die Tiere zweimal zu waschen.
Geben Sie 200 Mikroliter DAPI in das Pellet oder das Vierfache des Gesamtvolumens der Würmer in das Röhrchen und inkubieren Sie die Probe 15 Minuten lang. Die Probe wird zentrifugiert und der Überstand verworfen. Verwenden Sie dann 500 Mikroliter destilliertes Wasser, um das Pellet zweimal zu waschen, bevor Sie es wie zuvor montieren und abbilden.
Um die Bildgebung durchzuführen, schalten Sie die UV-Lichtquelle und das Fluoreszenzmikroskop ein. Schalten Sie dann den Computer ein, der mit dem Mikroskop verbunden ist. Laden Sie den Objektträger auf das Fluoreszenzmikroskop.
Verwende ein 10-fach-Objektiv, um die Würmer zu lokalisieren. Erhöhen Sie dann die Vergrößerungsleistung auf das 400-fache und fokussieren Sie sich auf die Probe. Öffnen Sie anschließend die mit dem Mikroskop gelieferte Software.
Klicken Sie auf Erfassung, dann auf Kamera und wählen Sie die Kamera aus, die an das Mikroskop angeschlossen ist. Klicken Sie unter derselben Erfassung auf Mehrdimensionale Erfassung. Daraufhin wird ein neues Navigationsfenster für die mehrdimensionale Erfassung geöffnet.
Klicken Sie auf die Schaltfläche "Mehrkanal" und alle verfügbaren Kanäle werden angezeigt. Wählen Sie Blau, Grün und DIC, um die Probe zu beobachten. Lassen Sie im Navigationsfenster Multidimensionale Erfassung die blauen DAPI-, grünen GFP- und grauen DIC-Kanäle eingeschaltet und klicken Sie mit der rechten Maustaste auf andere Kanäle, z. B. rotes Rhodamin und weißes Hellfeld, um sie zu schließen.
Um die Belichtungszeit für jeden Kanal zu messen, klicken Sie mit der linken Maustaste auf den blauen DAPI-Kanal, um ihn auszuwählen, und klicken Sie auf "Messen", um ein Live-Bild mit einer automatischen Belichtungszeit aufzunehmen. Passen Sie auf der linken Seite des Livebildfensters die Belichtungszeit bei Bedarf manuell an und klicken Sie dann auf OK. Richten Sie die Belichtungszeiten für die Kanäle GFP und DIC auf ähnliche Weise ein. Klicken Sie im Navigationsfenster "Multidimensionale Aufnahme" auf "Start", um automatisch drei Bilder unter den drei verschiedenen Kanälen zu sammeln, in der Reihenfolge mit den eingestellten Belichtungszeiten.
Um die Datei zu speichern, klicken Sie im Hauptmenü auf Datei, Speichern unter.Geben Sie den Dateinamen und den Ordner ein. Speichern Sie die Datei im Standarddateiformat, um die detaillierten Bildinformationen für zukünftige Referenzen beizubehalten. Um die Datei in andere Formate zu exportieren, klicken Sie unter Datei auf Exportieren.
Legen Sie den Dateinamen und den Ordner fest. Aktivieren Sie Projektordner erstellen", um die Daten besser zu organisieren. Nachdem Sie einen gewünschten Dateityp aus dem Dropdown-Menü ausgewählt haben, klicken Sie auf Start"zum Exportieren.
Es gibt zwei Chlorid-Intrazellulärkanal-Protein-Homologen in C.elegans, exl-1 und exc-4. Eine kürzlich durchgeführte Studie zeigte, dass exl-1 das Stressmanagement von Tieren reguliert. Hier wurde ein translationales exl-1 GFP-Konstrukt in ein tierisches Genom integriert und transgene Linien erzeugt, die stabil grün fluoreszierendes exl-1 exprimieren.
Unter Hitzestress reichert sich exl-1 GFP im Zellkern im Darmbereich an, da sich ein starkes GFP-Signal mit dem Zellkern überlappt. Um die subzelluläre Lokalisation von exl-1 zu bestätigen, wurde die DAPI-Färbung sowohl bei Ethanol- als auch bei Aceton-fixierten Tieren durchgeführt. Beide Methoden zeigen klare Zellkerne im tierischen Körper und die überlappenden GFP- und DAPI-Signale bestätigen, dass sich exl-1 GFP tatsächlich in den Zellkernen im Darmbereich angesammelt hat.
Einmal gemeistert, kann diese Technik in einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie eine schnelle Fixierung durchführen können, um das GFP-Signal und die nukleare Translokation des Proteins unter Stress in C.elegans zu erhalten.
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Übersicht
Dieses Protokoll zeigt, wie die nukleäre Translokation eines Proteins unter Hitzestress mithilfe eines GFP-Fusionsproteins als Marker und DAPI-Färbung verfolgt werden kann. Die Methode ist schnell und effizient und ermöglicht die gleichzeitige Beobachtung von Kernfärbung und Änderungen der subzellulären Lokalisation.
Wesentliche Studienkomponenten
Bereich der Wissenschaft
- Zellbiologie
- Neurowissenschaften
- Genetik
Hintergrund
- Das Verständnis der Proteinlokalisation ist entscheidend in der Zellbiologie.
- Hitzestress kann die Proteinttranslokation und -lokalisation beeinflussen.
- GFP-Fusionsproteine sind wertvolle Marker zur Verfolgung von Proteinen.
- Die DAPI-Färbung bietet eine Methode zur Visualisierung von Kernen.
Zweck der Studie
- Um die nukleäre Translokation von Proteinen unter Hitzestress zu verfolgen.
- Um GFP als Marker für die Proteinlokalisation zu verwenden.
- Um einen schnellen Protokollablauf für die DAPI-Färbung zu demonstrieren.
Verwendete Methoden
- Erzeugung extrachromosomaler Arrays mit translationsfähigen Konstrukten.
- Bestrahlung von C. elegans mit Gammastrahlung zur Integration.
- Auswahl stabil exprimierter Linien mit Markierungsproteinen.
- Gleichzeitige Beobachtung der nukleären und subzellulären Lokalisation.
Hauptergebnisse
- Erfolgreiche Verfolgung der nukleären Translokation unter Hitzestress.
- Effiziente Visualisierung der GFP- und DAPI-Färbung.
- Nachweis der Wirksamkeit des Protokolls in C.elegans.
- Gewonnene Erkenntnisse über die Dynamik der Proteinlokalisation.
Schlussfolgerungen
- Das Protokoll ist ein wertvolles Werkzeug zur Untersuchung der Proteindynamik.
- Schnelle und effiziente Methoden verbessern die Forschung in der Zellbiologie.
- Zukünftige Anwendungen könnten sich auf andere Stressbedingungen erstrecken.
Häufig gestellte Fragen
Ausführliche Bedeutung für die Industrie
Dieses Protokoll ermöglicht eine schnelle, antikörperfreie Verfolgung von Veränderungen in der subzellulären Lokalisation von Proteinen als Reaktion auf Stress und unterstützt die Validierung von Zielstrukturen in frühen Entwicklungsphasen. Durch die Kombination von GFP-Markierung mit DAPI-Färbung des Zellkerns liefert es quantitative, visuelle Bestätigung von Translokationsereignissen – wie beispielsweise die Anreicherung im Zellkern unter Hitzestress –, die zur mechanistischen Absicherung therapeutischer Hypothesen beitragen kann. Die Kompatibilität der Methode mit Standard-Fluoreszenzmikroskopen ermöglicht deren Einsatz in der Vorbereitung von Hochdurchsatz-Screenings sowie die Nutzung durch interdisziplinäre Teams in der biopharmazeutischen Forschung und Entwicklung.
Strategische Anwendungen in der Biopharma-Forschung und -Entwicklung
Frühe Entdeckung und Zielvalidierung
- Wissenschaftlicher Wert: Ermöglicht die direkte Beobachtung stressinduzierter Proteintranslokation und unterstützt so die funktionelle Zielvalidierung und die Untersuchung von Signalwegen.
- Operativer Wert: Macht Antikörper oder radioaktive Markierungen überflüssig und reduziert dadurch Zeit und Kosten der Assay-Entwicklung.
- Prädiktiver Wert: Bestätigt Verschiebungen der subzellulären Lokalisation, die auf einen Wirkmechanismus oder die Modulation der Stressantwort hindeuten können.
Screening und Assay-Entwicklung
- Assay-Bereitschaft: Erzeugt stabile transgene Linien, die GFP-markierte Proteine exprimieren, für konsistente und reproduzierbare Screening-Plattformen.
- Quantitative Ausgabe: Ermöglicht die gleichzeitige Messung des GFP-Signals und der kernständigen DAPI-Färbung zur Analyse der Kolokalisation.
- Skalierbarkeit: Kompatibel mit Standard-Fluoreszenzmikroskopie, wodurch eine Anpassung an Mehrfach-Well-Formate für die Substanz-Screening möglich ist.
Translationale und präklinische Forschung
- Krankheitsrelevanz: Verfolgt die Lokalisation von EXL-1, einem Protein der CLIC-Familie mit Säugetierhomologen (z. B. CLIC4), und unterstützt so die translationale Zielstruktur-Bewertung.
- Mechanistische Entwicklungsrisikominimierung: Bestätigt die nukleäre Translokation unter Hitzestress, jedoch nicht unter oxidativem Stress, und hilft dadurch, das bedingungsspezifische Verhalten der Zielstruktur zu definieren.
- Präklinische Kontinuität: Stellt ein wiederverwendbares System bereit, um Proteindynamik unter verschiedenen Stressbedingungen vor der Validierung in vivo zu untersuchen.
Pipeline- und Workflow-Integration
Diese Methode fügt sich in den Entdeckungsprozess von der Hypothesenprüfung zum Zielmolekül bis hin zur Identifizierung von Leitsubstanzen ein, insbesondere für stressreaktive Proteine. Sie unterstützt frühe Go/No-Go-Entscheidungen, indem sie die Zielmolekülbindung und subzelluläre Dynamiken vor Screening-Kampagnen mit Verbindungen validiert.
- Entdeckungsbiochemie: Überprüft therapeutische Hypothesen, indem Proteinlokalisierungsänderungen unter definierten Stressbedingungen sichtbar gemacht werden.
- Screening: Bereitet validierte zellbasierte Systeme für das Screening von Substanzbibliotheken mit integrierten Lokalisierungsanalysen vor.
- Analytik: Erzeugt Daten zur Ko-Lokalisation (Überlappung von GFP/DAPI) als quantitative Ausgabe zur Beurteilung der Wirkung von Substanzen auf den Proteintransport.
- Translationale Forschung: Verknüpft Befunde aus C. elegans mit Säugetiersystemen über konservierte CLIC-Proteine und unterstützt so die Zielvalidierung über Arten hinweg.
- Unternehmensweite Wiederverwendung: Etabliert eine modulare, wiederverwendbare Pipeline zur Verfolgung der subzellulären Dynamik beliebiger GFP-markierter Proteine unter Stress oder Substanzeinwirkung.
Operative und unternehmerische Auswirkungen
- Wissenschaftlicher Wert: Verringert mechanistische Unschärfen, indem direkte, visuelle Nachweise der Proteintanslokation in lebenden Zellen bereitgestellt werden.
- Operationaler Wert: Standardisiert Fixierungs- und Abbildungsprotokolle über verschiedene Teams hinweg, verbessert die Reproduzierbarkeit und reduziert Variabilität.
- Strategischer Wert: Beschleunigt die Zeiträume für die Zielvalidierung und ermöglicht eine schnellere Portfolio-Priorisierung, wodurch Investitionen in falsch-positive Zielstrukturen verringert werden.
- Portfolio-Implikation: Unterstützt die risikoadjustierte Weiterentwicklung, indem das Zielverhalten in krankheitsrelevanten Stressmodellen bestätigt wird.
Durchführungsaspekte
- Erfordert Fachkenntnisse im Umgang mit C. elegans, in der Erzeugung transgener Linien und in der Fluoreszenzmikroskopie.
- Setzt den Zugang zu einem Fluoreszenzmikroskop mit FITC- und DAPI-Filtern sowie Nomarski-Optik voraus.
- Erfordert die Standardisierung der Fixierung (Ethanol/Aceton) und der Färbungszeiten, um das GFP-Signal zu erhalten und eine konsistente DAPI-Kernmarkierung sicherzustellen.
- Die Anpassung an andere Modellsysteme kann eine Optimierung der Promotorstärke, der Markierungseffizienz und der Stressparadigmen erfordern.
- Praktische Einschränkung: Am besten geeignet für Proteine mit nachweisbarer Translokation; möglicherweise nicht in der Lage, schnelle oder vorübergehende Shuttle-Ereignisse ohne Live-Bildgebung aufzulösen.
