Name: Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-20T15:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 50 s
Description: Lernen Sie die Live-Cell-Imaging-Methode mit FITC-Dextran als Reporter zur Unterscheidung verschiedener Exozytose-Modi in Mastzellen kennen. Dieses einfache Verfahren ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung regulierter Sekretionsprozesse mit minimaler Zellstörung.

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Wir danken Dr. U. Ashery für das großzügige Geschenk von cDNA. Wir danken Dr. G. Masse, L. Mittleman, M. Shaharbani und Y.Zilberstein vom Sackler Cellular & Molecular Imaging Center für ihre unschätzbare Hilfe für Mikroskopie. Diese Arbeit wurde unterstützt durch die Vereinigten Staaten und Israel binationale Wissenschaftsstiftung (Grant 2013263 R. Sagi-Eisenberg, I. Hammel und S.J.Galli) und 933/15 zu gewähren, die Israel Science Foundation, gegründet von der Israel-Akademie für Wissenschaften (zu R.Sagi-Eisenberg ) und NIH-Stipendien U19 AI 104209 und R01 AR067145 (, S.J. Galli).

1. Vorbereitungen
<ol><li>Vorbereitung der RBL Nährmedien<ol>
<li>Mix 500 mL niedrige Glukose Dulbecco geändert Adlers Medium (DMEM) mit 56 mL fetalen bovine Serum (FBS), 5,5 mL Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung, 5,5 mL L-Glutamin 200 mM Lösung. Dies führt zu niedrigen Blutzucker DMEM mit 10 % FBS, 100 µg/mL Streptomycin, 100 Einheiten/mL Penicillin, 12 Einheiten/mL Nystatin und 2 mM L-Glutamin ergänzt.</li>
		<li>Filtermedien Sie die mit einem Top-Vakuum-Filter von 0,22 µm Porengröße und Store bei 4 ° c</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wartung von RBL-Zellen.<ol>
<li>Wachsen Sie RBL-Zellen auf eine maximale Konfluenz von 90 % in einer 10 cm Petrischale. Wenn die Zellkultur gesund ist, sollten die Zellen eine Spindel Form mit gelegentlichen Vorsprünge aufweisen.</li>
		<li>Lösen Sie für Zelle aufteilen die Zellen aus der Schale durch Absaugen der Medien und ersetzt mit 2 mL Trypsine/EDTA Lösung B. Incubate für 5-10 Minuten in eine feuchte Atmosphäre 5 % CO2 bei 37 ° C.</li>
		<li>Sobald die Zellen getrennt haben, neutralisieren die Trypsin durch Zugabe von 2 mL von Nährmedien, mit einer Pipette und Teilen von Zellen in einer 1:2-1:10-Verhältnis.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung von 20 x Tyrode Puffer<ol>
<li>Bereiten Sie ein Lager 20 x 54 mM KCl-Lösung, 20 mM MgCl2, 2,74 M NaCl und 8 mM NaH2PO4 in doppelt destilliertem Wasser (DDW). Gut mischen und bei 4 ° c Lagern</li>
	</ol>
</li>
</ol>(2) Kultur der RBL-Zellen für Live Cell Mikroskopie
<ol><li>Vorbereitung der FITC-Dextran-Lösung.<ol>
<li>Mischen Sie 1 mg FITC-Dextran-Pulver (150 K) pro 1 mL der Nährmedien (siehe Schritt 1.1.1). Bereiten Sie eine volle gekammerten Deckglas 3 mL.</li>
		<li>Mit einer Cellulose-Acetat-Spritze-Filtereinheit mit 0,22 µm Porengröße, Filtern Sie die gelösten FITC-Dextran.</li>
		<li>Eine Konzentration von 1 µg/mL Maus IgE hinzufügen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aussaat von RBL-Zellen für die Bildgebung<ol>
<li>Am Vortag Bildgebung, Aspirieren Sie die Medien aus der Kulturschale und ersetzen mit 2 mL Trypsine/EDTA Lösung B. Incubate für 5-10 Minuten in eine feuchte Atmosphäre 5 % CO2 bei 37 ° C. Sobald die Zellen getrennt haben, neutralisieren Sie die Trypsin durch Zugabe von 2 mL Nährmedien.</li>
		<li>Graf RBL Zellen mit einem Hemocytometer und stellen Sie die Lautstärke entsprechend mit Nährmedien Zellkonzentration von 7,5 x 105/mL erhalten.</li>
		<li>Fügen Sie 10 µL Zellsuspension auf einer gekammerten Deckglas vorausgefüllt mit frischen FITC-Dextran Nährmedien ergänzt (Dies führt Aussaat von 7,5 x 103 Zellen in einer Kammer).</li>
		<li>Zellen Sie RBL über Nacht in einer humifizierten Atmosphäre des 5 % CO2 bei 37 ° C. Die Zellen sollte in einer Sub-konfluierende Ebene bleiben, um sicherzustellen, dass die Zellen voneinander getrennt sind und dass es einfach ist, jede Zelle einzeln unter dem Mikroskop zu erkennen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transfektion von Zellen RBL - optional.<ol>
<li>Exocytic Veranstaltungen in Kombination mit anderen eindringmittel tagged Proteinen imaging, finden Sie unter Transfektion Protokoll für RBL Zellen in Azouz Et al. 67
</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. live Cell Mikroskopie der Exozytose
<ol><li>Vorbereitung der Lösungen:<ol>
<li>Bereiten Sie eine endgültige Tyrode-Pufferlösung durch Verdünnung der Stammlösung in DDW in einem 01:20 Verdünnung und Ergänzung mit 20 mM Hepes pH 7, 1,8 mM CaCl2, 1 mg/mL BSA und 5,6 mM Glukose.</li>
		<li>Frisch zubereiten ein 20 X sekretagog Reagenz in Tyrode Puffer [1 µg/mL Dinitrophenyl konjugiert, menschliches Serumalbumin (DNP-hat (Ag)) in unserem Fall für eine 50 ng/mL 1 X Konzentration].</li>
		<li>Bereiten Sie eine 400 mM-Ammoniumchlorid-Lösung durch Auflösen von Pulver in Tyrode Puffer.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Vorbereitung der Zellen.<ol>
<li>Waschen Sie die gekammerten Deckglas 3 Mal durch Absaugen der Medien aus der Kammer und Befüllen es mit 300 µL Tyrode Puffer, auf 37 ° c vorgewärmt Schließlich ergänzen Sie die Kammer mit 300 µL Tyrode Puffer, auf 37 ° c vorgewärmt</li>
		<li>Legen Sie die gekammerten Deckglas in das Mikroskop Inkubator Kammer. Stellen Sie sicher, dass die Kammer stabil ist.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Aufbau des Mikroskops<ol>
<li>Wählen Sie eine Region von Interesse zu verfolgen, schalten Sie die fluoreszierenden Lichtquelle (traditionell einer Quecksilber-Lampe) und wählen Sie den entsprechenden Fluoreszenz-Filter (Wählen Sie den Filter für grüne Fluorophore für die Anzeige von FITC-Dextran). Die Region von Interesse steht im Mittelpunkt und ist in der Mitte das Sichtfeld, Ausschalten der Lichtquelle um Foto-Bleichen und Toxizität zu vermeiden. Hinweis: Einige der FITC-Dextran, integriert in den Zellen kann Fluoreszenz behalten. Und zwar deshalb, weil FITC-Dextran auch auf nicht-lysosomale Fächer wie Endosomen sortiert werden kann.</li>
		<li>Aktivieren Sie die entsprechende Beleuchtung für FITC Erregung. Wenn ein Laser-basierten Mikroskop verwenden, schalten Sie den 488 nm-Laser. Emission sollte gesammelt werden, um 500-550 nm (FITC Emission Peaks bei 510-520 nm).</li>
		<li>Wenn ein confocal Mikroskop verwenden, öffnen Sie das Loch bis zum Maximum. Dadurch kann mit geringer Laserleistung, Bleichen zu vermeiden und Toxizität und sorgt für die Erfassung von Exozytose Ereignisse aus allen Ebenen der Zelle.</li>
		<li>Kalibrieren Sie das Zeitintervall zwischen Bild übernahmen.<ol>
<li>Verschiedene Zellen variieren in ihrer Kinetik der regulierten Exozytose68. Für spezielle Aufnahmen von zusammengesetzten Exozytose empfehlen wir einen zeitlichen Abstand von mindestens 5 Sekunden. Jedoch als eine Faustregel, um schnelle Bildgebung zu ermöglichen, stellen Sie sicher, dass die Übernahme eines einzelnen Frames schnell ist.</li>
			<li>Bei der Verwendung von konfokale Laserscanning-Mikroskop legen Sie die Scan-Richtung auf Bi-direktionale, nicht erlauben für die Mittelung und 512 x 512 Auflösung festgesetzt (empfohlen, die letzteren beiden Bestimmungen hilft auch, um Bleichen und Toxizität zu minimieren).</li>
		</ol>
</li>
	</ol>
</li>
	<li>Bildgebung der Exozytose.<ol>
<li>Zellen für die gewünschte Dauer, je nach der Art der Zelle oder sekretagogum. Im RBL Zellen mit IgE/Ag ausgelöst treten die meisten Exocytic Ereignisse innerhalb von 15-20 min der Aktivierung.</li>
		<li>Für die Aktivierung der Zellen hinzufügen der Kammers 16 µL aus den 20 x sekretagog Lösung.</li>
	</ol>
</li>
	<li>FITC-Dextran-Präsenz in den Zellen zu bestätigen.<ol>
<li>Um das Vorhandensein und die Lokalisierung der FITC-Dextran, die SGs zu bestätigen, hinzufügen 16 µL Ammoniumchlorid-Lösung (darauf achten, nicht zu die Kammer um nicht den Fokus verlieren zu bewegen) an die Kammer vorsichtig (damit wird eine Endkonzentration von 20 mM). Dies wird induzieren Alkalisierung des SGs und dequenching der FITC Fluoreszenz, die innerhalb von Sekunden auftreten wird.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen

Hier beschreiben wir wie Tracing die Fluoreszenz der FITC-Dextran in SGs geladen verwendet werden kann um speziell zusammengesetzte Exozytose Ereignisse zu erfassen. Dies wurde erreicht durch das Mikroskop, alle 15 Sekunden ein Bild zu erwerben, damit nur lang andauernde Ereignisse im Laufe der Zeit aufgezeichnet werden und daher ohne kurze Ereignisse, die volle Exozytose oder Kiss-and-Run Exozytose entsprechen würde. Um die Methode zu etablieren, haben wir gezeigt, dass Knockdown von Rab5-Isoformen, die sind in RBL Zell...

Regulierten Exozytose ist der primäre Mechanismus durch die leicht gemachte Cargo von sekretorischen Zellen als Reaktion auf einen bestimmten Auslöser freigegeben wird. Die Ladung ist vorgeformt und abgesondert in sekretorischen Vesikel, in denen es gespeichert wird, bis ein Auslöser das Signal für die Veröffentlichung von Inhalten der SGs überträgt. Verschiedene Arten von Signalen können in verschiedenen Modi der regulierten Exozytose, oder verschiedene Modi der regulierten Exozytose können gleichzeitig auftreten. Drei Hauptmodi des regulierten Exozytose sind bekannt: volle Exozytose, einhergehende vollständige Verschmelzung von einem einzigen sekretorischen Granulat mit der Plasmamembran; Kiss-and-Run Exozytose, die vorübergehende Verschmelzung von sekretorischen Granulat mit der Plasmamembran, gefolgt von seiner Wiederverwertung beinhaltet; und zusammengesetzte Exozytose, charakterisiert durch homotypische Verschmelzung von mehreren SGs vor (d.h. multigranular Exozytose) oder sequenziell (d.h., sequentielle Exozytose) zur Fusion mit der Plasmamembran1. Zusammengesetzte Exozytose den umfangreichsten Modus der Fracht Release2, gilt als es die schnelle Sekretion von Fracht ermöglicht, einschließlich von SGs, die sich distal von der Plasmamembran. Zusammengesetzte Exozytose ist dokumentiert worden, in beiden exokrinen und endokrinen Zellen3,4,5,6,7,8,9, sowie in Immunzellen. In Immunzellen, wie eosinophile10,11,12 und neutrophile13ermöglicht zusammengesetzte Exozytose die schnelle und robuste Freisetzung von Mediatoren, die eindringende Krankheitserreger wie töten müssen Bakterien oder Parasiten. Mastzellen (MCs) bereitstellen zusammengesetzte Exozytose für die effiziente Freisetzung von Entzündungsmediatoren vorgespeicherten während der angeborenen Immunantwort, Anaphylaxie und andere allergische Reaktionen14,15,16 , 17. da die verschiedenen Modi der Exozytose18,19gleichzeitig auftreten können, ist es eine Herausforderung unterschieden in Echtzeit oder zu identifizieren, ihre jeweiligen Fusion Maschinen, daher verdeutlichend geworden die zugrunde liegenden Mechanismen.
Hier präsentieren wir Ihnen eine Methode, basierend auf live Cell Imaging Zelle geladen FITC-Dextran, das Echtzeit-Tracking der Exocytic Ereignisse und die Unterscheidung zwischen den verschiedenen Modi erlaubt. Unsere Methode ermöglicht insbesondere, exklusive Überwachung der zusammengesetzten Exozytose.
FITC-Dextran ist ein Konjugat pH-Sensitive Fluorophor FITC mit Glucan Polysaccharid Dextran. Eindringmittel beschrifteten Dextrans nachweislich in die Zelle eindringen von Micropinocytosis20,21 und Macropinocytosis22,23. Als endocytic Fächer in Lysosomen Reifen, hat sich gezeigt, dass FITC-Dextran sammelt sich in den Lysosomen mit keine offensichtliche Verschlechterung. Jedoch da FITC ein hochsensibler pH Fluorophor-24 istund das Lysosomen Lumen sauer ist, stillt FITC-Dextran Fluoreszenz bei Erreichen der Lysosomen-24. So gezielt Fracht, zusammen mit der pH-Empfindlichkeit der FITC Dextrans als Lysosomen zu etablieren, haben den Grundstein für die Nutzung der FITC-Dextran in Studien der Lysosomen Exozytose25,26,27 , 28 , 29.
In mehreren Zelltypen, einschließlich MCs, neutrophile, eosinophile, zytotoxischen T-Zellen, Melanosomen und andere die SGs lysosomale Anzeigefunktionen und gelten als Lysosomen-bezogene Organellen (LROs) oder sekretorische Lysosomen30,31 . Da LROs einen sauren luminalen pH haben, kann FITC-Dextran verwendet werden, ihre Exozytose, als Folge der höheren pH-Wert, verbunden mit der Auslagerung der LROs zu visualisieren. In der Tat, FITC-Dextran wurde zur Exozytose MCs18,32,33zu überwachen. Bei dieser Methode ist FITC-Dextran hinzugefügt, um die Zellkultur, durch Pinocytose von den Zellen aufgenommen und in die SGs sortiert. Wie es in Lysosomen, wird FITC Fluoreszenz in der SGs abgeschreckt, wenn sie innerhalb der Zelle sind. Allerdings gewinnt bei SG Fusion mit der Plasmamembran und konsequente Exposition gegenüber dem äußeren Milieu, FITC-Dextran seine Fluoreszenz steigendem pH-Wert SG ermöglicht die einfache Verfolgung von Exocytic Veranstaltungen live Zelle Mikroskopie. Hier haben wir diese Methode, um einzigartige Tracking von zusammengesetzten Exozytose ermöglichen angepasst.
Zwei andere Methoden haben zuvor verwendet worden, um zusammengesetzte Exozytose zu verfolgen. Elektronenmikroskopie war die erste Methode zur Charakterisierung von Exocytic Strukturen, die das Auftreten von verschiedenen Modi der Exozytose vorgeschlagen. Insbesondere führte zu der Hypothese des zusammengesetzten Exozytose Beobachtungen "sekretorischen Tunnel" in pankreatischen acinar Zellen34 und MCs35,36,37 . Jedoch während die hochauflösende Elektronenmikroskopie verschmolzenen Vesikel offenbaren kann, kann nicht verfolgen die Dynamik ihrer Fusion und daher kann nicht festlegen, ob sie SG Fusion bei zusammengesetzten Exozytose oder Verschmelzung von zurückeroberten Granulat entsprechen nach ihrer Endozytose. Dieses Hindernis ist in anderen Methoden überwinden, die Exozytose in lebenden Zellen, wie z. B. Patch Clamp-Messungen der Plasmamembran Kapazität11,13,38,39 oder strommesstechnik messen können 40 der Medien. Allerdings spannen Patch erfordert eine spezielle Set-up und möglicherweise nicht geeignet für alle Zelltypen. Strommesstechnik Messungen sind in der Lage, Exozytose zu verfolgen, nur dann, wenn die Ladung in unmittelbarer Nähe an der Elektrode freigegeben wird. Mit live Cell Imaging bietet daher einen Vorteil gegenüber diesen Methoden, da es nicht nur Echtzeit-Tracking der Exozytose ermöglicht, sondern es auch schnelle und einfache Erfassung von Daten aus der gesamten Zelle erlaubt.
Das Tracking der FITC-Dextran live Zelle Mikroskopie bietet auch einige Vorteile zu anderen live Cell Imaging-basierte Methoden. Zum Beispiel ist eine weit verbreitete Methode Totalreflexion Fluoreszenz-Mikroskopie (TIRFM) der Zellen geladen mit einer fluoreszierenden SG-Sonde oder mit dem Ausdruck eine fluoreszierende Protein markiert SG Fracht oder Membran Protein26,41, 42 , 43. die Stärke dieser Methode liegt in seiner Fähigkeit, ausschließlich Ereignisse zu überwachen, die auftreten, in der Nähe der Plasmamembran (hier "Fußabdruck" bezeichnet), daher Exocytic Veranstaltungen. Dies ist jedoch auch der Nachteil dieser Methode, da nur die Zelle Teil, die grenzt an das Deckglas und nah an den Mikroskop-Objektiv kann44abgebildet. Ob solche Fußabdrücke in der Tat die gesamte Zelle Membranoberfläche darstellen ist noch fraglich45,46,47. In dieser Hinsicht ermöglicht die Verwendung eines pH-sensitiven Farbstoffs wie FITC-Dextran und ein standard Fluoreszenzmikroskop oder ein confocal Mikroskop mit einer offenen Lochkamera Bildgebung der ganzen Zelle, so erfassen die totale Exocytic Ereignisse, die in dieser Zelle auftreten.
Weitere pH-Sensitive-Reporter, die verwendet werden, um regulierte Exozytose studieren durch ganze Zelle Bildgebung oder TIRFM gehören SG Fracht oder SG Membranprotein verschmolzen, Phlourin, eine pH-Sensitive-GFP-Variante. Beispiele sind NPY - Phlourin-, β-Hexoseaminidase-Phlourin und Synapto-Phluorin48,49,50,51,52. Während Ausdruck dieser Sonden die endogene Zusammensetzung des SGs genauer darstellen kann, es beinhaltet Transfektion von Zellen, und kann daher für die Zellen, die schwer zu transfizieren sind weniger geeignet. Daher, wenn Studium Zellen sind schwer zu transfizieren oder unter experimentellen Bedingungen, die mehrere genomische Manipulationen erfordern die Verwendung einer Verbindung, die einfach in das Zellkulturmedium wie FITC-Dextran, ergänzt werden kann ist vorteilhaft . FITC-Dextran bietet auch einen Vorteil gegenüber Acridin orange (AO), ein anderer pH-Sensitive-Farbstoff, der für die Verfolgung von Exozytose von live Zelle Mikroskopie53,54,55,56 verwendet wurde , 57 , 58. AO hat gezeigt, dass die Photolyse von Vesikeln zu induzieren, dass führen zu falschen Blitze, die nicht zum eigentlichen Sekretion entsprechen27verarbeitet. Im Gegensatz dazu reflektiert FITC-Dextran bessere Sekretion Veranstaltungen, wahrscheinlich aufgrund seiner geringen Foto-induzierte Produktion von reaktiven Sauerstoff-27.
Bemerkenswert ist ein alternativer Ansatz für das Studium Exozytose durch die Verfolgung des Zustroms von ein Farbstoff aus dem externen Medium in der SG durch die Fusion Pore, die während dieses Prozesses wird geöffnet. In diesem Fall wird der Farbstoff auf das externe Medium neben der sekretorischen Trigger hinzugefügt. Dann, wenn die Fusion Pore geöffnet wird, diffundiert der Farbstoff in der SG59,60. Ein klarer Vorteil dieser Methode ist, dass es auch die Möglichkeit bietet, die Fusion Porengröße, durch den Einsatz von Farbstoffen von variabler Größe zu schätzen. Beispielsweise können Dextrans von unterschiedlichem Molekulargewicht (MW), konjugiert zu verschiedenen Fluorophore, als extrazelluläre Farbstoffe verwendet werden wobei die maximale Größe der Dextran, die die SG durchdringen kann die Größe der Fusion Pore59, entsprechen würde 61 , 62 , 63 , 64. Darüber hinaus ist dieser Ansatz nicht erfordern den Einsatz einer pH-Sensitive-Sonde. Ein wesentlicher Nachteil ist jedoch, dass das Signal-Rausch-Verhältnis sehr gering ist, da eine große Menge an Farbstoff während der Aufnahme von Bildern, was zu hohen Hintergrund in den Medien präsent ist.
Die Verwendung von FITC-Dextran als ein Marker für die Exozytose überwindet insgesamt mehrere Nachteile in zuvor gemeldeten Methoden wie Signal-Rausch-Verhältnis, Toxizität, dynamische Tracking und Komplexität.
Hier beschreiben wir die Verwendung von FITC-Dextran, zusammengesetzte Exozytose in der RBL - 2 H-3 Mast Zell-Linie (hier bezeichnet als RBL, in erster Linie festgelegten Eccleston Et Al. zu überwachen 65 und weitere geklont von Barsumian Et Al. ( 66), als Reaktion auf Immunglobulin E (IgE) / Antigen (Ag) Aktivierung.

<table><tbody><tr><td>DMEM niedrige Glukose</td><td>Biologische Induktionen</td><td>01-050-1A</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Gibco</td><td>12657</td><td></td></tr><tr><td>Pen-Streptokokken-Nystatin-Lösung</td><td>Biologische Induktionen</td><td>03-032-1B</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamin 200 mM Lösung&nbsp;</td><td>Biologische Induktien</td><td>03-020-1A</td><td></td></tr><tr><td>FITC Dextran 150K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46946-500MG-F</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA Lösung B</td><td>Biologische Induktien</td><td>03-052-1A</td><td>Warm in 37 & Grad; C Wasserbad vor Gebrauch</td></tr><tr><td>Obervakuumfilter von 0,22 & Mikro; M Porengröße&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430769-1EA</td><td></td></tr><tr><td>Spritzenvorsatz-Filtereinheit aus Celluloseacetat, 0,22 & Mikro; m Porengröße</td><td>Sartorius</td><td>16534K</td><td></td></tr><tr><td>Kammer-Deckglas&nbsp;</td><td>Thermo scientific</td><td>155411</td><td></td></tr><tr><td>Corning mit Gewebekulturen behandelte Kulturschalen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS430167</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbumin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503</td><td></td></tr><tr><td>Monoklonales Anti-DNP-IgE</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8406</td><td></td></tr><tr><td>DNP-HSA (Ag)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6661&nbsp;</td><td>Vermeiden Sie direkte Lichteinwirkung</td></tr><tr><td>Hepes-Puffer 1M, pH 7,4</td><td>Biologische Induktionen</td><td>03-025-1B</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>MERK</td><td>102382</td><td></td></tr><tr><td>Glukose</td><td>BDH Laboratorien</td><td>284515V</td><td></td></tr><tr><td>Ammoniumchlorid</td><td>MERK</td><td>1145</td><td></td></tr><tr><td>PIPES Dikaliumsalz</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>108321-27-3</td><td></td></tr><tr><td>Calciumacetathydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>114460-21-8</td><td></td></tr><tr><td>Magnesiumacetat-Tetrahydrat</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td></td></tr><tr><td>Kaliumglutamat (L-Glutaminsäure-Kaliumsalz-Monohydrat)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4</td><td>MERK</td><td>6346</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>MERK</td><td>106404</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>MERK</td><td>105833</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MERK</td><td>104936</td><td></td></tr><tr><td>Elektroporator&nbsp;</td><td>BTX</td><td>ECM830</td><td></td></tr><tr><td>Konfokales Mikroskop, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 5 Pascal, Axiovert 200M</td><td>In Abbildung 3 verwendet. Ausgestattet mit einem elektronischen temperaturgesteuerten Luftstrom-Inkubator</td></tr><tr><td>Konfokalmikroskop, Zeiss</td><td>Zeiss</td><td>LSM 800, Axio Observer.Z1 /7</td><td>in Abbildung 2. Ausgestattet mit einem GaAsP-Detektor, einem elektronischen temperaturgesteuerten Luftstrom-Inkubator</td></tr><tr><td>, Konfokalmikroskop, Leica</td><td>Leica</td><td>SP5</td><td>(siehe Abbildung 1). Ausgestattet mit einem Leica HyD-Detektor und einem Top-Stage-Inkubator (Okolab)</td></tr><tr><td>RBL-2H3-Zellen</td> wurden RBL-2H3-Zellen <td></td><td></td><td>im Labor von Reuben P. Siraganian kloniert. Siehe Referenz 67</td></tr></tbody></table>

imaging-fitc-dextran als reporter für regulierte exozytose

Imaging FITC-dextran as a Reporter for Regulated Exocytosis

Regulierten Exozytose ist ein Prozess, der durch den Ladung, die in sekretorischen Granulat (SGs) gespeichert ist, als Reaktion auf einen sekretorischen Auslöser freigegeben wird. Regulierten Exozytose ist von grundlegender Bedeutung für die interzelluläre Kommunikation und ist ein wichtiges Instrument für die Sekretion von Neurotransmitter, Hormone, Entzündungsmediatoren und andere Verbindungen, durch eine Vielzahl von Zellen. Mindestens drei verschiedene Mechanismen sind bekannt für regulierte Exozytose: volle Exozytose, wo ein einziges SG voll mit der Plasmamembran, Kiss-and-Run Exozytose verschmilzt, wo ein einziges SG vorübergehend mit der Plasmamembran verschmilzt, und zusammengesetzte Exozytose, wo mehreren SGs verschmelzen miteinander, vor oder nach SG-Fusion mit der Plasmamembran. Die Art der regulierten Exozytose durchgeführt von einer Zelle wird häufig durch die Art der sekretorischen Trigger vorgeschrieben. Jedoch kann in vielen Zellen, sekretorische einabzug mehrere Modi der regulierten Exozytose gleichzeitig aktivieren. Trotz ihrer Fülle und Bedeutung über Zelle Arten und Arten sind die Mechanismen, die die verschiedenen Modi der Sekretion bestimmen weitgehend ungelöst. Eine der größten Herausforderungen bei der Untersuchung der verschiedenen Verkehrsträger regulierten Exozytose ist die Schwierigkeit bei der Unterscheidung zwischen ihnen, als auch separat zu erkunden. Hier beschreiben wir die Verwendung von Fluorescein erfolgt (FITC)-Dextran als Exozytose Reporter und live Cell imaging, um zu unterscheiden, die verschiedene Wege der regulierten Exozytose, mit Schwerpunkt auf zusammengesetzte Exozytose, basierend auf die Robustheit und Dauer der Exocytic Ereignisse.

Abbildung 1a stellt schematisch wie FITC-Dextran als Reporter tätig werden kann für die Exozytose reguliert und die verschiedenen Modi der Exocytic Ereignisse zu rekapitulieren. Erstens sind Zellen mit FITC-Dextran, inkubiert, die durch Pinocytose verinnerlicht und sortiert die SGs. Da die SGs MCs LROs sind, ihre niedrige pH-Wert dämpft die Fluoreszenz der FITC, hier gezeigten Schwarz Granulat (A-C, ich). Wenn Zellen durch eine sekretagog und SGs verschmelzen...

Hier zeigen wir eine Methode für das live Cell Imaging von regulierten Exozytose. Diese Methode nutzt FITC-Dextran, die reichert sich in Lysosomen-bezogene Organellen, als Reporter. Diese einfache Methode ermöglicht auch die Unterscheidung zwischen verschiedenen Modi der regulierten Exozytose in Zellen, die schwer zu genetisch zu manipulieren sind.

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

Regulated exocytosis is a process by which cargo, which is stored in secretory granules (SGs), is released in response to a secretory trigger. Regulated ...

Diese Methode kann dazu beitragen, Schlüsselfragen in der Erforschung der regulierten Exozytose zu beantworten, indem sie es den Forschern ermöglicht, zwischen den verschiedenen Arten der Exozytose in der lebenden Zelle zu unterscheiden. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass sie einfach ist und nur minimale Störungen für die Zellen erfordert. Obwohl diese Methode Einblicke in die Exozytose von Mastzellen geben kann, kann sie auch auf andere sekretorische Zellen wie Neutrophile und Eosinophile angewendet werden.Bereiten Sie zunächst eine Stammlösung von 20x Tyrode-Puffer gemäß dem Textprotokoll vor. Mischen Sie anschließend drei Milligramm FITC-Dextran-Pulver mit drei Millilitern Nährmedium. Filtrieren Sie das gelöste FITC-Dextan mit einer Celluloseacetat-Spritzenfiltereinheit.Fügen Sie dann Maus-IgE in einer Konzentration von einem Mikrogramm pro Milliliter hinzu. Einen Tag vor der Bildgebung aspirieren Sie das Medium aus einer Kulturschale und ersetzen Sie es durch zwei Milliliter Trypsin EDTA-Lösung B. Inkubieren Sie die Schale dann fünf bis 10 Minuten lang. Sobald sich die Zellen abgelöst haben, geben Sie zwei Milliliter Nährmedium in die Schale, um das Trypsin zu neutralisieren.Verwenden Sie dann ein Hämozytometer, um die RBL-Zellen zu zählen. Passen Sie das Volumen der Suspension mit Nährmedien an, um eine Konzentration von 750.000 Zellen pro Milliliter zu erreichen. Geben Sie anschließend 10 Mikroliter der Zellsuspension in ein gekammertes Deckglas mit frischem FITC-Dextran-supplementiertem Kulturmedium und züchten Sie die RBL-Zellen über Nacht.Bereiten Sie zunächst eine endgültige Tyrode-Pufferlösung gemäß dem Textprotokoll vor. Bereiten Sie dann ein 20-faches Sekretagogenreagenz in dem frisch hergestellten Puffer vor. Ammoniumchloridpulver in Tyrodes Puffer auflösen, um eine 400 Millimolare Ammoniumchloridlösung zu erhalten.Saugen Sie dann das Medium aus dem gekammerten Deckglas an und ersetzen Sie es durch 300 Mikroliter vorgewärmten Tyrode-Puffer. Nachdem Sie den Waschvorgang zweimal wiederholt haben, füllen Sie die Kammer mit 300 Mikrolitern Tyrode-Puffer auf. Platzieren Sie anschließend das Deckglas in der Inkubatorkammer eines Mikroskops und stellen Sie sicher, dass die Kammer stabil ist.Schalten Sie die Leuchtstoffröhre ein und wählen Sie den passenden Fluoreszenzfilter aus. Sobald der interessierende Bereich scharf ist, schalten Sie in der Mitte des Sichtfelds die Lichtquelle aus. Schalten Sie dann den 488-Nanometer-Laser ein, wobei die Emission etwa 500 bis 550 Nanometer beträgt.Kalibrieren Sie als Nächstes das Zeitintervall zwischen den Bildaufnahmen. Stellen Sie die Scanrichtung auf bidirektional ein, lassen Sie keine Mittelwertbildung zu, öffnen Sie die Lochblende, und stellen Sie die Auflösung auf 512 x 512 ein. Als nächstes bilden Sie die Zellen für die für den jeweiligen Zelltyp oder Sekretagoge geeignete Dauer ab.Geben Sie dann 16 Mikroliter aus der Sekretagogenlösung in die Kammer und fahren Sie mit dem Filmen fort. Um schließlich das Vorhandensein und die Lokalisation von FITC-Dextran im sekretorischen Granulat zu bestätigen, geben Sie vorsichtig 16 Mikroliter Ammoniumchloridlösung in die Kammer. In diesem Protokoll wurde FITC-Dextran als Reporter für die Lebendzellbildgebung der regulierten Exozytose verwendet.Die bildgebende FITC-Dextran-Freisetzung ermöglicht die Erfassung der sequentiellen Natur der Exozytose von Verbindungen. Nach der Zugabe von Ammoniumchlorid zu den Medien wird FITC-Dextran sichtbar und wird mit dem mRFP-markierten Neuropeptid Y als sekretorischer granulärer Reporter in RBL-Zellen colokalisiert. Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die Toxizität für die Zellen während des Filmens zu minimieren, indem die Exposition der Zellen gegenüber dem Laser minimiert wird.Dies kann durch die geringe Laserleistung und die kurze Erfassungszeit erreicht werden. Da exozytotische Ereignisse im Vergleich zu anderen regulierten exozytären Ereignissen länger leben, können wir die Exozytose von Verbindungen kategorisch erfassen, indem wir ein langes Zeitintervall zwischen den Akquisitionen festlegen.

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Research

Forschung

JoVE Journal

Biology

Biologie

In diesem Video zeigen wir, wie Label und visualisieren einzelne synaptische Vesikel Exozytose und Menschenhandel in Goldfische Netzhaut bipolaren Zellen mit insgesamt internen Reflexion Fluoreszenz (TIRF)-Mikroskopie.

Imaging Exocytose in Retinal bipolaren Zellen mit TIRF-Mikroskopie

Dieses Video zeigt eine Technik zur Visualisierung von Exozytose in Mastzellen. Die Zellen werden mit FITC-Dextran – einem fluoreszierenden Reporter – inkubiert, das von Zellen in sekretorischen Granulaten (SGs) aufgenommen wird, wo der saure pH-Wert seine Fluoreszenz löscht. Bei Stimulation der Granula-Exozytose induziert der höhere pH-Wert des Mediums eine Reporterfluoreszenz innerhalb der fusionierten SGs, die mit einem Fluoreszenzmikroskop sichtbar gemacht wird.

Eine in vitro Technik zur Visualisierung der Exozytose von sekretorischen Granula in Mastzellen

Polarisation-basierte Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy (pTIRFM) ermöglicht die Echtzeit-Erkennung von Zellmembrandynamik. Dieser Artikel beschreibt die Umsetzung der pTIRFM für das Studium der Membran Umbau während regulierten Exozytose. Die Technik ist generalisierbar auf andere Prozesse in der Zellbiologie, die Veränderungen in Membranform, die direkt oder indirekt beteiligen.

Imaging Plasmamembran Verformungen Mit pTIRFM

Clathrin-vermittelte Endozytose, ein schneller und hochdynamischer Prozess, der viele Proteine, einschließlich Signalrezeptoren, internalisiert. Das hier beschriebene Protokoll visualisiert direkt die Kinetik einzelner endozytärer Ereignisse. Dies ist wichtig, um zu verstehen, wie die Kernmitglieder der endozytischen Maschinerie miteinander harmonieren und wie die Proteinfracht diesen Prozess beeinflusst.

Visualisierung Clathrin-vermittelte Endozytose von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren an Einzelereignis Resolution über TIRF-Mikroskopie

Diese Arbeit stellt eine Methode zur Untersuchung der Vesikeldynamik von Neurotransmittern in Neuroblastomzellen unter Verwendung eines Synaptobrevin2-pHluorin-Konstrukts und Totalreflexionsfluoreszenzmikroskopie vor. Auch über die entwickelte Strategie für die Bildverarbeitung und Datenanalyse wird berichtet.

TIRFM und pH-sensitive GFP-Sonden an Neurotransmitter-Vesikel-Dynamics Werten in SH-SY5Y Neuroblastomzellen: Cell Imaging und Datenanalyse

Wir beschreiben, wie Proteine und zellundurchlässige kleine Moleküle in kultivierte Säugetierzellen durch ein einfaches Co-Inkubationsprotokoll mit einem Reagenz eingebracht werden können, das endozytäre Organellen undicht werden lässt.

Lieferung von Proteinen, Peptiden oder Handy-undurchlässige kleine Moleküle in lebenden Zellen durch Inkubation mit dem endosomolytische Reagenz dfTAT

Kennzeichnung für die extrazelluläre Domäne eines Membranproteins mit einem pH-empfindlichen Fluorophors, superecliptic pHluorin (SEP), erlaubt die subzelluläre Lokalisierung, Ausdruck und Handel bestimmt werden. Imaging September-markierten Proteinen mit Totalreflexions-Fluoreszenzmikroskopie (TIRFM) ermöglicht die Quantifizierung von Proteinspiegel im peripheren ER und Plasmamembran.

pHluorin-getaggt Receptors Verwendung zu überwachen subzelluläre Lokalisierung und Handel

Automatisierte Assays mit Multi-Well-Mikroplatten sind vorteilhafte Ansätze zur Identifizierung von Signalwegregulatoren, indem sie die Bewertung einer Vielzahl von Bedingungen in einem einzigen Experiment ermöglichen. Hier haben wir das etablierte Makropinosomen-Bildgebungs- und Quantifizierungsprotokoll an ein 96-Well-Mikroplattenformat angepasst und bieten einen umfassenden Überblick über die Automatisierung mit einem Multimode-Plattenleser.

Automatisierte Bildgebung und Analyse zur Quantifizierung fluoreszenzmarkierter Makropinosomen

In der vorliegenden Studie wird Fluorescein-Isothiocyanat-markiertes (FITC) Dextran Mäusen über eine orale Sonde verabreicht, um die Darmpermeabilität sowohl in vivo als auch in Plasma- und Kotproben zu bewerten. Da die Barrierefunktion des Darms bei vielen Krankheitsprozessen beeinträchtigt ist, kann dieser direkte und quantitative Assay in verschiedenen Forschungsbereichen eingesetzt werden.

Beurteilung der Integrität der Darmbarriere bei Mäusen unter Verwendung von Fluorescein-Isothiocyanat-markiertem Dextran

Die Fähigkeit, die Kinetik der Vesikelfreisetzung messen kann helfen, einen Einblick in einige der Grundlagen der Neurotransmission. Hier haben wir Echtzeit-Bildgebung von Vesikeln mit dem roten Fluoreszenzfarbstoff FM 4-64 markiert, um die Rate der präsynaptischen Vesikel Release in Hippocampus-Neuronen Kulturen zu messen.

Mess-Exocytose in Neuronen mit FM Labeling

Lernen Sie die Live-Cell-Imaging-Methode mit FITC-Dextran als Reporter zur Unterscheidung verschiedener Exozytose-Modi in Mastzellen kennen. Dieses einfache Verfahren ermöglicht die Echtzeit-Visualisierung regulierter Sekretionsprozesse mit minimaler Zellstörung.

Imaging-FITC-Dextran als Reporter für regulierte Exozytose

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