Name: Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Erfahren Sie die Live-Cell-Imaging-Methode zur Echtzeit-Visualisierung des TGF-β/Smad3-Signalwegs mit einem Adenovirus-Reporter-System in Krebszelllinien. Diese Technik ermöglicht nicht-invasive Spurenverfolgung zellulärer Signale.

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Diese Arbeit wurde unterstützt durch Zuschüsse aus dem National Health and Medical Research Council (NHMRC), H-JZ. TMBW ist ein Empfänger von Australien Postgraduate Award der australischen Regierung und der Ann Henderson Top-up Stipendium von australischen Rotary Gesundheit auf Partner mit Rotary Templestowe und Dine für eine Heilung.

Alle Tierversuche wurden von der University of Melbourne-Tier-Ethik-Kommission genehmigt.
Hinweis: Die Sequenz, Bau und Generation Protokoll für die adenovirale Vektoren pAd-CMV-Td-Tom, pAd-CMV-GFP und pAd-CAGA12- Luc/Td-Tom schon zuvor beschriebenen11,12, 13. Alle Vektoren sind im Handel erhältlich.
1. Virus-Titer-Bestimmung mit 50 % Gewebekultur infektiöse Dosis (TCID50)
<ol><li>Bereiten Sie 1 x 106 HEK293A Zellen in 10 mL DMEM + 10 % FBS Medien.</li>
	<li>Samen Sie 100 µL Zellsuspension in jede Vertiefung eine 96-Well flach-Boden Zellplatte Kultur.</li>
	<li>Bereiten Sie 1 mL einer 1: 100 Verdünnung des Virus bestand im kompletten Medium. Geben Sie 11 µL verdünnter Virus in jeder Spalte 1.</li>
	<li>10-divisibel Verdünnungsreihen direkt in den 96-well-Platte ausführen, indem 11 µL verdünnter Virus mit 100 µL Zellsuspension mischen, bis eine endgültige Verdünnung von 1 X1012 erreicht ist. Obwohl nicht-anhaftende Zellen zu diesem Zeitpunkt, die Anzahl der Zellen übertragen zwischen Brunnen bleibt konstant.</li>
	<li>Pipette 11 µL jeder Verdünnung in jeder Spalte, beginnend mit der höchsten Verdünnung von 104. Ersetzen Sie Pipettenspitzen mit jeder Verdünnung, Cross-Over aus Viruspartikel zu begrenzen.</li>
	<li>Spalte 12 11 µL virenfrei komplette Medien als Negativkontrolle hinzufügen.</li>
	<li>7-10 Tage bei 37 ° C mit 10 % CO2inkubieren Sie Platte.</li>
	<li>Zählen Sie unter Verwendung eines Mikroskops, die Anzahl der Bohrungen in jeder Spalte zeigt Anzeichen von zytopathischen oder zytotoxischen Wirkungen. Betrachten Sie eine sehr Positive, wenn Anzeichen einer Infektion vorhanden ist.</li>
	<li>Den Anteil der positiven Vertiefungen für jede Verdünnung mit Reed und Münch (1938) statistische Methode14zu berechnen.</li>
	<li>Berechnung der proportionalen Abstand (PD) mit: (A-50)/(A-B), wo A ist der Prozentsatz Antwort oben oder gleich 50 % und B reagiert die Prozentsatz unter 50 %.</li>
	<li>TCID50 mit zu berechnen: 10X-PD, wo X ist die Verdünnung eine Antwort größer als 50 %.</li>
	<li>Virale Titer von den folgenden berechnen: 0,69 / (0,011 X TCID50) PFU/mL</li>
</ol>(2) Adenovirus-MOI-Bestimmung
<ol><li>Samen 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 500 μL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung einer 12 gut Platte (35 % Zelle Konfluenz, 6 Brunnen insgesamt).</li>
	<li>Berechnen Sie die Volumen der Ad-CMV-Td-Tom Lager benötigt für 0, 250, 500, 2500 und 5000 MOI folgende Formel verwenden: MOI = (Volumen [μl] x PFU/μL) / Anzahl der Zellen. Für Ad-CMV-Td-Tom mit einem Titer von 1 x 1010 (PFU/mL), das Volumen der Virus-Infektion sind erforderliche MOIs 0, 3,75, 7,5, 37,5 und 75 μl.</li>
	<li>Pipettieren virale Lager direkt in die Vertiefungen mit guten Durchmischung, um die Zellen die berechneten Mengen an Ad-CMV-Td-Tom in Abschnitt 2.2 zu infizieren.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Entfernen Sie das Medium aus dem Brunnen und sofort behoben Sie werden die Zellen mit 500 μl 10 % Formalin für 5 Minuten.</li>
	<li>Aspirieren Sie Formalin aus Brunnen und waschen Sie Brunnen mit 500 μl PBS einmal.</li>
	<li>Führen Sie der Zellkern mit 500 μL der Hoechst-Lösung für 5 min zu Flecken.</li>
	<li>Entfernen Sie die Hoechst-Lösung und waschen Sie die Brunnen mit 500 μl PBS 3 Mal.</li>
	<li>Bild das Td-Tomate-Protein und Zellkern signalisieren mit 200 X Vergrößerung auf dem Fluoreszenzmikroskop. Td-Tomate-Proteins an 554 begeistern nm und der Hoechst-Farbstoff auf 352 nm.</li>
	<li>Analysieren von Bildern mit ImageJ um die Arbeiten zu bestimmen, die, das Moi für 100 % Infektion von Td-Tomaten15erforderlich.</li>
</ol>3. Dual-Adenovirus Transduktion in Live Einzelzellen
<ol><li>Samen 1.0-1.5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 500 μL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung einer 12 gut Platte (35 % Zelle Konfluenz, 2 Brunnen insgesamt).</li>
	<li>Zellen mit 75 μL der Ad-CMV-GLP infizieren (Titer = 5 x 109 PFU/mL) und 7,5 μl des Ad-CAGA12-Td-Tom (Titer = 5 x 1010 PFU/mL), eine 2.500 MOI 100 % Infektion Positivität erreichen zu erwirken.</li>
	<li>Zellen mit oder ohne 0,25 μl der TGF-β pro Bohrloch (10 mg/mL auf Lager, 5 ng/μl als die Endkonzentration) unmittelbar nach der Adenovirus-Infektion zu behandeln.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Bild lebenden Zellen mit Phase Kontrast Fluoreszenzmikroskop. Excite GFP bei 470 nm und Td-Tomate-Proteins an 554 nm.</li>
	<li>Beheben Sie Zellen zu und Flecken Sie Zellkern beschriebenen Schritte 1.6 - 1.9.</li>
	<li>Bild das Td-Tomate-Protein und Hoechst färben mit einem Fluoreszenzmikroskop. Begeistern die Hoechst-Farbstoff auf 352 nm.</li>
	<li>Verwendung von ImageJ, berechnen Sie der Prozentsatz der GFP und Td-Tomate positiven15Zellen.</li>
</ol>4. live einzelne Zelle Signalisierung Wundheilung im Test
<ol><li>Samen 4 bis 5 x 105 MDA-MB-231-Zellen mit 1 mL DMEM Nährmedien mit 5 %, die FBS in jede Vertiefung eines 6 gut Platte (50 % Zelle Konfluenz, 2 Brunnen insgesamt).</li>
	<li>Die Zellen mit 22,5 μL des Ad-CAGA12-Td-Tom infizieren (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Kratzen Sie zwei gekreuzte Linien auf der Zellschicht von jedem Bohrloch mit einer PIPETTENSPITZE P200.</li>
	<li>Die alten Medien vom Brunnen entfernen und ersetzen mit 2 mL frische 5 % FBS Medien mit oder ohne 0,5 μL der TGF-β pro Bohrloch (10 mg/mL auf Lager, 5 ng/μl als Endkonzentration).</li>
	<li>Die Platte im Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 5 min und nehmen Sie Bilder von ausgewählten Wunde Bereiche mit 100 X Vergrößerung auf dem Phase-Kontrast-Mikroskop.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Nehmen Sie Bilder von den Wundverschluss an den gleichen Stellen wie vor.</li>
	<li>Beheben Sie die Zellen zu, Färben Sie Zellkern beschriebenen Schritte 1.6 - 1.9 und visualisieren Sie Td-Tomate-Signal in das wundgebiet und nicht wundbereich mit 200 X Vergrößerung auf ein Fluoreszenzmikroskop zu.</li>
	<li>Den Anteil der Td-Tomate positive Zellen in die Wunde und nicht-wundbereich mit ImageJ Software15zu quantifizieren.</li>
</ol>5. in-vitro- Luciferase Assay
<ol><li>Bereiten Sie eine Zellsuspension von 3-5 x 104 MDA-MB-231-Zellen in 1 mL DMEM Medium mit 5 % FBS.</li>
	<li>Infizieren Zellsuspension mit 2,5 μL des Ad-CAGA12- Luc (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500).</li>
	<li>Samen der infizierten Zellen in einem 96 Platte auch bei 3.000 Zellen/100 µL/Well.</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Alte Medien aus Brunnen zu entfernen und ersetzen Sie durch 100 µL frische 5 % FBS Medien mit oder ohne 0,1 μL der TGF-β pro Bohrloch (1 mg/mL auf Lager, 1 ng/μl als die Endkonzentration) und das Vorhandensein oder Fehlen von 0,17 μL der TGF-β-Inhibitor pro Bohrloch (7 mg/mL auf Lager 12 ng/μl als Endkonzentration) (ein neuartiges TGF-β Liganden Falle Protein, Chen Et Al., unveröffentlichte Arbeit).</li>
	<li>Legen Sie die Platte in den Inkubator bei 37 ° C mit 10 % CO2 für 24 h.</li>
	<li>Die Luciferase Assay System Substrat tauen Sie auf und bereiten Sie 1 X Zelle Kultur Lyse-Reagenz in doppelt destilliertem Wasser (DDW zu).</li>
	<li>Entfernen Sie Medien aus den 96 Brunnen und lösen Sie Brunnen mit 50 μL der 1 X Zelle Kultur Lyse Puffer auf Eis mit einem Orbitalschüttler mit sanften Agitation für 30 min.</li>
	<li>30 μl der lysate aus jedem Brunnen in eine undurchsichtige Luciferase-Teller und die Platte auf Raumtemperatur erwärmen.</li>
	<li>Erstellen Sie auf dem Luminometer Software ein neues Protokoll. Wählen Sie für 1 Injektor mit Messungen vor und nach der Injektion. Messungen vor der Injektion auf 1 festgelegt s für Verzögerung bei der Messung und Integrationszeit. Für nach der Injektion Messung stellen Sie Injektionsvolumen 40 µL mit einer Verzögerung bei der Messung von 1 s nach der Injektion und 5 s Integrationszeit. Bestätigen Sie Einstellungen wählen Sie "OK".</li>
	<li>Legen Sie den Injektor-Schlauch in DDW und klicken Sie Injektor 1 unter den Prime -Einstellungen der Injektor Tube vor Gebrauch zu reinigen. Als nächstes Entfernen der Injektor-Röhre aus der DDW und in Luft, gefolgt von zwei weiteren Primzahlen des Injektors 1, all-Lösung aus der Tube zu spülen. Legen Sie den Injektor-Schlauch in Firefly Substrat und wieder Prime zweimal, um das Substrat zu bereiten.</li>
	<li>Legen Sie die undurchsichtige Luciferase-Platte mit den Proben in der Luminometer und wählen Sie Optionen der Software. Markieren Sie die Brunnen von Interesse und klicken Sie auf anwenden. Drücken Sie, um Luciferase Signal zu messen beginnen .</li>
	<li>Sobald Messungen abgeschlossen sind, abnehmen und die Platte mit Wasser ausspülen. Alle restlichen Substrat in den Injektor Rohr indem man das Rohr in die Luft und Prime Injektor 1 zurück in Firefly Substrat Rohr zu erholen. Legen Sie den Injektor-Schlauch in DDW und führen Sie zwei weitere Primzahlen um den Injektor Tube alle restlichen Substrat zu reinigen.</li>
</ol>6. Zelle Vorbereitung für Live Signalisierung Bildgebung In Vivo
<ol><li>48 Stunden vor der Tumor-Implantation, Samen 2-3 x 106 MDA-MB-231-Zellen in 175 cm2 Fläschchen (10 Flaschen insgesamt). Kulturzellen in 20 mL DMEM Medium mit 5 % FBS bei 37 ° C, 10 % CO2.</li>
	<li>24 h später hinzufügen 300 μL des Ad-CAGA12- Luc (Titer = 5 x 1010 PFU/mL, MOI = 2.500) in jedem Kolben. Halten Sie Zellen in der Kultur für ein weiteres 24 h.</li>
	<li>Am Tag der Implantation entfernen Sie die alten Medien und waschen Sie die Adenovirus infiziert Zellen einmal mit 20 mL PBS, pH 7.4. 2 mL 0,05 % Trypsin-EDTA in die Flasche und schütteln Sie die Flasche leicht um Trypsin, die Kolben Fläche zu ermöglichen. Legen Sie die Flasche in in den Inkubator 37 ° C, 10 % CO2 3 min.</li>
	<li>Die Trypsin durch Zugabe von 8 mL DMEM FBS-haltigen Medien in Fläschchen zu stillen. Übertragen Sie alle Zellsuspensionen in einer Glasflasche Reagenz.</li>
	<li>Zählen der Anzahl von Zellen mit einem Hemocytometer und 4,8 x 107 Zellen in zwei 50 ml Zentrifuge Röhren zu übertragen.</li>
	<li>Zentrifugieren Sie die Zellen bei 400 X g für 5 min bei RT entfernen Trypsin und Aufschwemmen Zellen in 720 mL frische FBS-DMEM Medien.</li>
	<li>Übertragen Sie die Zellsuspensionen in ein steriles 5 mL Röhrchen geben und 160 μl Matrigel (10 % insgesamt Matrigel Suspension).</li>
	<li>Bewahren Sie Zellen auf Eis bis Implantation.</li>
</ol>(7) Orthotopen Implantation
<ol><li>Wiegen Sie 12 SCID Mäuse und nach dem Zufallsprinzip zuordnen Sie Mäuse in Behandlung und Eindämmung der Gruppen (6 Mäuse/Gruppe zu).</li>
	<li>Führen Sie die Implantation in einem sterilen Bio-Schrank in einer sterilen Umgebung halten. Betäuben Sie die Maus mit 2,5-4,5 % Isofluran mit einer Sauerstoff-Durchfluss von 1 L/min statt der Maus auf ein Heizkissen und Tropfen Sie ein schmieren Augensalbe auf beiden Augen Hornhaut Schaden zu vermeiden. Befestigen Sie die Maus, um das Wärmekissen in Rückenlage, während Anästhesie beibehalten, indem man die Schnauze in einem Prüfkopf mit der Isofluran verbunden.</li>
	<li>Bestätigen Sie den Erfolg der Anästhesie durch den Mangel an Reaktion bis zu den Zehen Prise. Reduzieren Sie Isofluran auf eine Erhaltungsdosis von 1,5 bis 2,5 % mit 1 L/min Sauerstoff für die Erinnerung der Implantation.</li>
	<li>Reinigen Sie die Haut aus der vierten Brustwarze auf beiden Seiten der Mittellinie mit dem Wattestäbchen zu 80 % Ethanol getaucht.</li>
	<li>Finden Sie 4th Mamma Fettpolster durch Abtasten zu, und drücken Sie die Fettpolster, die das Gewebe weiter aussetzen.</li>
	<li>Mischen Sie die Zellsuspension gut durch pipettieren rauf und runter. Sanft 50 µL der Zelle Mischung in eine 27G Insulin Spritze Aspirieren und injizieren in die Mamma Fettpolster auf beiden Seiten der Maus.</li>
	<li>Bestätigen Sie eine erfolgreiche Injektion durch Abtasten Schwellung der Fettpolster. Lassen Sie die Fettpolster sanft und platzieren Sie die Maus zurück in den Käfig.</li>
	<li>Lassen Sie die Käfige auf das Wärmekissen für mindestens 30 min um die Mäuse zu gewinnen Bewusstsein und legen Sie dann die Käfige zurück in die Holding-Zimmer für 3 Tage zu ermöglichen.</li>
</ol>8. IVIS Imaging
<ol><li>Öffnen Sie die Living Image -Software.</li>
	<li>Initialisieren Sie das IVIS System Initialisieren IVIS System klicken Sie auf das Control Panel. Warten Sie, bis die Temperatur Zeichen auf grün schaltet.</li>
	<li>Wählen Sie die lumineszierenden Imaging-Modus auf dem Bedienfeld.</li>
	<li>Isofluran-Narkose auf die Kammer und IVIS System einschalten.</li>
	<li>Betäuben Sie die Mäuse mit 2,5-4,5 % Isofluran mit 1 L/min Sauerstoff. Einmal betäubt, Set Isofluran mit 1,5-2,5 % für die Wartung. Injizieren Sie 150 mg/kg Körpergewicht von D-Luciferin in Mäusen durch intraperitoneale (i.p.) Injektion.</li>
	<li>Sofortüberweisung Mäuse in das IVIS-System, legen Sie sie auf die temperaturgeführte imaging Plattform und platzieren Sie ihre Nase in die bugnase.</li>
	<li>Klicken Sie auf die Sequenz Setup -Taste auf dem Bedienfeld, und wählen Sie Medium Binning.</li>
	<li>Richten Sie die bildgebenden Belichtungszeit wie folgt: 10 s, 20 s, 30 s, 60 s und 120 s. Beginn ca. 3 min nach der Injektion von Luciferin imaging und weiterhin Bild, bis das Signal zu fallen beginnt (normalerweise dauert dies ca. 20 min).</li>
	<li>Die Mäuse aus IVIS unter Beibehaltung Isofluran-Narkose durch eine Nase Kegel und behandeln Sie die Mäuse mit 50 µL PBS oder 50 µL TGF-β Signalisierung Inhibitor (50 μg/Tumor) mittels Intra-Tumor-Injektion zu.</li>
	<li>Legen Sie die Mäuse wieder in den Käfig und lassen Sie sie auf das Wärmekissen für mindestens 30 Minuten. Dann legen Sie den Käfig zurück in den Raum halten.</li>
	<li>IVIS bildgebende Verfahren, wie beschrieben, am Tag nach der Behandlung zu wiederholen.</li>
</ol>9. die Datenanalyse
<ol><li>Offene Dateien in Living Image -Software gespeichert.</li>
	<li>Finden Sie die Bildinformationen mit Ansicht | Bildinformationen.</li>
	<li>Wählen Sie Fotos zu einem ähnlichen Zeitpunkt mit der gleichen Belichtungszeit aufgenommen. Laden Sie Fotos als Gruppe.</li>
	<li>Deaktivieren Sie das einzelne Feld im Bild anzupassen , um die Intensität zu normalisieren.</li>
	<li>Wählen Sie Photon -Modus, um die Intensität zu analysieren. Quantifizieren Sie die Intensität des Signals durch die Region von Interesse (ROI) -Schaltfläche im ROI-Tools.</li>
	<li>Ziehen Sie den ROI-Kreis in der Region, die biolumineszente Signal enthält und klicken Sie auf Messen , um die Signalstärke zu erwerben.</li>
</ol>

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</ol>

Die Autoren Berichten keine Interessenkonflikte.

Wir entwickelten eine Technik, um Echtzeit-Bildgebung der TGF-β/Smad3 Signalisierung im einzigen lebenden Zellen zu ermöglichen. Mit dieser neuartigen Methode haben wir zuvor eine Subpopulation von Zellen mit dynamischen TGF-β/Smad3 transkriptionelle Aktivität identifiziert, die mit verstärkten Invasion und Migration8verbunden war. Diese Methode verbessert auf traditionelle Assays für die TGF-β-Signalisierung, wie westliche Flecken der Smad3 Phosphorylierung und TGF-β gezielt Genexpression, durch ...

Transforming Growth Factor β (TGF-β) ist eine wesentliche Zytokin verwickelt in der menschlichen Entwicklung, das signalisiert durch ein heterodimerisierenden Komplex bestehend aus Typ II und Typ-I-Rezeptoren1. Bindung an II Rezeptor Typ Ergebnisse bei der Rekrutierung und Phosphorylierung von Typ I-Rezeptor, der wiederum nachgelagerten Smad2/3 Proteine2,3phosphorylates. Diese aktiviert Smad2/3 Proteine binden an Smad4, bilden einen Komplex, der translocates in den Zellkern und reguliert gen Transkription4. Homöostatische Bedingungen TGF-β/Smad-Signalisierung ist streng reguliert; jedoch bei vielen Krankheiten der Signalweg ist dereguliert und häufig überexprimiert führende bis zum Fortschreiten der Erkrankung5,6,7. Jüngste Studien haben gezeigt, dass zelluläre Reaktion, TGF-β heterogen ist und Subpopulationen von TGF-β/Smad aktiven Zellen verantwortlich für die biologische Funktion in einem Zeit-abhängigen Weise8,9 sind. Gemeinsame zelluläre Analyse der TGF-β/Smad-Signal beinhaltet die Verwendung von festen Endpunkt-Assays, die bieten nur einer Momentaufnahme der Zellaktivität und oft quantitate die durchschnittliche TGF-β/Smad-Effekt10. Diese Methoden können jedoch nicht genau die molekulare Verhalten der TGF-β/Smad-Signal in den physiologischen Zustand während der Progression der Erkrankung darstellen. Image-basierte Analyse von lebenden Zellen erfassen die Dynamik zellulärer und biologische Prozesse mit einem räumlichen und zeitlichen Verständnis.
Unser Ziel war es, eine empfindliche Hochdurchsatz-Methode für das live Cell Imaging der TGF-β/Smad Signalisierung mit Adenovirus-basierte Reagenzien zu entwickeln. Hier infiziert wir die menschliche Brust-Krebs-Zell-Linie MDA-MB-231 mit ein Adenovirus auszudrücken Smad3 CAGA Motiv Bindung Sequenz und eine Luciferase (Luc) oder Td-Tomate (Td-Tom) Reporter-gen. Adenoviralen Reporter-Systeme bieten eine schnelle und billige Methode für Plasmid-Einführung, die eine 100 %-Infektionsrate in Krebs-Zell-Linien führen können. Adenoviralen Reporter Systeme wurden auch erfolgreich auf Zell-Linien angewendet, die schwer mit herkömmlichen Plasmid11transfizieren sind. In diesem Protokoll beschreiben wir ein reproduzierbar und nicht-invasive Verfahren zur live Cell Imaging von TGFβ/Smad-Signalweg zu erreichen in Vivo und in Vitro.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>ThermoFisher</td><td>1881024</td><td>Warm in 37°; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Scientifix Life</td><td>FBS500-S</td><td>Vor Gebrauch Hitze inaktiviert</td></tr><tr><td>Rekombinant Human TGF-&beta; 1</td><td>PEPROTECH</td><td>100-21</td><td>Aliquot in DDW zur Erzielung einer Endkonzentration bei 10 mg/ml</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5117</td><td>Verdünnung in PBS zur Endkonzentration bei 1 μa; L/mL</td></tr><tr><td>Luciferase Reporter Assay Kit</td><td>Promega</td><td>197897</td><td>Vor Gebrauch 5x in PBS verdünnen</td></tr><tr><td>Luminometer</td><td>Promega</td><td>9100-002</td><td></td></tr><tr><td>Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskopie</td><td>OLYMPUS</td><td>IX50</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>VivoGl Luciferin</td><td>Promega</td><td>P1041</td><td></td></tr><tr><td>IVIS Lumina III In Vivo Bildgebungssystem</td><td>PerkinElmer</td><td>CLS136334</td><td></td></tr><tr><td>0,5 % Trypsin-EDTA (10x)</td><td>ThermoFisher</td><td>15400-054</td><td>Diltue auf 0,05 % (1x) in PBS</td></tr><tr><td>Zellkulturlyse 5x Reagenz</td><td>Promega</td><td>E153A</td><td>Verdünnung auf 1x in DDW</td></tr><tr><td>10 % Formalin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F5554-4L</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293A</td><td>ThermoFisher</td><td>R70507</td><td></td></tr><tr><td>MDA-MB-231</td><td>ATCC</td><td>CRM-HTB-26</td><td></td></tr><tr><td>PRKDC-SCID</td><td>Animal Resources Centre</td><td>SCIDF6</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Isofluran</td><td>Zoetis</td><td>26675-46-7</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>Chem-supply</td><td>EA043-10L-P</td><td></td></tr><tr><td>Refresh Night Time</td><td>Allergan</td><td>1750D</td><td>Gleitende Augensalbe</td></tr><tr><td><stark>Lösung</stark></td><td></td><td></td><td><stark>Zusammensetzung</stark></td></tr><tr><td>Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS)</td><td></td><td></td><td>NaH2PO4.2H2O (4 mM); NaHPO4 (16 mM); NaCl (0.12M)</td></tr><tr><td>FBS-DMEM&nbsp;</td><td></td><td></td><td>5 % hitzeinaktiviertes FBS; 10 &mu; g/ml Penicillin; 100 &mu; g/mL Streptomycin</td></tr></tbody></table>

live cell imaging der tgf-β/smad3 signalisierung pathway in vitro und in vivo mit einem adenovirus-reporter-system

Live Cell Imaging of the TGF-	&beta;/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System

Transforming Growth Factor β (TGF-β) Signalisierung regelt viele wichtige Funktionen, die für die zelluläre Homöostase erforderlich und wird im allgemeinen gefunden in vielen Krankheiten, einschließlich Krebs überexprimiert. TGF-β ist stark in Metastasen während späten Stadium Krebs Fortschreiten, impliziert eine Teilmenge der Zugvögel und invasive Tumorzellen zu aktivieren. Aktuelle Methoden zur Signalisierung Pathway Analyse konzentrieren sich auf Endpunkt-Modelle, die oft versuchen, Signalisierung Post-hoc- des biologischen Ereignisses zu messen und spiegeln nicht die progressive Natur der Krankheit. Hier zeigen wir eine neuartige Adenovirus Reporter System speziell für die TGF-β/Smad3 Signalweg, die transkriptionelle Aktivierung in lebenden Zellen erkennen kann. Mit Hilfe eines Ad-CAGA12-Td-Tom -Reporter, erreichen wir eine 100 %-Infektionsrate von MDA-MB-231 Zellen innerhalb von 24 h in Vitro. Die Verwendung von fluoreszierenden Reporter ermöglicht für die Darstellung von live Einzelzellen in Echtzeit mit direkten Identifizierung von transcriptionally aktiven Zellen. Stimulation der infizierten Zellen mit TGF-β zeigt nur einen Teil der Zellen, die transcriptionally aktiv und spezifischen biologischen Funktionen beteiligt sind. Dieser Ansatz ermöglicht hohe Spezifität und Sensitivität auf eine einzelne Zellenebene das Verständnis biologischer Funktionen im Zusammenhang mit TGF-β Signalisierung in Vitrozu fördern. Smad3 transkriptionelle Aktivität auch kann berichtet in Vivo in Echtzeit durch die Anwendung eine Ad-CAGA12- Luc Reporter. Ad-CAGA12- Luc in der gleichen Weise wie herkömmliche stabil transfizierten Luciferase-Zell-Linien gemessen werden. Smad3 transkriptionelle Aktivität der implantierten Zellen in Vivo werden durch konventionelle IVIS Bildgebung analysiert und live während der Tumorprogression, einzigartige Einblicke in die Dynamik der TGF-β-Signalweg überwacht. Unser Protokoll beschreibt eine vorteilhafte Reporter-Delivery-System ermöglicht schnelle Hochdurchsatz-Bildgebung live Zelle Signalwege in Vitro und in Vivo. Diese Methode kann zu einer Reihe von bildbasierte Assays und Geschenke als sensibel und reproduzierbare Ansatz für grundlegende Biologie und therapeutische Entwicklung erweitert werden.

Einzelne Zelle in Vitro imaging zu leben
Um die Aktivierung von TGF-β/Smad-Signalisierung in Einzelzellen mit Adenoviren basierte Reagenzien genau zu beurteilen, ist es wichtig, zunächst die optimale Multiplizität der Infektion (MOI) für jede Zelllinie zu bestimmen. Die optimale MOI wird bestimmt, wenn 100 % der Zellen für adenovirale Infektion ohne vorliegende zytopathischen oder zytotoxische Effekte positiv sind. Um dies...

Hier präsentieren wir Ihnen ein Protokoll für das live Cell Imaging von TGF-β/Smad3 Signalisierung Aktivität mit einem Adenovirus-Reporter-System. Dieses System verfolgt transkriptionelle Aktivität in Echtzeit und kann angewendet werden, um sowohl einzelne Zellen in Vitro und in lebenden TierenModelle.

Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System

Transforming Growth Factor &#946; (TGF-&#946;) signaling regulates many important functions required for cellular homeostasis and is commonly found ...

Diese Methode kann Schlüsselfragen im Bereich der zellulären Signalübertragung beantworten, indem sie die zelluläre Signalübertragung nichtinvasiv in Echtzeit verfolgt. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass Adenovirus-Systeme eine schnelle und einfache Methode zum Nachweis von Zellsignalen bieten, mit der eine Infektionsrate von 100 % in Krebszelllinien erreicht werden kann. Die Implikationen dieser Technik erstrecken sich auf die therapeutische Entwicklung von Krebserkrankungen und können auf andere Signalwege ausgeweitet werden.Obwohl diese Methode Einblicke in Brustkrebsmodelle geben kann, kann sie auch auf andere Krebsarten wie Gehirn, Knochen und Lunge angewendet werden. Am Tag der Adenovirus-Infektion besäen Sie die Vertiefungen einer 12-Well-Platte mit etwa 1,25 mal 10 bis fünften MDA-MB-231-Zellen in 500 Mikroliter Medium für eine Konfluenz von 35 %Infizieren Sie die Zellen in allen Vertiefungen mit 75 Mikrolitern Adenovirus-CMV-GFP und 7,5 Mikrolitern Adenovirus CAGA12-Td-Tomato, um eine 2.500 MOI zu erhalten, die eine 100%ige Infektionspositivität erreichen kann. Fügen Sie dann TGF-beta unmittelbar nach der Adenovirus-Infektion zur Behandlungsvertiefung hinzu.Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 10 % Kohlendioxid. Am nächsten Tag bilden Sie lebende Zellen mit einem Phasenkontrast-Fluoreszenzmikroskop ab. Nach dem Fixieren der Zellen und dem Färben der Zellkerne mit dem Hoechst-Farbstoff wird das TD-Tomato-Protein und die Hoechst-Färbung mit einem Fluoreszenzmikroskop abgebildet.Berechnen Sie nach der Bildgebung aller Wells den Prozentsatz der GFP- und Td-Tomato-positiven Zellen mit ImageJ. Für den Wundheilungstest beginnen Sie damit, die Vertiefungen einer Sechs-Well-Platte mit etwa 4,5 mal 10 bis den fünften MDA-MB-231-Zellen in einem Milliliter Medium zu bepflanzen, um am Tag der Infektion eine Konfluenz von 50 % zu erreichen. Infizieren Sie die Zellen mit 22,5 Mikrolitern Adenovirus CAGA12-Td-Tomate und legen Sie die Platte dann 24 Stunden lang bei 37 Grad Celsius mit 10% Kohlendioxid in den Inkubator.Kratzen Sie nach 24 Stunden mit einer P200-Pipettenspitze zwei gekreuzte Linien auf die Zellschicht jeder Vertiefung. Nehmen Sie das Medium aus den Vertiefungen und behandeln Sie es wie zuvor gezeigt mit TGF-beta, dann stellen Sie die Platte fünf Minuten lang bei 37 Grad Celsius und 10 % Kohlendioxid in den Inkubator. Nach fünfminütiger Inkubation nehmen Sie Bilder ausgewählter Wundbereiche mit 100-facher Vergrößerung an einem Phasenkontrastmikroskop auf, bevor Sie die Platte wieder in den Inkubator einsetzen.Machen Sie 24 Stunden später Phasenkontrastbilder von denselben Bereichen, um den Wundverschluss zu beurteilen. Nachdem Sie die Zellen fixiert und die Zellkerne gefärbt haben, visualisieren Sie das Td-Tomato-Signal im Wundbereich und im nicht gewundeten Bereich mit 200-facher Vergrößerung an einem Fluoreszenzmikroskop. 48 Stunden vor der Tumorimplantation etwa 2,5 mal 10 bis sechste MDA-MB-231-Zellen in 10 175-Quadratzentimeter-Kolben aussäen.Nach 24 Stunden in Kultur geben Sie 300 Mikroliter Adenovirus CAGA12-Luciferase in jeden Kolben, bevor Sie die Zellen für weitere 24 Stunden in den Inkubator zurückbringen. Entfernen Sie am Tag der Implantation das alte Medium und waschen Sie die mit Adenoviren infizierten Zellen einmal mit 20 Millilitern PBS. Geben Sie zwei Milliliter 0,05%Trypsin-EDTA in den Kolben und schütteln Sie den Kolben leicht, damit Trypsin die gesamte Kolbenoberfläche bedeckt.Inkubieren Sie drei Minuten lang bei 37 Grad Celsius und löschen Sie dann das Trypsin, indem Sie acht Milliliter FBS-haltiges DMEM-Medium in die Kolben geben. Alle Zellsuspensionen werden in eine Reagenzflasche aus Glas überführt. Zählen Sie die Zellzahl mit einem Hämozytometer.Danach werden die sieben Zellen mit 4,8 mal 10 in 250-Milliliter-Zentrifugenröhrchen umgefüllt und die Zellen fünf Minuten lang bei Raumtemperatur mit 400 g zentrifugiert. Nach der Zentrifugation werden die Zellen in 720 Mikrolitern frischem Medium wieder suspendiert und in ein Fünf-Milliliter-Röhrchen überführt. Fügen Sie dann Medium hinzu, das 10% Matrigel enthält, um die Zellsuspension auf dreimal 10 bis sechste Zellen pro 50 Mikroliter zu verdünnen.Die Zellsuspension in ein steriles Fünf-Milliliter-Röhrchen überführen und bis zur Implantation auf Eis halten. Wiegen Sie 12 SCID-Mäuse und verteilen Sie die Mäuse nach dem Zufallsprinzip gleichmäßig auf Kontroll- und Behandlungsgruppe. Nachdem Sie die Maus betäubt haben, geben Sie einen Tropfen befeuchtende Augensalbe auf beide Augen, um Hornhautschäden zu vermeiden, befestigen Sie die Maus dann an einem Wärmekissen in einem sterilen Bioschrank und halten Sie die Narkose aufrecht, indem Sie die Schnauze in einen Nasenkonus stecken, der mit dem Isofluran verbunden ist.Bestätigen Sie den Erfolg der Anästhesie durch die fehlende Reaktion auf ein Zehenklemmen. Reduzieren Sie das Isofluran für den Rest der Implantation auf eine Erhaltungsdosis. Verwenden Sie als Nächstes ein in 80%iges Ethanol getauchtes Wattestäbchen, um die Haut von jeder vierten Brustwarze bis zur Mittellinie zu reinigen.Finden Sie das vierte Brustfettpolster durch Abtasten und drücken Sie das Fettpolster zusammen, um das Gewebe weiter freizulegen, und mischen Sie dann die Zellsuspension, indem Sie auf und ab pipettieren. 50 Mikroliter Zellmischung vorsichtig in eine 27-Gauge-Insulinspritze aspirieren und in das Brustfettpolster injizieren. Bestätigen Sie eine erfolgreiche Injektion und lösen Sie das Fettpolster sanft.Setzen Sie die Maus wieder in den Heimkäfig ein. Nachdem die Mäuse wieder zu Bewusstsein gekommen sind, bringen Sie den Käfig für drei Tage in den Haltungsraum zurück, bevor Sie mit der IVIS-Bildgebung fortfahren. Lebende MDA-MB-231-Zellen wiesen trotz 100%iger Infektion unterschiedliche Niveaus der Td-Tomato-Expression auf, wie die GFP-Expression zeigte, was auf eine heterogene Aktivierung der TGF-beta-abhängigen Smad3-Transkription in allen Zellen hinweist.Die Analyse fixierter Zellen zeigte erneut eine 100%ige GFP-Expression, während nur etwa 26% der Zellen 24 Stunden nach TGF-beta-Stimulation ohne TGF-beta-Stimulation eine nachweisbare TGF-beta/Smad3-Transkriptionsaktivität zeigten, verglichen mit einer 0%-Positivitätsbehandlung. Im Wundheilungsassay zeigten MDA-MB-231-Zellen, die mit dem Adenovirus CAGA12-Td-Tomate infiziert waren, ein normales Migrationsverhalten und Zellen, die mit TGF-beta behandelt wurden, einen verstärkten Wundverschluss. Bemerkenswert ist, dass etwa 62 % der Zellen im Wundbereich eine positive TGF-beta-abhängige Smad3-Transkriptionsaktivität aufwiesen, was signifikant höher ist als im nicht verwundeten Bereich nach TGF-beta-Behandlung.Das Adenovirus-CAGA12-Luciferase-Reagenz wurde in einem Tiermodell mit orthotoper Implantation von Brusttumoren getestet. Sowohl die Kontrollgruppe als auch die mit TGF-beta-Inhibitoren behandelte Gruppe zeigten vor der Behandlung eine ähnliche CAGA12-Luciferase-Reporteraktivität. In der Kontrollgruppe veränderte sich das Luciferase-Signal nach der PBS-Behandlung jedoch nicht, während Mäuse, die mit dem TGF-beta-Hemmer behandelt wurden, eine etwa dreifache Signalreduktion zeigten.Einmal gemeistert, kann diese Technik in weniger als einer Stunde durchgeführt werden, wenn sie richtig ausgeführt wird. Wenn Sie dieses Verfahren versuchen, ist es wichtig, daran zu denken, dass zu hohe Mengen an Adenoviren zytotoxische und zytopathische Wirkungen haben können, die die Genauigkeit Ihrer Ergebnisse beeinträchtigen können. Nach diesem Verfahren kann dieses System erweitert werden, um mehrere Signalwege gleichzeitig zu analysieren, um zusätzliche Fragen im Zusammenhang mit der Zellsignalübertragung zu beantworten.Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher auf dem Gebiet der Signalübertragung von Krebszellen, um das Tumorprogressionsverhalten in Brustkrebsmodellen zu untersuchen.

live-cell-imaging-tgf-smad3-signaling-pathway-vitro-vivo-using-an

Research

Forschung

JoVE Journal

Cancer Research

Krebsforschung

Mit dem wachsenden Interesse an Stammzelltherapien, sind molekulare Bildgebungsverfahren ideal für die Überwachung Stammzellen Verhalten nach der Transplantation. Luciferase Reporter Gene nicht-invasive, repetitive Beurteilung der das Überleben der Zelle, den Standort und Verbreitung in vivo ermöglicht. Dieses Video wird gezeigt, wie man hESC Proliferation in einer lebenden Maus zu verfolgen.

In vitro und in vivo Biolumineszenz Reporter Gene Imaging von humanen embryonalen Stammzellen

In diesem Video verwenden wir ein Adenovirus Durchführung der Cre-Rekombinase-Gen zur primären embryonalen Maus-Fibroblasten Tragen einer floxed Rac1 Allel zu infizieren.

Adenovirus-vermittelte genetische Entfernung von Signalmolekülen in kultivierten primären embryonalen Maus-Fibroblasten

Hier beschreiben wir die Methoden zu konstruieren, zu visualisieren und zu quantifizieren Biolumineszenzreaktionen sowohl Glühwürmchen und Renilla Luciferase Enzymen bei metastasierendem Brustkrebs-Zellen während deren Wachstum und Metastasierung...

In vivo Dual-Substrat Bioluminescent Imaging

Ein Test zur quantitativen Messung Transforming Growth Factor (TGF)-β-induzierte Invasion im 3-dimensionalen Kollagen-Gelen beschrieben. Dieser Assay nutzt die MCF10A Reihe von Zelllinien, die verschiedenen Stadien der Entwicklung von Brustkrebs darstellen. Diese Methode kann angenommen, um mit anderen Zelllinien verwendet werden und könnte verwendet werden, um andere potenzielle Aktivatoren oder Inhibitoren der Invasion zu untersuchen sein.

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Source: Chen, H. et. al. Live Cell Imaging of the TGF-β/Smad3 Signaling Pathway In Vitro and In Vivo Using an Adenovirus Reporter System. J. Vis. Exp. (2018)This video demonstrates the preparation of luciferase-expressing breast cancer cells using recombinant adenoviruses for in vivo imaging.

Preparation of Reporter-Expressing Cancer Cells for In Vivo Imaging

Wir beschreiben eine Methode für Depletion-Rescue-Experimente, die die zelluläre Integrität und Proteinhomöostase bewahrt. Die Adenofektion ermöglicht funktionelle Analysen von Proteinen innerhalb biologischer Prozesse, die auf fein abgestimmter Aktin-basierter Dynamik beruhen, wie z. B. mitotische Zellteilung und Myogenese, auf Einzelzellebene.

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Live Verfolgung einzelner WT retinalen Progenitoren in verschiedenen genetischen Hintergründen ermöglicht die Bewertung des Beitrags der Zelle nicht autonomen Signalisierung während der Neurogenese. Hier wird eine Kombination von Knock-Down, Chimäre Generation über Embryo - Transplantation und in - vivo - Zeitraffer-konfokale Abbildung wurde für diesen Zweck verwendet.

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Ein Protokoll für in-vitro- Induktion von endothelial-Mesenchymale Transition (EndMT), die nützlich für die Untersuchung von zelluläre Signalwege an EndMT beteiligt ist, wird beschrieben. In diesem experimentellen Modell ist EndMT durch Behandlung mit TGF-β in MS-1 Endothelzellen induziert.

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Morphologische Veränderungen treten in immunreagierenden Fibroblastenzellen nach aktivierung auf und fördern Veränderungen bei der Zellrekrutierung. Verwendung von 2-Photonen-Bildgebung in Verbindung mit einem gentechnisch veränderten Fibroblasten-spezifischen Protein 1 (FSP1)-cre; tdTomato floxed-stop-floxed (TB/TB) Mauslinie und grün fluoreszierend markiert Lipopolysaccharid-FITC, können wir hochspezifische Aufnahme von Lipopolysaccharid in dermalen Fibroblasten und morphologischen...

In Vivo Zwei-Farben 2-Photon Enzgebung von genetisch markierten Reporterzellen in der Haut

Wir beschreiben einen systematischen Workflow zur Untersuchung der TGF-β Signalisierung und tGF-β-induzierten EMT, indem wir die Protein- und Genexpression untersuchen, die an diesem Signalweg beteiligt sind. Die Methoden umfassen Western Blotting, ein Luziferase Reporter Assay, qPCR, und Immunfluoreszenz Färbung.

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Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Erfahren Sie die Live-Cell-Imaging-Methode zur Echtzeit-Visualisierung des TGF-β/Smad3-Signalwegs mit einem Adenovirus-Reporter-System in Krebszelllinien. Diese Technik ermöglicht nicht-invasive Spurenverfolgung zellulärer Signale.

Live Cell Imaging der TGF-β/Smad3 Signalisierung Pathway In Vitro und In Vivo mit einem Adenovirus-Reporter-System

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